2. INNLEDNING
2.4. Fordøyelse fysiologi hos drøvtyggere
Há na Figura 2.7 o gráfico da variação de pressão (∆Pc)em função da velocidade linear da fase móvel (u0) para as quatro colunas.
Figura 2.7- Relação entre u0 e ∆Pc nas diferentes colunas
Os valores de inclinação dos gráficos, de viscosidade das fases móveis e do comprimento das colunas, utilizados para o cálculo da permeabilidade (Kv0) por meio da equação (2.8), estão relacionados na Tabela 2.4.
Tabela 2.4 - Inclinação do gráfico das retas u0x ∆Pc, viscosidade da fase móvel,
comprimento e permeabilidade das colunas
Coluna Inclinação η (Pascal.s) L (mm) Kv0 (m2)
Convencional 2 x 109 0,00074 100 3,70 x 10-14 Monolítica 2 x 109 0,00080 100 4,00 x 10-14 Núcleo Fundido 8 x 109 0,00074 100 9,25 x 10-15 Sub 2 μm 1 x 1010 0,00072 100 7,20 x 10-15 0 20000000 40000000 60000000 80000000 100000000
0.00E+00 4.00E-03 8.00E-03
∆ P c ( P as ca l) u0 (m/s) Sub 2 μm NF MN CV
Analisando-se os resultados da Tabela 2.4 verifica-se que a permeabilidade das colunas segue a seguinte ordem: Kv0 MN > Kv0 CV > Kv0 NF > Kv0 Sub2. A ordem encontrada e os valores de Kv0são similares aos descritos na literatura e podem ser explicados com base nas características de cada coluna [6, 7, 27].
A maior permeabilidade apresentada pela coluna monolítica (Kv0 = 4,00 x 10-14 m2) deve-se à estrutura de macroporos, pelos quais a fase móvel passa sem grande resistência [1]. Na literatura, Kv0 = 6,00 x 10-14 m2 [6] e Kv0 = 8,00 x 10-14 m2 [7] foram descritos para coluna a monolítica Onyx®.
Já a coluna empacotada com partícula totalmente porosa sub 2 µm foi a de menor permeabilidade (Kv0 = 7,20 x 10-15 m2). A despeito de a coluna ser totalmente porosa, o que contribuiria para aumentar permeabilidade, as partículas são muito pequenas (1,8 μm) e o que dificulta a passagem da fase móvel entre as partículas. Isso contribui para a menor permeabilidade desse tipo de coluna e explica a alta pressão que ela gera no sistema. Na literatura foram descritos valores de Kv0iguais a 6,28 x 10-15 m2 para a coluna Zorbax SB® e 4,50 x 10-15 m2 para a coluna Acquity® [27].
Por outro lado, a coluna empacotada com partículas de núcleo fundido de 2,7 μm de diâmetro apresentou permeabilidade igual a 9,25 x 10-15 m2,valor intermediário entre
as permeabilidades das colunas convencional (partícula totalmente porosa de 5 μm) e de partículas sub 2 μm (partícula totalmente porosa de 1,8 μm). A menor permeabilidade comparada à coluna convencional pode ser explicada pela estrutura parcialmente porosa e por possuir tamanho de partícula inferior (2,7 μm < 5 μm). Já a maior permeabilidade comparada à coluna de partículas sub 2 μm é explicada pelo maior tamanho de partícula (2,7 μm > 1,8 μm). Na literatura foram descritos valores de Kv0 para colunas de núcleo fundido iguais a 1,18 x 10-14 m2 (Kinetex® 2,6 μm), 1,02 x 10-14 m2 (Halo®2,7 μm) e 0,99 x 10-14 m2 (Poroshell®2,7 μm) [20].
5 CONCLUSÃO
As colunas foram caracterizadas segundo os seguintes parâmetros: volume morto, porosidade, retenção, seletividade e permeabilidade. Verificou-se que a coluna monolítica apresentou maior porosidade (83%), e consequentemente maior volume
morto, o que é justificável pela presença de uma estrutura de meso e macroporos. Já as outras três colunas apresentaram porosidades na faixa de 57% a 64%.
Constatou-se que as colunas, todas de fase ligada C18, apresentaram seletividades similares, o que permite supor que os mecanismos que governam a separação nas quatro colunas sejam similares.
A coluna monolítica apresentou a menor capacidade de retenção, em função da alta porosidade e menor interação dos analitos com a fase estacionária. Analisando-se as outras três colunas verifica-se que os fatores de retenção, apesar de maiores na coluna de partículas sub 2 μm, seguida da convencional e da empacotada com partículas de núcleo fundido, não foram muito diferentes.
O último parâmetro avaliado foi a permeabilidade (Kv0). Os valores de permeabilidade das colunas em estudo estão de acordo com os descritos na literatura e seguem a seguinte ordem: Kv0MN > Kv0CV > Kv0NF> Kv0 Sub2. É importante destacar que a permeabilidade da coluna está diretamente relacionada com a pressão que ela gera no sistema cromatográfico. Sendo assim, a menor permeabilidade da coluna empacotada com partículas sub 2 μm explica o fato de esse tipo de partícula gerar pressões na ordem de 1000 bar, justificando a necessidade do emprego de um equipamento de UHPLC. Já a maior permeabilidade das colunas monolíticas explica o fato de elas poderem ser submetidas a altos valores de vazão de fase móvel e mesmo assim poderem ser utilizadas em equipamento de HPLC que operam sob pressão máxima de 400 bar.
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CAPÍTULO 3
OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS INSTRUMENTAIS
CROMATOGRÁFICOS
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Efeitos extracoluna e a eficiência cromatográfica
Equipamentos de HPLC não são capazes de operar sob pressão superior a 400 bar, e, portanto, são inadequados para análises com colunas empacotadas com partículas com diâmetro sub 2 μm. Essa limitação levou ao desenvolvimento de sistemas de UHPLC, que suportam pressão de aproximadamente 1000 bar. Além de bombas capazes de trabalhar em pressões superiores, sistemas de injeção, detecção e tubulação foram adaptados para que a eficiência das partículas sub 2 μm fosse aproveitada e para que houvesse redução do efeito extracoluna [1].
Atualmente, além de UHPLC, outros sistemas cromatográficos são empregados para separações rápidas (em inglês Rapid Resolution Liquid Chromatography, Ultra-Fast
Liquid Chromatography, Rapid Separation Liquid Chromatography). Os
equipamentos para execução da cromatografia rápida assemelham-se aos de HPLC, que suportam até 400 bar, porém apresentam redução dos efeitos extracoluna. As técnicas de cromatografia rápida são as mais adequadas para que colunas de alta eficiência, como a empacotada com partículas de núcleo fundido e a monolítica, que não geram altas pressões, possam ser usadas com sucesso, sendo desnecessária a utilização de cromatógrafos como UHPLC [2].
Do ponto de vista estatístico, a largura do pico cromatográfico é definida por meio da variância total (2
total), que corresponde à soma da variância da coluna (2 coluna) e da variância extracoluna (2
extracoluna). Portanto, a eficiência total de uma separação decorre da coluna (eficiência intrínseca) e de aspectos extracoluna [2].
A eficiência intrínseca da coluna é matematicamente definida pela equação de Van Deemter e envolve os termos A (difusão de Eddy), B (difusão longitudinal) e C (resistência à transferência de massa) [2]. Já os aspectos extracoluna podem ser divididos em dois tipos. O primeiro é de natureza volumétrica, chamado de volume extracoluna (ECV, do inglês extra-column volume) e está relacionado aos volumes de injeção, do detector e dos tubos de conexão. O segundo refere-se a eventos de tempo, como frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector.
É importante destacar que a variância extracoluna também depende da vazão da fase móvel. O aumento da vazão, até determinado limite, contribui para o aumento da variância extracoluna. A partir da vazão na qual um fluxo turbulento é estabelecido, a variância extracoluna deixa de aumentar com a vazão. Os fatores responsáveis pelos efeitos extracoluna estão descritos na equação (3.1) e representados na Figura 3.1 [1, 2].
extracolun2 a
injetor2
det2 ector
tubo2 seconexões
eventosdea2 quisiçãodosdados (3.1)Figura 3.1- Esquema de equipamento de HPLC - em vermelho, os fatores que contribuem para o efeito extracoluna – [2]
Exemplos de volumes dos componentes típicos de equipamentos de HPLC e UHPLC estão apresentados no Quadro 3.1 [3,4].
Quadro 3.1 - Volumes dos componentes típicos de equipamentos de HPLC e UHPLC [Adaptado de 3,4]
Descrição UHPLC Acquity® UPLC HPLC Agilent® 1100
Tubo de entrada 6,3 μl 17,7 μl
Tubo de saída 2,3 μl 10,1 μl
Volume do loop 2,0 μl 10,0 μl
Assento capilar da agulha NA 3,7 μl
Célula de fluxo do detector 0,5 μl 8,0 μl
Volume extracoluna total (ECV)* 11,1μl 49,5 μl
Em um sistema bem configurado a contribuição dos processos ocorridos fora da coluna deve ser desprezível, evitando-se a redução da eficiência de separação. É desejável que a variância extracoluna seja minimizada de forma que a redução do número de pratos teóricos em consequência do efeito extracoluna não exceda 10%, ou seja, a eficiência total deve ser no mínimo 90% da capacidade da coluna. A variância extracoluna máxima aceitável é definida pela equação (3.2) [3]. O valor, em porcentagem, que a eficiência total de uma análise (estimada na presença dos efeitos extracoluna) representa em relação à eficiência da coluna, é denominado eficiência remanescente (Er) e é calculada com o auxílio da equação 3.3 [5].
N
k
Lr
c coluna ec 2 2 4 2 2 2 max)
1
(
10
,
0
10
,
0
(3.2) 2 2 . 100 total coluna r E
(3.3) 2ec max = variância extracoluna máxima aceitável, 2coluna = variância da coluna, L = comprimento da coluna, rc = raio da coluna, ε = porosidade da coluna, k = fator de retenção do analito, N = número de pratos teóricos, Er = eficiência remanescente, 2
total= variância total
Analisando a equação (3.2), percebe-se que para colunas com menor raio (menor rc) e mais curtas (menor L) a variância máxima aceitável é menor e, portanto, essas colunas são mais susceptíveis aos efeitos extracoluna. O mesmo raciocínio se aplica àquelas colunas empacotadas com partículas porosas sub 2 μm e de núcleo fundido, que apresentam maior eficiência (maior N). Além disso, a equação (3.2) indica que para analitos menos retidos (menor k) a variância extracoluna máxima aceitável é menor do que para os analitos mais retidos.
A estimativa da 2
extracoluna é feita a partir de pico obtido em um sistema cromatográfico sem coluna. As condições de análise devem ser similares às que seriam utilizadas para a análise cromatográfica (mesma fase móvel, vazão, volume de injeção). Todavia, no local da coluna, deve ser utilizado um conector com volume
morto desprezível. Deve-se injetar solução contendo um dos analitos de interesse ou, alternativamente, uracila ou acetona. A partir do pico registrado calcula-se o valor de tangenciando o pico nos pontos de inflexão até a linha de base (largura entre as tangentes na linha de base = 4) ou medindo-se a largura do pico na meia altura (largura do pico na meia altura = 2,354), como demonstrado na Figura 3.2 [2,4].
Figura 3.2 - Medida da largura na linha de base (4σ) e da largura na meia altura (2,354σ) [6]
O valor de , calculado em unidade de tempo, deve ser multiplicado pela vazão, de maneira a se encontrar o valor de em unidade volumétrica. O quadrado do valor encontrado corresponde a 2
extracoluna [2,4].
Para estimar o ECV do sistema cromatográfico deve-se multiplicar 4, medido em unidade de tempo, pela vazão empregada. Esse cálculo é apenas uma estimativa, já que parte-se do princípio de que toda 2
extracoluna é advinda do ECV. De fato há também a contribuição dos eventos relacionados ao tempo, como frequência de aquisição dos dados e constante de tempo do detector. O valor real de ECV consiste na adição de todos os volumes do sistema: volumes de injeção, do tubo de PEEK do injetor a coluna, do tubo de PEEK da coluna ao detector, da célula de detecção, filtros de linha e demais conectores [4].
Há estratégias para reduzir os efeitos extracoluna de um sistema cromatográfico. A primeira delas é ajustar a condição de detecção: a constante de tempo do detector (t) deve ser suficientemente reduzida pelo fato de as larguras de base dos picos
serem estreitas (apenas poucos segundos); deve haver alta frequência de aquisição dos dados (F) para que sejam adquiridos dados suficientes em pouco tempo [7]. Em sistemas de UHPLC a frequência deve ser de no mínimo 20 Hz e a constante de tempo do detector 0,1 s [8]; em sistemas de HPLC a frequência deve ser de no mínimo 10 Hz e a constante de tempo do detector 0,3 s [7]. Outras estratégias são substituir a tubulação do equipamento por tubos de menor volume e reduzir os volumes de injeção da amostra e da cela do detector [7].
Normalmente, sistemas de HPLC apresentam variância extracoluna entre 40 e 60 μl2, enquanto que em sistemas de UHPLC a variância extracoluna encontra-se
entre 4 a 10 μl2 [4]. Embora em sistemas de UHPLC a variância extracoluna seja
reduzida, em se tratando de análise com colunas muito eficientes, pode haver perda de eficiência superior aos 10% aceitáveis [2]. Como exemplo cita-se estudo publicado em 2011, no qual foi verificada perda de 35% da eficiência em análise realizada utilizando sistema de UHPLC da Waters e coluna C18 - 50 × 2,1 mm, 1,7 μm [9]. Os resultados desse estudo confirmam que mesmo utilizando sistemas de reduzido volume extracoluna, como os de UHPLC, a perda de eficiência cromatográfica devido à variância extracoluna pode ser elevada quando colunas de alta eficiência são utilizadas.
2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Foram objetivos dessa etapa do trabalho:
1- Otimizar parâmetros instrumentais cromatográficos do equipamento de UHPLC visando à redução da variância extracoluna.
2- Investigar a influência da variância extracoluna na eficiência remanescente das colunas em estudo (convencional, sub 2 µm, núcleo fundido e monolítica), durante análise dos quatro antidiabéticos orais (clorpropamida, glibenclamida, glimepirida e gliclazida), procurando compreender como o tipo de coluna e os fatores de retenção dos analitos interferem no grau de influência da variância extracoluna na eficiência remanescente.
3- Verificar se os níveis dos parâmetros instrumentais otimizados com base na variância extracoluna (objetivo 1) são os ideais para garantir a maior eficiência remanescente durante análise dos antidiabéticos (objetivo 2).
3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais
3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos
Os mesmos descritos no capítulo 1, item 3.1.1.
3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias
Os mesmos descritos no capítulo 1, item 3.1.2.
3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas
Os mesmos descritos no capítulo1, item 3.1.3.
3.1.4 Outros materiais
Loopsde 10 μl, 5 μL e 2 μl.
Tubos de PEEK de diâmetro interno iguais a 0,004 polegada (0,1016 mm) e 0,0025 polegada (0,0635 mm) e 270 mm de comprimento.
3.2 Métodos
3.2.1 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte I: avaliação do efeito extracoluna
Os parâmetros instrumentais cromatográficos submetidos à otimização, os níveis em que foram testados, bem como o desenho experimental univariado empregado para a realização da otimização, encontram-se descritos na Tabela 3.1.
Tabela 3.1 - Experimentos de otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos
Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3
Loop PEEK F/t 2 μl 0,004 polegada 10 Hz/0,4 s = 25 5 μl 0,0025 polegada 20 Hz/0,2 s = 100 10 μl 20 Hz/0,1 s = 200 40 Hz/0,1 s = 400 40 Hz/0,025 s = 1600 Parâmetros fixos PEEK: 0,004 polegada F/t: 20 Hz/0,1 s Parâmetros fixos
Loop: Escolhido no exp. 1
F/t: 20 Hz/0,1 s
Parâmetros fixos
Loop: Escolhido no exp. 1 PEEK: Escolhido no exp. 2
Para decidir sobre o melhor nível de cada um dos parâmetros, a variância extracoluna (2
extracoluna) e o volume extracoluna (ECV) foram estimados. No local da coluna foi inserido um conector com volume morto desprezível e injetou-se solução de uracila a 10 μg/ml, em vazões crescentes (de 0,02 a 0,6 ml/min). As condições de análise desenvolvidas para determinação simultânea de antidiabéticos orais em coluna convencional, descritas no Capítulo 1, foram utilizadas (fase móvel composta de ACN:solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50), temperatura 30 oC e volume de injeção 2 μl).
Para cada valor de vazão, a solução de uracila foi injetada em triplicata e a largura na meia altura média (w0,5)dos picos registrada. Para as estimativas da σ2extracoluna e do ECV as equações (3.4), (3.5), (3.6) e (3.7) foram utilizadas [4].
3542,
5 , 0w
(3.4) 354 , 2 / 5 , 0 w
(3.5) 2 2 ) ( vazão a extracolun
(3.6)vazão
ECV
4
(3.7)w0,5= largura na meia altura, σ = desvio padrão, σ2extracoluna = variância extracoluna, ECV = volume extracoluna
3.2.2 Otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos parte II: avaliação da eficiência cromatográfica remanescente
Nessa segunda etapa loops de diferentes volumes e diferentes pares de frequência de aquisição dos dados (F) e constante de tempo do detector (t) foram avaliados. O diâmetro interno do tubo de PEEK que conecta a coluna ao detector não foi avaliado porque resultados descritos no item 4.1.2 deste capítulo demonstraram que os
PEEKs testados (0,004 e 0,0025 polegada) pouco se diferenciaram em termos de
σ2
extracoluna.
Os volumes de loop foram avaliados nas quatro colunas. Foram realizadas três injeções de solução contendo 100 μg/ml dos antidiabéticos, conforme os métodos analíticos desenvolvidos no capítulo 1 (Tabela 3.2), empregando-se loops de 2 e 10 μl. O experimento foi realizado em vazões de 0,02 a 0,6 ml/min.
Tabela 3.2 - Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes colunas*
Colunas Fase Móvel Vinj(μl) (nm) T (oC)
Convencional ACN: Solução (50:50)** 2 230 30
Monolítica ACN: Solução (43:57)** 2 230 30
Núcleo Fundido ACN: Solução (50:50)** 2 230 30
Sub 2 μm ACN: Solução (53:47)** 2 230 30 *Utilizou-se PEEK de 0,004 polegada e F/t = 40 Hz/0,0025 s
**Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0
Para cada valor de vazão, em cada um dos loops e colunas, determinou-se, para os quatro antidiabéticos, a média da largura na meia altura (w0,5). Esse valor foi utilizado para a determinação da σ2
total(equação 3.8). A σ2extracoluna, necessária para o cálculo da σ2
coluna, foi estimada em cada valor de vazão, com loops de 2 e 10 μl,
utilizando-se os métodos descritos na Tabela 3.2, substituindo-se a coluna por tubo de volume morto desprezível e injetando-se uracila (conforme descrito no item 3.2.1). Com os valores de σ2
2 5 , 0 2 354 , 2 w vazão total
(3.8) 2 2 2 a extracolun total coluna
(3.9)Em seguida, com os valores de σ2
total eσ2coluna, calculou-se a eficiência remanescente
(Er) por meio da equação 3.3 [5].
Já os parâmetros frequência de aquisição e constante de tempo do detector foram avaliados utilizando-se apenas a coluna de partículas sub 2 μm. Essa coluna foi escolhida porque, dentre as quatro em estudo, é a que, de acordo com dados da literatura, possui maior eficiência cromatográfica. Isso significa que a performance da coluna de partículas sub 2 μm é influenciada de forma mais significativa por aumentos da σ2
extracoluna advindas de mudanças em F/t. O desenho experimental incluiu a injeção em triplicata de solução de antidiabéticos orais (100 μg/ml), seguindo método analítico desenvolvido para a coluna de partículas sub 2 μm descrito na Tabela 3.2, utilizando-se loops de 2 μl e PEEK de 0,004 di. Os seguintes pares de F/t foram avaliados: 10 Hz/0,4 s , 20 Hz/0,2 s, 20 Hz/0,1 s, 40 Hz/0,1 s e 40 Hz/0,025 s. O experimento foi realizado nas vazões de 0,15 ml/min e 0,6 ml/min. Para cada valor de vazão e par de F/t determinou-se a média da largura na meia altura (w0,5), a σ2total (equação 3.8) e a σ2coluna (equação 3.9), para os quatro antidiabéticos. A σ2
extracoluna, necessária para o cálculo da σ2coluna, foi estimada conforme procedimento descrito no item 3.2.1, nas vazões de 0,15 e 0,6 ml/min, em todos os pares F/t. Em seguida, com os valores de σ2