por cinco minutos em repouso, antes da contagem dos espermatozóides. Durante este período, realizava-se avaliação da motilidade total (%) e do vigor (0-5) ao microscópio óptico, com aumento de 100 e 400 vezes, utilizando-se uma gota de sêmen a fresco, colocada entre lâmina e lamínula, previamente aquecidas a 35ºC em placa aquecedora. A seguir, a concentração era calculada contando–se as células espermáticas, nos dois lados da câmara de neubauer, em microscopia óptica com aumento de 400 vezes. Quando a diferença entre as duas contagens ultrapassava os 10%, o exame era refeito. O valor médio das duas contagens era multiplicado por 5 x 106, para obter-se o número de espermatozóides/mL do ejaculado.
Com a concentração obtida, cálculos eram feitos em ficha própria (Anexo – Figura 7.c) para se determinar o volume da dose inseminante, contendo concentração fixa de 400 milhões de espermatozóides móveis. Assim, no banho maria a 37ºC, ficavam duas mamadeiras tampadas, cada qual com a dose total de diluidor puro, de cada tratamento. Com pipeta graduada era retirada, de cada mamadeira, a quantidade de sêmen a ser incorporado. O tempo até a diluição era então anotado, sendo registrados, nesse momento, a motilidade (0-100%) e vigor (0-5) do sêmen após a diluição. Amostras para morfologia eram retiradas do sêmen a fresco, diluído e após resfriamento, sendo devidamente acondicionadas em ependorffs contendo uma solução de formol salina tamponada para, posteriormente, serem avaliadas em microscopia de contraste de fase com aumento de 1000 vezes. No Experimento I, as doses eram preparadas e utilizadas imediatamente para as inseminações. Entretanto, no Experimento II, o sêmen era resfriado a 5ºC para ser utilizado nas inseminações após 12 horas de armazenamento, em contêiner apropriado (Palhares, 1997; fig. 3.10).
3.2.7. Resfriamento e Inseminação Artificial Apenas para o Experimento II, após a diluição final, as doses inseminantes eram envasadas individualmente em tubos de vidro (fig. 3.10.a), com capacidade de 22 mL. Os tubos eram preenchidos por completo, de forma a eliminar o ar residual, para então serem selados com filme
de PVC9 (fig. 3.10.b). O contêiner (Palhares, 1997), depois de encaixados os tubos (fig. 3.10.c), recebia o centro refrigerador (fig. 3.10.d) sendo, então, imediatamente fechado (fig. 3.10.f), anotando-se o horário. Na tampa, colocava-se uma fita com o nome do reprodutor referente àquele contêiner, exclusivo para cada macho, que permanecia no laboratório, fechado, até o momento da inseminação.
Para que não houvesse riscos de trocas indevidas de fêmeas entre jumentos e tratamentos, as éguas a serem inseminadas eram separadas, inicialmente, por lotes de acordo com o jumento a ser utilizado. Além disso, para a sua entrada no tronco, controlada por uma lista, considerava-se o tratamento ao qual pertenciam, sendo primeiro inseminadas as éguas de um tratamento e, posteriormente, as do outro tratamento.
Antes das inseminações, realizava-se a higienização da região perineal de cada égua, com água e sabão de côco, seguida de secagem com papel toalha. As luvas a serem utilizadas na inseminação eram armazenadas em uma caixa, na qual colocava-se pastilhas de formol. A mão enluvada era então lubrificada com Ringer com lactato de sódio, já pronta para proteger a ponta da pipeta de inseminação, quando da sua introdução na cavidade vaginal. A pipeta era então direcionada, através do orifício externo cervical, até alcançar o corpo do útero. A seringa de 20 mL, contendo a dose inseminante, era acoplada na porção posterior da pipeta, sendo o conteúdo depositado no local desejado (figs. 3.11 a e b). A seringa vazia era preenchida com 5 mL de ar e novamente encaixada na pipeta, de forma a empurrar o sêmen residual da mesma (fig. 3.11.c). Posteriormente, retirava-se a mão com a pipeta protegida, e realizava-se massagem do clitóris. A pipeta era imediatamente levada ao laboratório, para analisar uma gota residual de seu interior. A hora da inseminação de cada égua era imediatamente anotada. Amostras para morfologia do sêmen resfriado eram retiradas e acondicionadas em ependorffs contendo uma solução de formol salina tamponada.
Todo o material a ser utilizado para a diluição e acondicionamento do sêmen (seringas, pipetas graduadas de vidro, mamadeiras, tubos de vidro)
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Boreda; filme de PVC transparente – Alumipack Indústria de Embalagens Ltda.
era enxaguado previamente com Ringer com lactato de sódio, e então colocado na placa aquecedora a 35ºC.
3.2.8. Análises Estatísticas
Todas as análises estatísticas foram processadas pelo programa estatístico Statistical Analysis System, versão 5- Microsoft® (SAS, 1999), sendo adotado o nível de significância de 95% (p<0,05). Neste programa foi utilizada a rotina General Linear Models (GLM) para análise de dados quantitativos.
Quatro subdivisões (A, B, C, D) foram realizadas dentro dos grupos experimentais, para a análise dos dados, envolvendo o uso do sêmen diluído e resfriado (Experimento II), visando-se estudar:
A) O efeito do intervalo entre a inseminação artificial (IA em dias fixos às terças, quintas e sábados) e a ovulação, sobre a fertilidade das éguas, por meio dos agrupamentos:
1. 24 horas pré-ovulação (24P): todos os ciclos em que a ovulação foi detectada às quartas, sextas e domingos, ou seja, a IA realizada num período de 24 horas antes da ovulação (n = 58);
2. 48 horas pré-ovulação (48P): todos os ciclos em que a ovulação foi detectada às segundas- feiras, ou seja, a IA realizada num período de 48 horas antes da ovulação (n = 44);
3. 48 horas pré-ovulação e mais uma IA realizada num período de 24 horas pós-ovulação (48PP): todos os ciclos em que a ovulação foi detectada às quintas e sábados, ou seja, o intervalo entre as duas últimas inseminações foi de 48 horas (n = 71);
4. 72 horas pré-ovulação e mais uma IA realizada num período de 24 horas pós-ovulação (72PP): todos os ciclos em que a ovulação foi detectada às terças-feiras, ou seja, o intervalo entre as duas últimas inseminações foi de 72 horas (n = 10).
No total de 195 ciclos, 12 foram desconsiderados apenas para as análises referentes aos intervalos IA/ovulação, em virtude de estarem relacionados às ovulações que não puderam ser detectadas com exatidão, pela palpação transretal, mas comprovadas, posteriormente, pelo uso da ultra- sonografia.
B) O efeito do número de IAs sobre a fertilidade Avaliou-se o efeito do número de IAs/ciclo sobre a fertilidade, dentro dos grupos experimentais, de acordo com os seguintes agrupamentos:
1. Uma IA/ciclo (n = 65); 2. Duas IAs/ciclo (n = 81); 3. Três IAs/ciclo (n = 49).
C) O efeito da categoria reprodutiva das éguas sobre a fertilidade
As fêmeas foram agrupadas de acordo com a categoria a que pertenciam e analisadas quanto à fertilidade:
1. Éguas jovens que nunca gestaram (Potra - n = 13);
2. Éguas vazias da estação anterior (Égua solteira - n = 87);
3. Éguas com potro ao pé, inseminadas em um período acima de 20 dias pós-parto (Égua parida - n = 42);
4. Éguas com potro ao pé, inseminadas dentro de 20 dias pós-parto (Égua no “cio do potro” - n = 53).
D) O efeito da idade das éguas sobre a fertilidade As fêmeas foram divididas em faixas etárias para comporem os seguintes agrupamentos, quando avaliou-se o efeito da idade sobre a fertilidade:
1. Éguas com idades de 2,5 a 6 anos (n = 23); 2. Éguas com idades de 6,5 a 10 anos (n = 96); 3. Éguas com idades de 10,5 a 14 anos (n = 41); 4. Éguas com idades de 14,5 a 19 anos (n = 35).
Para todos os delineamentos propostos, foram estudadas as seguintes características reprodutivas:
número de ciclos: refere-se ao número de repetições (“n”) utilizado em cada tratamento; idade: idade média das éguas, em cada tratamento;
número de ciclos/égua: refere-se ao número de ciclos utilizados de cada égua;
número de ciclos/égua gestante: refere-se ao número de ciclos necessários para que cada égua ficasse gestante;
número de IA/ciclo: refere-se ao número médio de inseminações artificiais realizadas por