Fama Macbeth two-step procedure as a method for a model

4.2.3.1 Participação dos receptores adrenérgicos-β

4.2.3.1.1 Efeito do LASSBio-1847 sobre as contrações tônicas induzidas por CCh na ausência e na presença de propranolol

A traqueia era montada conforme o item 4.2.1.3. Após o período de estabilização, 3 x 10-7, 10-6 ou 3 x 10-6 M de propranolol, um bloqueador adrenérgico- não seletivo (BILOIKOVÁ; BAUER; KOLENA, 1987), era pré-incubado por 20 minutos em preparações distintas e uma resposta contrátil com CCh era induzida. Após a estabilização do componente tônico dessa contração, o LASSBio-1847, era adicionado à cuba em concentrações crescentes de maneira cumulativa e seu efeito relaxante era registrado. O efeito do LASSBio-1847 era avaliado na ausência do propranolol e tomado como controle. Os valores de pD2 do LASSBio-1847 foram comparados como descrito anteriormente.

4.2.3.1.2 Efeito da isoprenalina sobre as contrações tônicas induzidas por CCh na ausência e presença do LASSBio-1847

A traqueia era montada conforme o item 4.2.1.3. Após o período de estabilização, 3 x 10-6 ou 10-6 M do LASSBio-1847 era pré-incubado por 20 minutos em preparações distintas de cobaias não asmáticos e asmáticos, respectivamente, e uma resposta contrátil com CCh era induzida. Após a estabilização do componente tônico dessa contração, a isoprenalina, um agonista -adrenérgico (ITO et al., 1995), era adicionada à cuba em concentrações crescentes de maneira cumulativa e seu efeito relaxante era registrado. O efeito da isoprenalina era avaliado na ausência do LASSBio-1847 e tomado como controle. Os valores de pD2 da isoprenalina foram comparados como descrito anteriormente.

4.2.3.2 Investigação da participação da via AC/cAMP/PKA

4.2.3.2.1 Efeito da forscolina sobre as contrações tônicas induzidas por CCh na ausência e na presença do LASSBio-1847

A traqueia era montada conforme o item 4.2.1.3. Após o período de estabilização, o LASSBio-1847 era pré-incubado por 20 minutos na concentração que mais se aproximasse ao seu valor de pD2 e uma resposta contrátil com CCh era induzida. Após a estabilização do componente tônico dessa contração, a forscolina, um ativador de ciclase de adenilil (BROOKER; PEDONE; BAROVSKY, 1983), era adicionado à cuba em concentrações crescentes de maneira cumulativa e seu efeito relaxante era registrado. O efeito da forscolina era avaliado na ausência do LASSBio-1847 e tomado como controle. Os valores de pD2 da forscolina foram calculados e comparados como descrito anteriormente.

4.2.3.2.2 Efeito da aminofilina sobre as contrações tônicas induzidas por CCh na ausência e na presença do LASSBio-1847

A traqueia era montada conforme o item 4.2.1.3, em seguida as preparações eram expostas por 20 minutos ao LASSBio-1847 na concentração que mais se aproximasse ao seu valor de pD2 e uma segunda resposta contrátil ao CCh era obtida. Após a estabilização dessa segunda contração, durante a sua fase tônica e sustentada, a aminofilina, um inibidor não seletivo de PDEs (LIU et al., 2003), era adicionada à cuba de maneira cumulativa e seus efeitos relaxantes registrados. O efeito da aminofilina foi avaliado em experimentos concomitantes na ausência do LASSBio-1847. Foram comparados os valores de pD2 da aminofilina na ausência e presença do derivado.

4.2.3.2.3 Efeito do LASSBio-1847 sobre as contrações tônicas induzidas por CCh na ausência e na presença do H-89

A traqueia era montada conforme o item 4.2.1.3 e após o período de estabilização, era incubado por 30 minutos 10-7, 3 x 10-7 e 10-6 M de H-89, inibidor seletivo de PKA (LOCHNER; MOOLMAN, 2006; IRIÉ-N’GUESSAN et al., 2011) e uma resposta contrátil com CCh era induzida. Após a estabilização do componente tônico dessa contração, o LASSBio-1847 era adicionado à cuba em concentrações crescentes de maneira cumulativa e seu efeito relaxante era registrado. O efeito do LASSBio-1847 era avaliado na ausência do H-89 e tomado como controle. Os valores de pD2 do LASSBio-1847 foram comparados como descrito anteriormente.

4.2.3.2.4 Quantificação dos níveis teciduais de cAMP

A traqueia era montada conforme o item 4.2.1.3 e estabilizada por 60 minutos. Em seguida, era induzida uma resposta contrátil com CCh e após a formação do componente tônico dessa contração, era adicionado 10-4 _{M de rolipram, um inibidor} seletivo das PDE4 (DAL PIAZ; GIOVANNONI, 2000), ou 10-5, 3 x 10-5 e 10-4 M de LASSBio-1847, em preparações distintas e observado o efeito relaxante de cada situação. Ao obter-se o efeito máximo de cada substância, os anéis de traqueia eram coletados e imediatamente armazenados em nitrogênio líquido.

Posteriormente, uma solução a 5% de ácido tricloroacético (TCA) era adicionada ao tecido congelado, na proporção de um mL da solução para cada grama do tecido, e homogeneizado em gelo. O homogenato obtido foi centrifugado por 10 minutos a 1500 g e o sobrenadante cuidadosamente transferido para um tubo limpo, realizando-se em seguida a remoção do TCA com uma solução de água saturada com éter, numa proporção de cinco volumes dessa mistura para cada volume do sobrenadante obtido na centrifugação, sendo esse processo realizado mais duas vezes. Por fim, o éter residual era removido da amostra por aquecimento a 70 ºC em banho-maria por 5 minutos.

A quantificação do conteúdo de cAMP nas amostras foi realizado utilizando-se uma kit de ELISA para quantificação de cAMP (Cayman Chemical Company, Michigan, EUA). De acordo com o procedimento descrito no kit, a placa de ELISA com 96 poços foi preparada e a curva de dosagem padrão foi adicionada a placa (50 _{μL/poço), em duplicata, em seguida adicionou-se as amostras provenientes dos} anéis tratados com rolipram ou LASSBio-1847 nos poços previamente determinados (50 μL/poço).

Por fim, a placa foi coberta com papel filme e incubada por 18 horas a 4 ºC para o desenvolvimento da reação com os reagentes previamente adicionados de acordo com o procedimento padrão do kit. Após esse período, os reagentes foram removidos, os poços lavados e realizado a leitura da placa em um leitor de placas de ELISA no comprimento de onda entre 405 e 420 nm. Os dados de densidade ótica foram transformados para concentração de acordo com a curva de soluções padrão descritas no procedimento contido no guia do fabricante.