Survey questions - Ecomafie’s aggravated circumstances and the role of society

Chapter 5. Ecomafie’s aggravated circumstances and the role of society

3. Survey questions

As subunidades da HbGp utilizadas nos experimentos de AUC foram obtidas a partir da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC). No entanto, para obter o dodecâmero em concentrações adequadas, adicionou-se EDTA na concentração de 0,3 mmol/L às amostras da oxi-HbGp incubadas no pH 9,5. A Figura 11 mostra o cromatograma da oxi-HbGp 25 mg/mL incubada por 15 h. Quatro picos bem resolvidos correspondentes à proteína íntegra (I), dodecâmero (II), trímero (IV) e monômero (VI), e dois ombros associados ao tetrâmero (III) e linkers (V) são observados. Os estudos de AUC foram realizados apenas para as espécies mais concentradas e que apresentaram picos melhor resolvidos, ou seja, para as frações que correspondem ao trímero, dodecâmero e monômero d.

Figura 11: Cromatogramas da oxi-HbGp 25,0 mg/mL, em tris-HCl 0,1 mol/L incubada com 0,3 mmol/L de EDTA, no pH 9,5, a 25 o_{C por 15 h. A eluição foi realizada com o mesmo tampão no pH}

7,0. Os algarismos romanos (I-VI) correspondem às diferentes espécies obtidas da dissociação em meio alcalino da HbGp.

Fonte: Carvalho, F. A. O. et al. pH effect upon HbGp oligomeric stability: characterization of the dissociated species by AUC and DLS studies, International Journal of Biological Macromolecules, v. 59, p. 333-341, 2013.

A Figura 12 mostra as curvas de distribuição de coeficientes de sedimentação, c (S), para o trímero, dodecâmero e monômero d em três concentrações de proteína, no pH 7,0. As curvas de distribuição, c (S), do trímero abc (Figura 12A) são compostas por dois picos com

coeficientes de sedimentação de 3,6 ± 0,2 S (pico mais intenso) e 5,7 ± 0,2 S (Tabela 4). O primeiro pico mais intenso (Figura 12A) é devido à contribuição do trímero abc, e o segundo corresponde ao complexo (abc + L) formado pela associação do trímero abc com uma cadeia linker L. Segundo estudos de caracterização das subunidades da HbLt por velocidade de sedimentação, os valores de de 3,93, 3,78 e 3,46 S estão associados ao trímero abc 7.

Figura 12: Distribuições contínuas dos coeficientes de sedimentação das subunidades da HbGp, em 100 mmol/L tris-HCl, pH 7,0, contendo 50 mmol/L NaCl. (A) trímero abc, (B) dodecâmero (abcd)3 e

(C) monômero d. Para o trímero e dodecâmero foram usadas as concentrações de 100, 200 e 300 g/mL e para o monômero d 200, 400 e 800 g/mL de proteína. Os valores de para cada

concentração foram determinados como o valor máximo dos picos das curvas de c (S). Experimentos monitorados em 415 nm.

As contribuições percentuais para as duas espécies foram determinadas através das áreas de cada pico, e os valores são mostrados na Tabela 4. As contribuições observadas para

o trímero abc e complexo (abc + L) são 87 ± 4 % e 13 ± 2 %, respectivamente. A alta intensidade do primeiro pico nas curvas de distribuição sugere que o trímero abc é a espécie majoritária na fração IV obtida por SEC 18,20, corroborando os resultados observados por eletroforese SDS-PAGE 20. As massas moleculares MM foram obtidas de ajustes globais como descrito na seção de métodos, enquanto o raio de Stokes, RS mostrado na Tabela 4 é um

parâmetro de saída obtido no programa SEDFIT. Os valores de MM e RS, são de 51,0 ± 0,4

kDa e 3,4 ± 0,1 nm para o trímero abc, e 80 ± 3 kDa e 4,3 ± 0,2 nm para o complexo (abc +

L). O valor de MM obtido para o trímero abc a partir dos dados SV é consistente, quando

comparado com os valores de massa molecular de 51,1 kDa determinado por MALDI-TOF- MS para esta espécie 18 e de 52,8 kDa obtida para o trímero abc da HbLt 21,76.

Tabela 4: Propriedades hidrodinâmicas das subunidades da HbGp determinadas por

velocidade de sedimentação (SV) no pH 7,0, a 20 oC.

Frações a Espécies Propriedades hidrodinâmicas

Rs (nm) b (S) c MM (kDa) d Área (%)

Monômero d d 2,5 ± 0,3 1,9 ± 0,1 17,0 ± 0,5 80 ± 7

2d 2,9 ± 0,2 2,8 ± 0,2 32,1 ± 0,5 15 ± 3

4d 3,7 ± 0,3 4,4 ± 0,2 66,4 ± 0,7 5 ± 2

Trímero abc abc 3,4 ± 0,1 3,6 ± 0,2 51,0 ± 0,4 87 ± 4

abc + L 4,3 ± 0,2 5,7 ± 0,2 80 ± 3 13 ± 2

Dodecâmero

(abcd)3

abcd 4,1 ± 0,1 5,2 ± 0,3 68,8 ± 0,7 22 ± 5

(abcd)3 4,8 ± 0,4 9,7 ± 0,2 202,4 ± 0,8 78 ± 4

As espécies d, 2d, 4d, abc, abc +L, abcd e (abcd)3 correspondem ao monômero puro, dímero de monômero d, tetrâmero de monômero d, trímero, trímero ligado com uma cadeia linker, tetrâmero e dodecâmero, respectivamente.

Espécies obtidas por cromatografia de exclusão por tamanho da oxi-HbGp incubada por 15 h, no pH 9,60. A eluição foi feita no pH 7,0 como descrito em trabalhos anteriores 20.

Raio de Stokes estimado no programa SEDFIT a partir de dados de velocidade de sedimentação.

Dados obtidos por regressão linear. d

Massas moleculares estimadas por ajustes globais das três concentrações de proteína descritas na seção 3.1.7.1 no programa SEDPHAT.

A diferença apreciável no valor de RS obtido para o trímero (3,4 ± 0,1 nm, Tabela 4)

não mostrados), deve estar associada ao fato dos valores obtidos no DLS serem uma média de todas as espécies presentes na solução, de modo que a espécie (abc + L) mesmo com apenas 13 % em solução, deve contribuir significativamente para o aumento deste valor.

As curvas de distribuição de coeficientes de sedimentação para o dodecâmero (Fração II) mostradas na Figura 12B têm duas contribuições bem definidas. O pico de maior intensidade com 78 ± 4 % em solução, tem valores de de 9,7 ± 0.2 S e MM de 202,4 ± 0,8 kDa, e é atribuído ao dodecâmero (abcd)3. A espécie minoritária, contribuindo com 22 ± 5 % em solução, deve ser o tetrâmero abcd, é caracterizado por uma MM e de 68,8 ± 0,7 kDa e 5,2 ± 0,3 S, respectivamente. Esta espécie, possivelmente, foi formada a partir da dissociação oligomérica parcial do dodecâmero nas condições experimentais utilizadas. Os valores de MM e para o dodecâmero (abcd)3 e tetrâmero abcd são consistentes com resultados descritos na literatura para as hemoglobinas HbGp e HbLt 18-21,76. Estudos da HbLt, na presença de vários agentes caotrópicos, mostram que o dodecâmero é o principal intermediário do processo de dissociação oligomérica. Além disso, esta espécie apresenta uma alta afinidade na ligação com o oxigênio, semelhante ao observado para a proteína íntegra, sugerindo que a unidade (abcd)3 deve ser a estrutura funcional no processo de ligação do oxigênio na proteína nativa. Outras subunidades menores, tais como, o trímero abc e o monômero d não têm afinidade pela molécula de O2 quando estão isolados78.

Os experimentos de SV para o monômero d puro para avaliar a oligomerização desta subunidade são mostrados na Figura 12C e as propriedades hidrodinâmicas são mostradas na Tabela 4. Os valores de MM e de 17,0 ± 0,5 kDa e 1,9 ± 0,1 S para o monômero d, e 32,1 ± 0,5 kDa e 2,8 ± 0,2 S para o dímero de monômero 2d, são semelhantes aos descritos em estudos anteriores 18-20. Como descrito em estudo por MALDI-TOF-MS, o monômero d tem tendência para oligomerizar. Os dados de AUC mostram duas contribuições de 15 % e 5 %, atribuídas ao dímero do monômero, 2d, e ao tetrâmero de monômero, 4d (Figura 12C e Tabela 4). Convém notar, que a partir dos dados de AUC não foi possível identificar uma contribuição de trímero 3d, como foi observado em estudos anteriores por MALDI-TOF-MS 20

A partir das várias técnicas utilizadas para a caracterização das frações da HbGp obtidas por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), pode-se inferir que algumas frações, tais como, o monômero d, o trímero abc e o dodecâmero (abcd)3, apresentam um grau de pureza acima de 78 %. No entanto, algumas propriedades intrínsecas destas subunidades favorecem a presença de outras espécies nestas frações.

PARTE II

In document Environmental crimes and illegal waste trade : a study of the perception of the seriousness of crimes related to slow violence and ecomafie in the province of Brescia, Italy (sider 95-0)