4. LOFOTR VIKING MUSEUM PÅ BORG
4.3 Museets komposisjon
4.3.1 En vandring gjennom museet
C. pseudotuberculosis possui poucos genes envolvidos na virulência relatados na
literatura. Assim, analisamos a expressão diferencial destes genes em cada situação em que simulamos o ambiente encontrado no hospedeiro, durante o processo de infecção.
Na tabela 3 visualiza-se o valor de expressão do gene codificante da PLD e genes envolvidos na aquisição do ferro (fag).
TABELA 3 - Expressão diferencial, em cada condição, do gene pld , genes do operon fagABC e gene fagD.
Condiçao Gene Produto RPKM
estresse RPKM controle fold_change 2M pld Phospholipase D precursor 1,53 2,36 0,6483* pH pld Phospholipase D precursor 13,44 2,36 5,6949 50°C pld Phospholipase D precursor 0 2,36 NA
2M fagA integral membrane protein 26,41 44,86 0,5887*
pH fagA integral membrane protein 31,85 44,86 0,7099*
50°C fagA integral membrane protein 71,16 44,86 1,5862
2M fagB Iron-enterobactin transporter 10,48 19,86 0,5276*
pH fagB Iron-enterobactin transporter 19,69 19,86 0,9914*
50°C fagB Iron-enterobactin transporter 26,25 19,86 1,3217*
2M fagC ATP binding cytoplasmic membrane 19,52 22,6 0,8637*
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protein
pH fagC ATP binding cytoplasmic membrane protein
18,06 22,6 0,7991*
50°C fagC ATP binding cytoplasmic membrane protein
31,87 22,6 1,4101*
2M fagD iron siderophore binding protein 1001,02 1380,39 0,7251*
pH fagD iron siderophore binding protein 3707,7 1380,39 2,6859
50°C fagD iron siderophore binding protein 1853,52 1380,39 1,3427
RPKM estresse=expressão de genes no meio com alteração. RPKM controle=expressão de genes no meio BHI controle. fold-change = valor da razão entre RPKM estresse e RPKM controle, onde valor menor que 1, indica que o gene foi reprimido e valor maior que 1 indica gene induzido. *- genes que não foram significativos, apresentaram p-value > 0,001, ou seja apresentou expressão similar ao controle. NA: quando a contagem da leitura para o gene for igual a zero em uma amostra e na outra, for um número menor que 5, o programa não faz cálculo algum para o gene em questão, então aparece NA (Non applicable).
Abaixo seguem as figuras (Figura 13 e Figura 14) obtidas através do programa Artemis do arquivo de saída .bam gerado no programa BioScope, das leituras que cobriram a região no genoma, referente aos genes pld e fag, entre as condições de estresse ácido, temperatura e controle., respectivamente. Única condição em que o gene pld foi considerado diferencialmente expresso foi no meio ácido, ainda que baixo o número de transcritos representando esta região. O gene fagA, foi considerado significativo somente no estresse térmico e o fagD, significativo no estresse térmico e acidez.
FIGURA 13 - Cobertura da região transcricionalmente ativa do gene pld e fagD.
Genes pld e fagD, em destaque cor de rosa, na condição de acidez ao lado esquerdo e condição controle ao lado direito. Observamos os genes considerados diferencialmente expressos na acidez, em relação ao controle. Visualiza-se o número de leituras cobrindo cada região transcricionalmente ativa no genoma de
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FIGURA 14 -Cobertura da região transcricionalmente ativa do gene fagA e fagD.
Genes fagA e fagD (destaque em rosa) na condição de estresse térmico à esquerda e condição controle à direita, que foram considerados induzidos no estresse. Observa-se o número de leituras cobrindo cada região transcricionalmente ativa no genoma de C.pseudotuberculosis 1002. Figura obtida no Artemis utilizando o arquivo .bam, gerado no BioScope.
Como o gene fagD é regulado pelo gene dtxR, verificamos os resultados deste gene e os valores podem ser visualizados na tabela 4. O gene foi reprimido nas condições de estresse osmótico e térmico. Na acidez o gene foi considerado induzido.
TABELA 4 - Expressão diferencial do gene dtxR.
Condiçao Gene Produto RPKM
estresse RPKM controle
fold-change p-value <0,001 2M dtxR diphtheria toxin repressor 200,21 348,54 0,5744 0,0052*
50°C dtxR diphtheria toxin repressor 347,47 348,54 0,9969 0,0002
pH dtxR diphtheria toxin repressor 624,67 348,54 1,7922 4,48 e-46
RPKM estresse=expressão de genes no meio com alteração. RPKM controle=expressão de genes no meio BHI controle, sem alteração. fold-change = valor da razão entre RPKM estresse e RPKM controle, onde valor menor que 1, indica que o gene foi reprimido e valor maior que 1 indica gene induzido. p-value < 0,001= valor de corte para identificar genes diferencialmente expresssos (significativos). * genes que não foram significativos, apresentaram p-value > 0,001, ou seja apresentou expressão similar ao controle.
Na figura 15, pode-se observar o regulon do gene dtxR e o fagD, um dos genes regulados pela DtxR, está em destaque. O gene regula 13 genes, conforme dados do banco CoryneRegNet (http://coryneregnet.cebitec.uni-bielefeld.de/v6/).
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FIGURA 15 - Regulon do gene dtxR.
O gene regula13 genes, entre eles o gene fagD. A seta vermelha que sai do circulo azul significa que é uma interação repressora, ou seja o circulo azul que representa o gene dtxR, reprime o circulo cinza, que um deles em destaque representa o gene fagD. Figura obtida no programa CoryneRegNet (http://coryneregnet.cebitec.uni- bielefeld.de/v6/).
62 5.6.2. Gene cp40
Em C.pseudotuberculosis 1002, os dados do transcriptoma confirmaram um gene precursor de serina protease- endoS (possivelmente a CP40), mas com uma expressão praticamente nula, muito similar ao controle, em todas as situações testadas. Analisando todo o transcriptoma de C.pseudotuberculosis 1002, encontramos quatro supostas proteínas apresentando a característica de uma serina protease, e entre elas, três foram consideradas diferencialmente expressas nas condições testadas (Tabela 5). São elas: Trypsin family serine
protease, Putative serine protease, Putative trypsin-like serine protease.
TABELA 5 - Expressão de genes supostamente codificantes de serina protease.
Condiçao Gene ID Produto RPKM
estresse RPKM controle
Fold-change 2M Cp1002_0210 Putative Trypsin family serine
protease
127,26 71,4 1,7823
pH Cp1002_0210 Putative Trypsin family serine protease
119,07 71,4 1,6676
50°C Cp1002_0210 Putative Trypsin family serine protease
81,29 71,4 1,1385*
2M Cp1002_0662 Putative serine protease 165,9 146,13 1,1352
pH Cp1002_0662 Putative serine protease 381,33 146,13 2,6095
50°C Cp1002_0662 Putative serine protease 202,43 146,13 1,3852
2M sprX Putative trypsin-like serine protease
144,66 131,51 1,0999
pH sprX Putative trypsin-like serine protease
84,51 131,51 0,6426*
50°C sprX Putative trypsin-like serine protease
175,6 131,51 1,3352
RPKM estresse=expressão de genes no meio com alteração. RPKM controle=expressão de genes no meio BHI controle, sem alteração. fold-change = valor da razão entre RPKM estresse e RPKM controle, onde valor abaixo de 1 indica que o gene foi reprimido e valor acima de 1 indica gene induzido. P-value < 0001= valor de corte para
identificar genes diferencialmente expresssos. * - genes que apresentaram valor de p-value > 0,001, ou seja, não foram significativos.
Somente na condição de acidez, o gene Cp1002_0062 codificante da suposta serina protease, apresentou uma indução de quase três vezes (fold-change ≥ 2) em relação ao controle.
63 5.6.3. Componentes da parede celular e modificação lipídica
Em relação à composição dos lipídeos na parede um gene interessante, ufaA (Tabela 6), codificante de uma suposta sintase do ácido graxo ciclopropano mostrou variação entre ser classificado como diferencialmente expresso ou não, induzido ou reprimido nas diferentes condições. Somente na condição de acidez o gene não foi considerado diferencialmente expressão e nesta situação mostrou-se reprimido. Nas outras condições foi significativo (p-
value < 0,001) e mostrou-se induzido, mas a razão (fold-change) entre estresse e controle foi
baixa, quase a mesma expressão entre eles.
TABELA 6 - Gene codificante de proteína componente da parede.
Condiçao Gene Produto RPKM
estresse
RPKM