Empirical Results

A necrose e a apoptose são dois processos distintos de morte celular, sendo a necrose o resultado de uma injúria que afeta um grande grupo de células, causando edema celular e ruptura de membrana que provoca uma resposta inflamatória em tecidos sadios adjacentes. Em contrapartida, a apoptose afeta células isoladas, não compromete tecidos próximos e não possui uma resposta inflamatória associada. Trata-se de uma forma fisiológica normal de morte celular, que ao contrário da necrose, caracterizada por um processo ativo de alterações morfológicas e fisiológicas, a fim de manter a homeostase do tecido (HENDRICKS e HANSEN, 2009).

A apoptose pode ser reconhecida por característicasmorfológicas muito marcantes e coordenadas. De um modo geral, a apoptose é um fenômeno bastante rápido: ocorre uma retração da célula que causa perda da aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. As organelas celulares mantêm a sua morfologia, com exceção, em alguns casos, das mitocôndrias, que podem apresentar ruptura da membrana externa. A cromatina sofre condensação e se concentra junto à membrana nuclear, que se mantém intacta.

A seguir, a membrana celular forma prolongamentos e o núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrananuclear. Os prolongamentos da membrana celular aumentam de número e tamanho e rompem, originando estruturas contendo o conteúdo celular. Estas porções celulares envoltas pela membrana celular sãodenominadas corpos apoptóticos. Os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por macrófagos e removidos sem causar um processo inflamatório. Outra característica muito marcante da morte por apoptose é a fragmentação internucleossômica do DNA, a qual possui um padrão característico (GRIVICICH et al., 2007)

No decorrer do desenvolvimento embrionário, a quantidade de corpúsculos apoptóticos aumenta. Esta elevação é indicativa de que os embriões são capazes de remover as células com um potencial inapropriado regulando a diferenciação celular (DE LA FUENTE e KING, 1997).

As características morfológicas da morte celular por apoptose, como a condensação da cromatina, marginalização e fragmentação nuclear, são visíveis nos estágios de mórula e blastocisto produzidos tanto in vitro como in vivo. A apoptose espontânea é primeiramente

observada nos embriões bovinos no estágio de 8-16 células no período coincidente com a ativação do genoma embrionário. Muitos sinais diferentes podem induzir a apoptose e a exposição dos embriões a ambientes adversos pode, por exemplo, aumentar o número de células apoptóticas em resposta ao estresse ocasionado, como em caso de estresse térmico e de condições desfavoráveis do meio de cultivo embrionário (HARDY, 1999).

Do ponto de vista bioquímico a apoptose caracteriza-se por alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial externa que se torna permeável a proteínas (PATTERSON et al., 2000), redução no potencial de membrana mitocondrial (PMM) regulado por proteínas da família Bcl-2 (HIRSCH et al., 1997; DESHMUKH et al., 2000; GOLDSTEIN et al., 2000), desorganização da camada bilipídica com translocação da fosfatidilserina da camada interna para camada externa da membrana plasmática (MARTIN et al., 1995).

No núcleo, a mudança bioquímica mais bem definida é a ativação da cascata das enzimas caspases que desencadeia a ativação da DNase (caspase activated DNase) (Desoxirribonuclease). A ativação da DNase leva a clivagem do DNA entre nucleossomos, gerando fragmentos de DNA entre 180-200 pb (WYLLIE et al., 1997; SARASTE e PULKKI, 2000).

Esses estudos identificaram genes importantes envolvidos na apoptose (ced-3, ced-4 and ced-9) (HORVITZ et al., 1982; ELLIS e HORVITZ, 1986) e levaram a descoberta de seus homólogos em mamíferos. Em mamíferos, o gene supressor da apoptose, Bcl2, sempre está associado ao gene proteína humana fator de ativação de proteases associada à apoptose (APAF-1), o que impede a ativação da caspase 9. Quando a apoptse é iniciada, a proteína humana Bax se associa a Bcl2, liberando a APAF-1 e ativando a caspase 9 que leva a apoptose (HENGARTNER, 2000).

As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) pertencem à família das cisteínas proteases que clivam especificamente seus substratos em resíduos de ácido aspártico. As caspases sinalizam para a apoptose e clivam os substratos levando à condensação e fragmentação nuclear, externalização de fosfolipídios de membrana que irão sinalizar para estas células serem fagocitadas por macrófagos.As caspases são sintetizadas como precursores inativos denominados zimogênios. Após um sinal de morte celular, as caspases são ativadas por clivagem proteolítica. Essas enzimas podem interagir com receptores de membrana ou moléculas adaptadoras que contenham domínios de morte (BOATRIGHT e SALVESEN, 2003).

Algumas destas proteínas são anti-apoptóticas (bcl-2 e bcl-XL) enquanto outras são pró-apoptóticas (Bad, Bax e Bid). A sensibilidade das células ao estímulo indutor da apoptose depende do balanço entre estas proteínas. Quando existe um excesso de proteínas pró-apoptóticas a célula fica mais sensível a apoptose e quando existe um excesso de proteínas anti-apoptóticas a célula fica mais resistente.

As proteínas pró-apoptóticas são frequentemente encontradas no citosol, onde atuam como sensores do dano ou estresse celular. Após o estímulo estressante, estas proteínas são realocadas na superfície da mitocôndria, onde existem proteínas anti- apoptóticas. Esta interação entre as proteínas pró e anti-apoptóticas desfaz a função normal das proteínas anti-apoptóticas e leva a formação de poros (PT - Permeability Transition pore) na membrana mitocondrial, por onde sai o citocromo c e outras moléculas pró- apoptóticas.

Este processo leva, então, a ativação da cascata de caspases. Quando o citocromo c é liberado no citosol ele interage com uma proteína chamada Apaf-1, levando ao recrutamento da pró-caspase-9 para dentro de um complexo multiproteína formado pelo citocromo c e pela Apaf-1. Este complexo é chamado apoptossomo e promove a ativação da caspase 9 induzindo também a ativação da caspase 3. As caspases são proteases promovedoras da apoptose, que induzem mudanças no transporte de elétrons, perda do potencial de membrana mitocondrial e alteração no estado de redução-oxidação celular. Além disso, a caspase 3 lisa o citoesqueleto celular levando as desestruturação celular, característica da apoptose (PARONE, 2002).