Eksperimentene og oppgavesett

defendem que a acetona 70% é um dos solventes mais eficaz na extração deste tipo de compostos. Contudo não é consensual, uma vez que outros autores defendem o contrário. Independentemente disso, a diferença entre os teores extraídos com acetona, etanol e metanol não deveriam ser tão diferentes. Os extratos 4 e 6 apresentam teores em compostos fenólicos superiores aos das amostras 1 e 3 respetivamente, conforme previsto, porque alguns autores afirmam que com a utilização de azoto líquido os teores extraídos são superiores.

Quando comparados os teores obtidos neste método com os cromatogramas a 280 nm obtidos por HPLC-DAD, apresentados mais à frente neste trabalho, verifica-se que são maioritariamente são concordantes, existindo pequenas diferenças. A área total do cromatograma do extrato 6 é superior à do extrato 4, tal como seria de se esperar, uma vez que a partir desta técnica o teor do extrato 6 é superior ao do extrato 4. A área total do extrato 3 é superior à do extrato 1, o que não seria de se esperar, uma vez que a partir desta técnica o teor do extrato 1 é superior ao do extrato 3. A área total do cromatograma do extrato 2 é superior à do extrato 5, tal como seria de se esperar, uma vez que a partir desta técnica o teor do extrato 2 é superior ao do extrato 5. Uma possível causa para o observado é o facto das técnicas espetrofotométricas serem mais sensíveis a interferentes que estejam presentes nos extratos. Outra situação é o fato de a 280 nm há interferência das antocianinas que também absorvem, enquanto que para este método não apresentam afinidade.

Na tabela 13 são apresentados teores descritos, por outros autores, em função das diferentes espécies de mirtilos. Os resultados descritos na literatura variam conforme a espécie em estudo, sendo que algumas delas, nomeadamente o V. myrtillus, apresentam teores muito superiores aos encontrados no V. corymbosum.

Tabela 13 - Teor total de fenóis, obtidos por outros autores, nas diferentes espécies de mirtilos

Espécie Teores Autores

V. corymbosum 452,8 mg GAE/100 g 274 mg GAE/100 g 289,5 mg GAE/100 g Yuan et al. (2011) Wang et al. (2012) Giovanelli e Buratti (2009)

V. myrtillus 595 mg GAE/100 g Giovanelli e Buratti (2009)

V. virgatum 331 mg GAE/100 g You et al. (2011)

V. ashei 510,6 mg GAE/100 g Yuan et al. (2011)

Medina (2011)desenvolveu um novo método para a quantificação dos fenóis totais a partir da reação com o sal de diazónio Fast Blue BB. Os teores obtidos foram muito superiores (1291 mg/100g) comparativamente com os obtidos pelo método Folin-Ciocalteu (315 mg/100g). Este novo método é rápido e simples e baseia-se na ligação de compostos fenólicos com o sal de diazónio originando estruturas “azo”. Este acoplamento ocorre em soluções levemente alcalinas onde os compostos fenólicos são convertidos a iões fenóxido, sendo estes muito mais reativos que a estrutura inicial. O sal Fast Blue BB contem um grupo diazónio que se liga ao grupo reativo –OH destes fenóis. As principais vantagens, comparativamente com o método Folin-Ciocalteu utilizado neste trabalho, estão relacionadas com o facto de não existir interferência de outros compostos antioxidantes e redutores não fenólicos (ácido ascórbico, glicose, frutose, sulfitos) comumente presentes nos frutos. Para além desses compostos, alguns aminoácidos (tirosina e triptofano) e proteínas também reagem com o reagente de Folin-Ciocalteu apresentando a coloração azul. Não ignorando estas vantagens, o método Folin-Ciocalteu foi utilizado no presente estudo, uma vez que é mais antigo e fiável, todos os parâmetros são conhecidos e estão otimizados, a maioria dos autores utilizam-no demonstrando confiança no mesmo. No futuro, quando existirem mais estudos sobre este novo método transmitindo mais confiança, e quando todos os parâmetros estiverem 100% estudados, será de considerar a sua utilização, uma vez que é mais rápido e apresenta menos custos.

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1.2. Determinação do teor em antocianinas totais

Os pigmentos azuis-arroxeados do mirtilo são maioritariamente antocianinas, estas reagem com o bissulfito dando origem a compostos incolores, descorando a solução. A diferença entre as amostras com bissulfito e as amostras de referência sem bissulfito dar-nos-á o teor em antocianinas totais presentes nas amostras. Os resultados obtidos encontram-se na tabela 14.

Tabela 14- Teor total de antocianinas nos extratos de mirtilo

Extrato Solvente Tratamento Resultados

obtidos* 1 _{Metanol:água} (80:20 v/v) ULTRATURRAX 91,39 ± 3,09ab 4 Azoto líquido 161,11 ± 6,41ab 2 _{Acetona:água} (70:30 v/v) ULTRATURRAX 59,81 ± 2,66cb 5 Azoto líquido 53,76 ± 2,26cb 3 _Etanol:água (60:40 v/v) ULTRATURRAX 77,02 ± 0,86ab 6 Azoto líquido 203,52 ± 22,36ab

*expresso em mg de equivalentes de cianidina-3-glucósido ± DP/100g de fruto fresco; (a) diferença estatística significativa (p <0.05) para o mesmo solvente com tratamentos diferentes; (c) diferença estatisticamente não significativa para o mesmo solvente com tratamentos diferentes; (b) diferença estatística significativa (p <0.05) para o mesmo tratamento da amostra com solventes diferentes.

De acordo com os resultados obtidos, os teores totais de antocianinas foram superiores no extrato 6, 203,52 ± 22,36 mg de equivalentes cianidina-3-glucósido em 100 gramas de fruto, e no extrato 4, 161,11 ± 6,41 mg de equivalentes cianidina-3-glucósido em 100 gramas de fruto, tal como se verificou no método Folin-Ciocalteu. Quando comparados os cromatogramas a 527 nm obtidos por HPLC-DAD, apresentados mais à frente neste trabalho, com estes teores verifica-se que são concordantes. A área total do cromatograma do extrato 6 é superior à do extrato 4, e a área total do extrato 1 é ligeiramente superior à do extrato 3, tal como seria de se esperar, uma vez que a partir desta técnica o teor do extrato 1 é superior ao do extrato 3, e o teor do extrato 6 é superior ao do extrato 4. O mesmo se verifica para os extratos 2 e 5, uma vez que em ambas as técnicas os teores são sempre superiores no extrato 2. Os teores são concordantes uma vez que a 527 nm apenas absorvem as antocianinas, tal como neste método, não existindo interferentes.

Todos os resultados são considerados estatisticamente diferentes (p <0.05), quer para o mesmo solvente fazendo variar os tratamentos, quer para o mesmo tratamento fazendo variar o solvente, à exceção dos extratos 2 e 5, onde os teores extraídos com acetona 70% não são significativamente diferentes entre os dois tratamentos.

Os teores obtidos no presente estudo são concordantes com os relatados por outros autores para o fruto inteiro, como demonstra a tabela 15. É possível observar uma variação nos resultados dentro da mesma espécie, uma vez que as características dos frutos estudados são diferentes (locais e formas de cultivo, condições climatéricas, data de colheita, maturação, técnicas de armazenamento e conservação, entre outros). Alguns autores determinam estes teores não apenas no fruto inteiro, como no presente estudo, mas também nas diferentes partes do fruto (película e polpa). As antocianinas estão presentes em maior quantidade na película do fruto, daí a sua cor escura, logo os teores encontrados na polpa são muito inferiores. Quando se analisa o fruto inteiro, incluindo polpa e a película, os teores são inferiores aos da película. Um dos motivos para tal ocorrer poderá dever-se à presença de interferentes na polpa que condicionam a análise das mesmas, ou a presença de compostos que em contacto com as antocianinas após trituração do fruto, levem à degradação/dissociação das mesmas.

Pertuzatti et al. (2007)determinaram os teores de antocianinas totais na fruta inteira, película e polpa, e relataram para a variedade Powder Blue valores médios de 256 e 716 mg de equivalentes cianidina-3-glucósido em 100 gramas, para o fruto inteiro e película, respetivamente. Para a variedade Delite apresentou valores médios inferiores, entre 144 e 382,3 mg de equivalentes

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