Eiendomsutvikler: SOLON/KRUSE SMITH, Vindmøllebakken

Com o objetivo de avaliar o potencial da aplicabilidade dos extratos de algas contendo MAAs em fotoprotetores comerciais, foram realizados alguns ensaios in

vitro. Alguns destes experimentos foram feitos em colaboração com a Natura

Indústria e Comércio de Cosméticos Ltda (projeto Fapesp / Natura Campus 03/08735-8).

3.7.1. Testes antioxidantes

O ensaio antioxidante utilizando DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) é baseado na propriedade deste radical estável em extrair prótons de moléculas doadoras conforme apresentado na Figura 17. Quando radical, o DPPH apresenta absorção máxima no visível em torno de 517 nm. Após a reação com moléculas que possuem atividade antioxidante, esta absorção é diminuída.

Karina H. M. Cardozo – Tese de Doutorado - 2007 N N NO₂ O₂N NO₂ N NH NO₂ O₂N NO₂ + LH + L

Figura 17. Reação de DPPH com uma molécula antioxidante doadora de próton (LH).

Para isso foram preparadas soluções de DPPH 1 mM em metanol e soluções dos extratos (2,5 mg.mL-1) a serem testados em metanol:água (1:1, v/v). Em uma microplaca foram adicionados 10 µL da solução de DPPH, diferentes volumes dos extratos para obtenção de concentrações de 0,1; 0,5; 1; 1,5 e 2 mg.mL-1 para um volume final de 100 µL completados com metanol. Para cada concentração do extrato foram descontados os brancos. Após o preparo, as amostras foram levadas ao espectrofotômetro Elisa (Molecular Devices-Versa Max) e incubadas por 30 min em temperatura de 25 oC no escuro. As amostras foram feitas em triplicata e as leituras monitoradas a 517 nm (Pellati et al., 2004; Yokozawa.et al., 1998; Ferreres

et al., 2006).

Com as leituras de absorvância obtidas, foram calculadas as porcentagens de inibição, dada pela equação:

100 (%) x Abs Abs Abs Inibição DPPH Amostra DPPH − = Equação 1

Nestes ensaios foram utilizados os extratos de G. tenuistipitata (GT-2) obtido como descrito no item 3.4.1, G. domingensis (GD-1) e G. birdiae (GB) obtidos

segundo o item 3.4.2 e a matéria-prima Helioguard 365 disponível comercialmente. Além dos extratos das algas e a título de comparação foram utilizados padrões dos flavonóides rutina e a mistura de quercetina e isoquercetrina nas mesmas condições.

3.7.2. Ensaios de citotoxicidade e fototoxicidade

Os testes de citotoxicidade e fotoxicidade foram feitos em colaboração com Natura Indústria de Cosméticos com o intuito de avaliar a viabilidade da aplicação comercial dos extratos contendo MAAs obtidos das macroalgas.

Para os ensaios de citotoxicidade, células do tipo 3T3 foram plaqueadas em meio de cultura DMEM em placas de 96 poços estéril, em uma densidade de 1x104 células.poço-1 por 24 h. Após este período, as células foram incubadas com os extratos solubilizados em água nas seguintes concentrações: 3,16 mg.mL-1; 1 mg.mL-1; 0,316 mg.mL-1; 0,1 mg.mL-1; 0,0316 mg.mL-1; 0,01 mg/mL-1; 0,00316 mg.mL-1 e 0,001 mg.mL-1. As amostras foram resuspendidas em 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e ao sistema foi adicionado meio de cultura com 5% de soro fetal bovino (SFB). As células foram incubadas por 24 h na presença dos extratos e posteriormente incubadas com o corante Neutral Red durante 3 h (Borenfreund & Puerner, 1985). O excesso de corante foi retirado e os cristais formados dissolvidos com uma mistura de etanol:ácido acético:água (50:1:49, v/v/v). A leitura de absorvância foi realizada em espectrofotômetro em 540 nm e com estes dados calculou-se a concentração em que 50% das células foram viáveis (IC50). Este valor classifica a amostra como potencialmente citotóxica ou livre de potencial citotóxico.

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como descrito acima, porém neste caso foram preparadas duas placas idênticas (controle e irradiada com UV). Após incubação por 1 h no escuro das duas placas com os extratos das macroalgas nas mesmas concentrações descritas acima, uma das placas foi irradiada com UVA (5 J.cm-2) por 50 min. As duas placas foram lavadas com tampão fosfato contendo cálcio e magnésio e após a adição de meio de cultura com 10 % de SFB foram deixadas para um período de recuperação de aproximadamente 12 h. No segundo dia de ensaio, as células são incubadas com o corante Neutral Red durante 3 h. Os procedimentos de lavagem do corante e de leitura em espectrofotômetro são os mesmos dos ensaios de citotoxicidade acima descritos. A razão entre o valor de IC50 sem exposição ao UV (IC50-UV) e de IC50

com exposição ao UV (IC50+UV) é igual ao Fator de Foto-Irritação (PIF), que

classifica a amostra como potencialmente fototóxica ou livre de potencial fototóxico:

UV IC UV IC PIF + − = 50 50 Equação 2

Quando PIF ≥ 5, a amostra é fototóxica. Caso não tenha sido obtido o valor de IC50 para citotoxicidade até a concentração máxima testada e em presença de UV

observou-se ação fototóxica, calcula-se IC50 e determina-se >PIF segundo a

equação: ) ( ) max( 50 UV IC UV C PIF + − = > Equação 3

onde Cmax é a máxima concentração testada na curva de citotoxicidade e IC50 (+UV)

Estes ensaios são procedimentos de padrão internacional (National Institute

of Health, 2001).

3.7.3. Testes de estabilidade Parâmetro: pH

As amostras foram preparadas na concentração de 0,1 mg. mL-1 em soluções de diferentes pHs (1-12). Para o acerto dos respectivos pHs, soluções de ácido clorídrico e hidróxido de sódio 0,1 mol.L-1 foram utilizadas. As leituras foram feitas utilizando cubetas de quarto em espectrofotômetro (UV-1650PC, Shimadzu) equipado com celas com controle de temperatura. A monitoração foi feita entre 200 e 400 nm a cada hora num período total de 6 h. Os experimentos foram feitos em triplicata e os resultados apresentados em função da absorvância versus comprimento de onda.

Parâmetro: Temperatura

Para estes ensaios os extratos foram preparadas diluindo 0,1 mg dos extratos em 1 mL de água (pH= 6,7; 0,01% em massa). As amostras foram mantidas a 20 °C, 50 °C, 70 °C e 90 °C e a monitoração foi feita a cada hora num período total de 6 h. Os parâmetros utilizados no espectrofotômetro foram os mesmos do citado anteriormente. Os resultados foram apresentados em função da absorvância em 327 nm versus área entre 290 e 360 nm.

3.7.4. Fator de Proteção Solar (FPS)

Nestes testes em colaboração com a Natura Indústria e Comércio de Cosméticos Ltda, o FPS foi medido em um espectrofotômetro com detecção via esfera de integração (SPF-290, Optometrics). A monitoração foi feita entre 290 e 400 nm e os dados foram acumulados em intervalos de 5 nm. Com os dados de

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transmitância, o programa calcula o valor de FPS da amostra. Embora estes dados

in vitro sejam uma estimativa das respostas in vivo, numa primeira etapa esta

ferramenta é importante para dar indícios do potencial de aplicabilidade do produto. Os extratos testados foram dissolvidos em etanol:água (2:1, v/v) na concentração de 6,6 mg.mL-1 (0,66% em massa) e aplicados em placas de polimetilmetacrilato formando um filme de espessura igual 10 µm (1 mg.cm-2). Após a secagem do filme (5 min), a placa foi posicionada no equipamento e as leituras de transmitância no intervalo entre 290 e 400 nm foram realizadas em triplicata para cada amostra. Antes de cada leitura foi lido um branco (placa+ etanol:água (2:1,v/v)) para o desconto dos valores de transmitância. Como parâmetro de comparação utilizou-se dois filtros solares sintéticos comercialmente empregados, metoxicinamato de 2-etil hexila (MCX, hidrofóbico, proteção UVB) e ácido sulfônico fenileno benzimidazol (ASB, hidrofílico, proteção UVB) além do produto Helioguard 365®.

Além das medidas feitas em placas de polimetilmetacrilato, o perfil de absorção no UV destas amostras foi monitorado em espectrofotômetro (UV-1650PC,

Shimadzu) entre 200 e 450 nm. Para as leituras, as amostras dos filtros sintéticos

foram diluídas 1000 vezes, enquanto as amostras do extrato de G. domingensis e do Helioguard 365®, 10 vezes. Os resultados foram apresentados em função da absorvância versus comprimento de onda.