Design Thinking prosess tilpasset eiendomsutvikling
2) Er det mulig å benytte design thinking som prosess i tidligfasen eller i andre faser av eiendomsutvikling, og i så tilfelle hvordan kan en slik prosess da brukes på best mulig måte?
A espectrometria de massas é uma técnica que teve seu nascimento no final do século XIX, quando o físico britânico Joseph John Thomson estudava os efeitos de descargas elétricas sobre gases utilizando o tubo de raios catódicos. Nos últimos anos, esta técnica passou a ser bastante empregada com o advento de novos
métodos de ionização, como eletrospray e MALDI, que permitiram a análise de substâncias não-voláteis e termossensíveis como proteínas. Estas descobertas renderam aos seus pesquisadores, Jonh Bennett Fenn e Koichi Tanaka o prêmio Nobel de 2002 em Química.
A espectrometria de massas é uma técnica analítica muito poderosa na caracterização estrutural de biomoléculas, sobretudo quando a quantidade de material obtido é escassa, uma vez que este tipo de análise apresenta maior sensibilidade que outros métodos de caracterização estrutural.
A análise por espectrometria de massas pode ser dividida em três principais estágios. As análises iniciam com a introdução da amostra (sólida, líquida ou gasosa), que pode ser feita diretamente (inserção direta) ou por meio de um sistema cromatográfico. Os analitos são convertidos a íons na fonte de ionização, por meio da perda ou do ganho de carga, da protonação ou desprotonação, da formação de adutos ou da ejeção de elétrons. Estes íons gerados são então separados de acordo com suas relações massa/carga (m/z) no analisador e suas intensidades relativas medidas no detector. Por último, a aquisição e o processamento dos dados geram os espectros de massas que são produzidos em função da intensidade de cada íon
versus sua razão m/z. Um esquema simplificado dos principais componentes de um
espectrômetro de massas é apresentado na Figura 7.
Figura 7. Esquema simplificado dos componentes principais de um espectrômetro de massas que indicam os modos de introdução da amostra, ionização e analisadores utilizados neste trabalho.
Introdução da amostra
Fonte
de ionização Analisador Detector
Controle e tratamento de dados
9 HPLC
9 Inserção direta 9 Electrospray
9 Triplo Quadrupolo 9FT-ICR 9Ion trap 9Q-TOF Introdução da amostra Fonte
de ionização Analisador Detector
Controle e tratamento de dados
9 HPLC
9 Inserção direta 9 Electrospray
9 Triplo Quadrupolo 9FT-ICR 9Ion trap 9Q-TOF
A análise por espectrometria de massas é baseada na relação massa-carga (m/z) e nas características físico-químicos das moléculas. Uma vez que este tipo de técnica permite apenas a detecção de moléculas eletronicamente carregadas, é necessária uma etapa de ionização dos analitos. Atualmente, existem diversos métodos de ionização, alguns apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 – Diferentes métodos de ionização para análises por espectrometria de massas.
Métodos de ionização Sigla
Ionização por elétrons EI (electron ionization)
Ionização química CI (chemical ionization)
Ionização por electrospray ESI (electrospray ionization)
Ionização química à pressão atmosférica APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
Ionização e dessorção por laser assistida por matriz
MALDI (matrix-assisted laser
(desorption Ionization)
Fotoionizacao à pressão atmosférica APPI (atmospheric pressure photoionization)
Ionização e dessorção por electrospray DESI (desorption electrospray ionization)
Plasma acoplado indutivamente ICP (inductively coupled plasma)
Nos experimentos com as MAAs foi utilizado ionização por electrospray (ESI). A ionização por electrospray ocorre à pressão atmosférica e, embora seja considerada uma fonte de ionização, na verdade é um processo de transferência de íons já presentes na fase aquosa para a fase gasosa.
Na ESI, uma solução contendo um analito atravessa um capilar mantido em alto potencial, que provoca a separação das cargas no solvente. Quando um potencial positivo, por exemplo, é aplicado na solução, os íons negativos são atraídos pela parede do capilar e os íons positivos tendem a se afastar para uma região menos repulsiva, resultando na formação de uma gota enriquecida em íons positivos. As diferenças de potenciais entre o capilar e o cone levam a uma deformação cônica da gota carregada positivamente (cone de Taylor - Cole, 1997).
A extremidade do capilar passa a desprender gotículas carregadas que sofrem evaporação durante a trajetória até o analisador. O aumento da densidade de carga na superfície leva a um aumento na repulsão entre os íons, que são então ejetados para a fase gasosa. Os íons em fase gasosa são atraídos para o analisador auxiliados pelos gradientes de potencial e de pressão. Neste processo são gerados principalmente moléculas protonadas ou desprotonadas ([M+H]+ ou [M-H]-) dependendo do sinal do potencial elétrico aplicado e ainda adutos por coordenação com íons presentes na solução ([M+Na]+, [M+K]+, [M+Cl]- etc) (Crotti et al., 2006a). A Figura 8 apresenta um esquema simplificado dos componentes presentes em uma fonte de ESI.
Figura 8. Esquema simplificado de uma fonte de ionização por electrospray. O analito é inserido no sistema por meio de um capilar (à esquerda). A diferença de potencial entre o capilar e o cone leva à formação de gotículas carregadas que sofrem evaporação. Adaptado de Gates et al., 2006.
Os íons produzidos na fonte de ionização são acelerados em direção ao analisador no qual uma combinação de campos magnéticos, campos elétricos e/ou radiofreqüência (RF) operam para separar os íons de acordo com suas razões m/z (Gates et al., 2006). Os analisadores podem ser de diversos tipos como setor magnético, quadrupolo (Q), tempo de vôo (TOF), Ion Trap e ressonância ciclotrônica de íons (FT-ICR). Análises em tandem MS são possíveis pela combinação destes analisadores, como no caso do Q-TOF e triplo quadrupolo, e em equipamentos do tipo
fluxo de N2(g) capilar capilar de transferência PRESSÃO ATMOSFÉRICA Bombeamento gotículas analito/solvente (spray) Cone para o analizador introdução analito/eluente fluxo de N2(g) capilar capilar de transferência PRESSÃO ATMOSFÉRICA Bombeamento gotículas analito/solvente (spray) Cone para o analizador fluxo de N2(g) capilar capilar de transferência PRESSÃO ATMOSFÉRICA Bombeamento gotículas analito/solvente (spray) Cone para o analizador introdução analito/eluente
Ion trap e FT-ICR. Os analisadores podem ser de baixa e alta resolução, dependendo
da capacidade de separação das m/z. Os de baixa resolução, como quadrupolo e Ion
trap, conseguem detectar m/z com diferenças de 1 unidade de massa atômica (u.m.a),
enquanto os de alta resolução, TOF e FT-ICR, permitem obter massas moleculares com exatidão.
O analisador do tipo quadrupolo consiste em quatro hastes paralelas nas quais os íons produzidos na fonte passarão pelo seu centro (Figura 9). As hastes são conectadas em pares opostos; em um dos pares é aplicada uma voltagem de RF, e no outro, uma de corrente direta (DC). A movimentação dos íons dependerá do potencial elétrico, sendo que, para cada combinação de RF e DC, apenas íons de determinada
m/z entrarão em ressonância e passarão para o detector. Os demais íons gerados
serão desviados da trajetória principal e eliminados durante o percurso até o detector. Além disto, ao variar o potencial elétrico em um quadrupolo, pode-se variar a faixa da relação m/z transmitida, possibilitando uma varredura espectral. A Figura 9 apresenta um esquema simplificado de um analisador do tipo quadrupolo.
Figura 9. Esquema simplificado do analisador do tipo quadrupolo (adaptado de Gates, 2007).
hastes do quadrupólo íon ressonante (detectado) íon não-ressonante (não detectado) fenda de saída fenda de entrada ÍONS DETECTOR hastes do quadrupólo íon ressonante (detectado) íon não-ressonante (não detectado) fenda de saída fenda de entrada ÍONS DETECTOR
Alguns instrumentos comerciais são equipados com três quadrupolos (QqQ) seqüenciais, permitindo análises em tandem MS, que geralmente são do tipo MS/MS ou MS2. Nos triplos quadrupolos, o primeiro (Q1) e o terceiro quadrupolos (Q3) são utilizados para selecionar um ou vários íons ou varrer um determinado intervalo de
m/z. O segundo quadrupolo (q2) na verdade é uma câmara de colisão preenchida
por um gás inerte, como hélio, argônio ou nitrogênio.
Existem diferentes modos de varredura que podem ser realizados num triplo quadrupolo. O mais comum é a varredura dos produtos de dissociação. Neste modo de aquisição, o íon de interesse é selecionado no Q1 e transferido para a câmara de colisão. No q2 (câmara de colisão), interage com as moléculas de gás, sofrendo fragmentação por meio de um processo denominado dissociação induzida por colisão (collision-induced dissociation, CID). Os íons produtos gerados são separados no Q3 e posteriormente detectados. Na aquisição por varredura do íon
precursor, o Q3 é ajustado para selecionar um único íon produto, sendo que o Q1
varre um intervalo de m/z que pode ter gerado este específico íon produto. Outro modo de operação é a varredura de perda neutra. Nesta aquisição, tanto o Q1 como o Q3 varrem intervalos de m/z que permitem adquirir espectros de íons precursores correspondentes à perda de massa de um fragmento neutro considerado. Este tipo de análise é bastante empregada para compostos que apresentam perdas característica de um mesmo grupamento químico, como as MAAs.
Análises por MS2 apresentam duas grandes vantagens: o aumento de sensibilidade e da seletividade quando comparado à espectrometria de massas clássica. O aumento da sensibilidade está relacionado à diminuição do ruído químico provocado por outros componentes da amostra analisada. A seleção dos íons e a
possibilidade de seleção de um determinado íon levam a um ganho na relação sinal/ruído. A seletividade acontece pelo fato de a probabilidade de duas moléculas gerarem íons precursores e íons produtos idênticos por MS2 ser muito baixa (Carvalho, 2001). Em análises quantitativas, um modo de aquisição bastante sensível e seletivo é o monitoramento de reações múltiplas (MRM). Nesta aquisição, os dois quadrupolos Q1 e Q3 são programados para selecionar a passagem de massas fixas. Diferentemente da varredura dos produtos de dissociação, o Q3 não efetua uma varredura dos íons produtos, mas seleciona m/z específicos gerados na câmara de colisão otimizada para a produção do(s) mesmo(s).
Os analisadores do tipo Ion Trap são instrumentos compactos e relativamente baratos que possuem uma configuração tridimensional do analisador do tipo quadrupolo. Um esquema do analisador Ion Trap é apresentado na Figura 10.
Figura 10. Esquema de um analisador Ion trap (adpatado de Gates, 2007).
Nestes analisadores, potenciais RF e DC são aplicados aos eletrodos para criar um campo elétrico similar ao do analisador quadrupolar. Todavia, o modo de operação é diferente, uma vez que no analisador linear do tipo quadrupolo os íons passam pelos quadrupolos em direção ao detector, e no Ion Trap os íons são aprisionados e focalizados em órbitas próximas ao centro do analisador. Os
ÍONS ÍONS eletrodo de saída eletrodo de saída lente de saída espaçadores eletrodos focalizador contenção de íons ÍONS ÍONS eletrodo de saída eletrodo de saída lente de saída espaçadores eletrodos focalizador contenção de íons
espectros de massas são adquiridos aplicando-se diferentes voltagens de RF e DC que desestabilizam os íons e resultam na ejeção seqüencial de íons de valores menores a maiores de m/z. Este analisador permite ainda aprisionar íons específicos e realizar experimentos em tandem MS. Neste caso, a aplicação de um potencial aumenta a energia cinética do íon selecionado, levando à sua fragmentação pela colisão com os átomos de gás hélio presente na armadilha. Como estas etapas de fragmentação são realizadas num mesmo espaço físico, é possível adquirir espectros de MSn.
O analisador do tipo tempo de vôo (TOF) possui múltiplas vantagens, entre elas a sensibilidade, a faixa de massas que podem ser detectadas e a rapidez na aquisição dos dados, que possibilitam maior número de análises. Os íons provenientes da fonte de ionização ou de um primeiro analisador (como no caso do
Q-TOF) são acelerados por um potencial elétrico, resultando numa mesma energia
cinética inicial para todos. Como suas velocidades são inversamente proporcionais às raízes quadradas de suas massas, os íons mais leves de alta velocidade chegam ao detector antes que os íons mais pesados de baixa velocidade. Com este mecanismo de análise, o instrumento detecta todos os íons de acordo com suas chegadas, conferindo a esta técnica alta sensibilidade (Van Bramer, 1998; Crotii et
al., 2006b). Um esquema simplificado do analisador TOF é apresentado na Figura
Figura 11. Esquema de um analisador TOF (adaptado de Gates, 2007).
A ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (Fourier
Transform/Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR) é o mais complexo método de
análises por massas. Atualmente, é a técnica mais sensível e exata para detecção de um íon, que permite analisar massas com alta precisão e realizar experimentos em tandem MS. No FT-ICR, os íons gerados na fonte passam em seguida por diversos estágios em que há um aumento gradativo de vácuo. A separação dos íons depende do campo magnético dentro da célula, gerado por um imã supercondutor. Quando os íons passam por este campo magnético, são direcionados para um movimento circular perpendicular ao plano do campo que dependem de suas relações m/z. A excitação de cada íon é alcançada por uma varredura de voltagens RF por meio dos eletrodos transmissores. Com a aplicação da freqüência, o íon absorve energia, mudando sua velocidade e seu raio de órbita. Esta oscilação é detectada pelos eletrodos receptores, produzindo uma corrente de freqüência igual à do íon. A tradução desses sinais pelo método da transformada de Fourier converte as freqüências em valores de m/z (Van Bramer, 1998). Um esquema simplificado do analisador FT-ICR é apresentado na Figura 12.
Detector Linear Reflectron Íons vácuo Fonte Detector Reflectron Detector Linear Reflectron Íons vácuo Fonte Detector Reflectron
Figura 12. Esquema simplificado de um analisador FT-ICR.
No estudo das MAAs, a espectrometria de massas vem sendo utilizada nos últimos anos (Whitehead et al., 2001; Whitehead & Hedges, 2002, 2003; Volkmann & Gorbushina, 2006, Volkmann et al., 2006). Whitehead e colaboradores foram os primeiros pesquisadores a utilizar esta técnica acoplada a HPLC na caracterização e quantificação de MAAs em fitoplâncton (Whitehead et al., 2001). Empregando ESI no modo positivo e analisador do tipo quadrupolo eles desenvolveram um método de quantificação para 7 MAAs utilizando o íon precursor [M+H]+ (Whitehead & Hedges, 2002). Outros trabalhos envolvendo caracterização destes compostos mostraram que as MAAs apresentam perfis de fragmentação em comum que podem ser utilizados para a varredura de novas MAAs em diferentes organismos aquáticos (Whitehead & Hedges 2003). Na Tabela 3 são apresentados algumas parâmetros físico-químicos de algumas MAAs identificadas em diferentes organismos aquáticos, bem como os principais fragmentos gerados por análises por ESI-MS2.
Tabela 3 – Comprimento de onda máximo (λmax), coeficiente de extinção molar (ε),massa molecular (MM) e principais fragmentos obtidos por ESI-MS 2 de diferentes MAAs. MAAs λ max (nm) ε (M -1
cm-1) MM (g.mol-1) Íon precursor e principais fragmentos Referência
Z-ácido palitênico 337 29200 328 [M+H] + 329, 314, 296, 283, 268, 251, 241, 237, 225, 197, 193, 182, 175, 150, 138 Whitehead et al, 2001 asterina 330 43800 288 [M+H]+ 289, 273, 243, 230, 213, 199, 197, 186, 168, 150, 137 289, 274, 230, 212, 197, 186,168, 150, 137 Whitehead et al., 2001 nesta tese chinorina 333 44668 332 [M+H]+ 333, 255, 241, 230, 211, 197, 186, 185, 168, 137 333, 318, 274, 230, 212, 186 Whitehead et al., 2001 nesta tese
dehidroxiusujireno 356 267 [M+H]+ 268, 224, 209 Zhang et al., 2007
euhalothece 362 362 330 [M+H]+ 331, 316, 272, 242, 228, 213 Volkmann et al., 2006
M-320 320 559 [M+H]
+
560
[M-H]- 558 Carreto et al., 2001
M-335/360 335 (360) 598 [M-H]- 597 Carreto et al., 2001
metil éster chinorina 333 346 [M+H]
+
347
[M+H]+ 347, 332, 317, 288, 270, 244, 229
Carreto et al., 2001 nesta tese
micosp. metilamino-serina 325 16600 288 [M+H]+ 289, 274 Teai et al., 1997
micosp. metilamino-treonina 330 33000 302 [M+H]+ 303 Wu Won et al., 1997
micosporina-2-glicina 332 302 [M+H]+ 303, 288, 244, 200, 185, 164, 151 Volkmann et al., 2006
micosporina-glicina 310 28800 245 [M+H]+ 246, 228, 210, 200, 182, 168, 146 nesta tese
micosporina-taurina 309 295 [M+H]+ 296 Stochaj et al., 1994
palitene 360 50000 284 [M+H]+ 285, 241, 223, 205, 197, 195, 193, 179, 166, 149, 137 285, 270, 241, 226, 197 Whitehead et al., 2001 nesta tese palitina 320 36200 244 [M+H]+ 245, 230, 209, 199, 186, 184, 162, 155, 150, 137 245, 230, 227, 209, 186, 150, 137 Whitehead et al., 2001 nesta tese
palitina-serina 320 10500 274 [M+H]+ 275, 260 Teai et al., 1997
palitina-treonina 320 288 [M+H]+ 289, 274, 245, 230, 169, 151 nesta tese
palitina-serina sulfato 321 353 ESI modo negativo Wu Won et al, 1997
palitina-treonina sulfato 321 367 ESI modo negativo Wu Won et al, 1997
palitinol 332 43500 302 [M+H]+ 303, 288, 243, 231, 199, 197, 186, 168, 150, 137 303, 288, 244, 235, 230, 226, 197, 186,168, 151, 150, 138, 137 Whitehead et al., 2001 nesta tese porphyra-334 334 42300 346 [M+H]+ 347, 303, 243, 200, 197, 186, 185, 168, 151, 137 [M+H]+ 347, 332, 303, 288, 227, 186 Whitehead et al., 2001 nesta tese usujirene 357 284 [M+H] + 285 285, 270, 241, 226, 197 Sekikawa et al., 1986 nesta tese