Effects of Recent Developments on Wholesale Prices & Producers

3.1. Veneno, animais, reagentes e espécimes

O veneno da espécie de serpente, Crotalus durissus terrificus, utilizado neste estudo foi doado pelo Instituto Butantan. Os solventes e reagentes químicos usados para as extrações dos polissacarídeos sulfatados e da PLA2 e as soluções utilizadas para o HPLC foram adquiridos pelas empresas Sigma-Aldrich, Merck (USA) e Bio-Rad (USA). Os camundongos utilizados para os testes farmacológicos foram comprados do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica – CEMIB – da Universidade de Campinas (UNICAMP). O número do Comitê de Ética é 2898-1 e, o esforço para a realização dos testes in vivo contou com a ajuda do aluno de Mestrado Marcus Vinicius Terashima de Pinho do Instituto de Farmacologia da UNICAMP. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Campinas. As algas Solieria filiformis (Sf), Botryocladia occidentalis (Bo), Caulerpa racemosa (Cr), Gracilaria caudata (Gc) e Codium isthmocladum (Ci) foram coletadas na cidade de Fortaleza – CE – durante a estação do verão. As exsicatas das macroalgas se encontram depositadas no Herbário de Ficologia do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do Ceará – UFC e o número é 2385, tombado pelo Prof. Dr. Wladimir Ronald Lobo Farias.

3.2. Extração de polissacarídeos sulfatados de macroalgas

As macroalgas passaram por um processo de lavagem e remoção da fauna associada e, posteriormente, acondicionada em bandejas para a secagem em estufa à 60ºC. Secas e trituradas (5 g) foram hidratadas em 250 mL de solução tampão acetato de sódio 0,1 M, em pH 5,0 + cisteína 5 mM e EDTA 5 mM. Em seguida, adicionou-se 17 mL de solução de papaína bruta (30 mg/mL) e os frascos contendo as algas hidratadas foram levadas ao banho-maria na temperatura de 60°C por 24 horas. Em seguida, o material foi submetido ao processo de filtração e centrifugação (14.000 r.p.m.; 3 min, 4°C). Ao sobrenadante, adicionou-se 16 mL de cloreto de cetilpiridínium (CPC) a 10% para a precipitação dos açucares presentes na mistura em temperatura ambiente por 24 horas. Transcorrido este tempo, os polissacarídeos sulfatados foram lavados com 500 mL de CPC 0,05% e, depois, dissolvidos em 174 mL de cloreto de sódio 2M:etanol absoluto (100:15; v:v) em banho-maria a 60°C, sendo submetidos a uma nova

precipitação (24h, 4°C) pela adição de 305 mL de etanol absoluto. O material foi centrifugado novamente e submetido a duas lavagens com etanol 80 % (500 mL) e etanol absoluto a -10ºC. Após esse processo, os açucares foram levados à estufa (60°C, 24 h) para secagem e obtenção do extrato bruto de polissacarídeo sulfatado. A purificação dos extratos brutos obtidos foi feita em resina de DEAE-Celulose, primeiramente, equilibrada com tampão acetato de sódio 0,1M, pH 5,0 + cisteína 5 mM e EDTA 5 mM. Após o equilíbrio da coluna, 200 mg de extrato bruto foi adicionado e os polissacarídeos sulfatados contidos na resina de troca-iônica são eluidos em solução de NaCl 1,5 M. A presença dos polissacarídeos sulfatados é evidenciada através da reação metacromazia sendo que para isso uma alíquota de 200 µL foi misturada a 1 mL de azul- dimetil-dimetileno (DMB) para ser feita a absorbância em espectrofotômetro em 525 nm.

3.3. Purificação dos polissacarídeos sulfatados das macroalgas

Depois da cromatografia de troca iônica, foi realizada a purificação através da cromatografia com coluna de exclusão molecular. Para esta etapa foi utilizado HPLC modelo da fabricante Jasco, com bomba modelo PU-2080, Software Chronav, injetor Rheodyne equipado com um loop de 20 µl. O sistema do HPLC é sequencial e apresenta os detectores de fluorescência (FP-2020), Dicroismo Circular (MD-2015/2018) e um evaporador (ELC-2041 evaporative light scattering). Amostras da primeira cromatografia foram dissolvidas em Tris – HCl (1 M, pH 7.8), e a solução resultando foi centrifugada em 4,500 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi injetado no HPLC com a coluna de exclusão molecular TSKgel G3000SWXL (0.78 x 30 cm), que foi previamente equilibrada com amostras diluídas do tampão. A corrida foi realizada com fluco de 1 mL/min e a coluna estava acoplada aos detectores de Espalhamento de Luz (LS), ultravioleta (UV) e fluorescência (FL). Este tipo de acoplamento em série possibilita a determinação da massa molecular de proteínas e seus complexos proteicos na solução. Nós utilizamos como marcadores de massa molecular o Azul de Blue Dextran (AB, 2000 kDa), β- amilase (BA, 225 kDa), Albumina Sérica Bovina (BSA, Sigma, 66 kDa) que forma dímero natural de 120 kDa, Ovalbumina (OVA, 43 kDa), Anidrase Carbônica (CA, 29 kDa), Ribonuclease (RA, 14 kDa). Estas colunas de TSK gel podem ser utilizadas para a caracterização de proteínas e outras moléculas como polissacarídeos, carboidratos e oligossacarídeos. A massa molecular estimada do polissacarídeo sulfatado foi feita utilizando o BA, BSA, OVA, CA, RA. Todas as amostras foram submetidas à análise sob as mesmas condições de cromatografia, tampão, fluxo e coluna. Para monitorar a eluição da proteína, foi utilizado o comprimento de onda em 280nm.

3.4. Purificação e isolamento da sPLA2 3.4.1. HPLC de Fase Reversa

Para a obtenção da PLA2, o veneno total da C. d. terrificus foi submetido à Cromatografia de Fase Reversa. O sistema cromatográfico utilizado foi Jasco PU-8020Plus equipado com detector de ultravioleta cujo comprimento de onda utilizado foi 280nm. O sistema de cromatografia é equipado com injetor de 200 uL e a coluna utilizada foi BIO Wide Pore C5, 5 cm x 10 mm, 10 um previamente equilibrada com TFA (ácido trifluoroacético) 0,1%, pH 3,5. A eluição das amostras foi realizada usando um gradiente linear com Acetonitrila 66%.

3.4.2. Cromatografia de exclusão molecular

A amostra de PLA2 proveniente da purificação do veneno total foi repurificada em uma coluna de exclusão molecular para a separação das partes ácidas e básicas da PLA2. A coluna utilizada foi a TSKgel G3000SWXL (0.78 x 30 cm).

3.4.3. Eletroforese em PAGE-SDS

As placas de poliacrilamida foram feitas de modo descontínuo, apresentando um gel de concentração de 5% e um gel de corrida de 12,5%. As placas foram preparadas utilizando-se uma solução de acrilamida estoque (30%T, 0,8%C). O gel de concentração 5% foi preparado utilizando-se o tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8. O gel de corrida foi feito utilizando-se o tampão Tris-HCl 1,0 M, pH 8,8. Em ambos os géis foram acrescentados 0,1% (v/v) de SDS 20%. A eletroforese PAGE-SDS foi realizada em um sistema duplo de mini placas SE 250 Mighty Small II (Hoefer Scientific Instruments). As amostras e os marcadores de peso molecular foram dissolvidos em tampão de amostra (Tris-HCl, 0,075M, pH 6,8; 10% de Glicerol; 4% de SDS; 0,001% de Bromofenol). A corrida eletroforética foi realizada a 40 mA. Os géis foram corados com solução de Coomassie Blue 0,05% a 37ºC.

3.5. Caracterização dos parâmetros cinéticos da sPLA2

A incubação da enzima em presença do substrato foi realizada em diferentes tempos, variando de 10 minutos a 40 minutos, ou seja, ao final de 10 minutos foi feita uma leitura. 1 mg de PLA2 purificada foi dissolvida em 1 mL de salina e o 4N3OBA (BIOMOL Internatonal) foi dissolvido em acetronitrila 100% com diferentes concentrações tais como 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3

mg/mL e 4 mg/mL. Na Placa de ELISA, a sequencia de pipetagem foi da seguinte forma, a solução tampão, o substrato e PLA2, com seus respectivos volumes, 100 uL, 30 uL e 30 uL. Ao fim deste tempo estas amostras foram lidas em um espectrofotômetro para leitura UV-VIS a 450nm em um leitor de microplacas SPECTRA MAX (Molecular Devices, CA).

3.6. Incubação da sPLA2 com polissacarídeos sulfatados

Os polissacarídeos sulfatados de algas foram dissolvidos em salina 0.9%. As amostras de sPLA2 foram incubadas com igual concentração (1 mg/mL) dos compostos por 20 minutos a uma temperatura de 37ºC, após este tempo o excesso de reagente foi removido por técnicas de ultrafiltração.

3.7. Determinação da atividade sPLA2 e polissacarídeos sulfatados

Para verificar atividade enzimática foi utilizado substrato 4N3OBA (BIOMOL Internatonal) na concentração de 2 mg/mL. As amostras de PLA2 e PS foram incubadas junto com o substrato e tampão Tris-HCl, pH 8.0, Cálcio por 20min. Ao fim deste tempo estas amostras foram lidas em um espectrofotômetro para leitura UV-VIS a 450nm em um leitor de microplacas SPECTRA MAX (Molecular Devices, CA).

3.8. Caracterização espectroscópica do PS, sPLA2 e sPLA2:PS

As amostras de sPLA2, PS e o produto da incubação (sPLA2:PS) foram submetidas à cromatografia de exclusão molecular TSKgel G3000SWXL (0.78 x 30 cm), devidamente equilibrada antes de qualquer injeção de amostra com o tampão Tris-HCl (pH 8, 0,1M) com volume de 0,5 mL/min, durante 60 minutos. O sistema se encontra acoplado com detectores de DC, LS, FL e PDA. Para a caracterização molecular do complexo sPLA2:PS, a molécula de maior massa foi primeiramente injetada, isto é, Azul de Dextran. Moléculas de elevado peso são as primeiras a sair pela coluna e, por isso, determinando o volume inicial (Vo) que representa o volume do espaço intersticial, ou seja, espaço existente fora dos poros da coluna. Em seguida, o mesmo foi feito com a solução contendo BSA, que apresenta peso molecular menor que AD. Além disso, foram injetadas na coluna, soluções contendo OVA, AC, RA, sendo que todas contêm pesos moleculares distintos para a realização da curva de peso molecular através destes marcadores. Foi injetada, posteriormente, a solução contendo polissacarídeo sulfatado para a determinação do seu peso molecular e do complexo com a PLA2.

3.9. Caracterização farmacológica e biológica sPLA2:PS, PS e sPLA2 3.9.1. Edema de pata

Para a determinação da atividade edematogênica das sPLA2, se estabeleceu a cinética edematogênica, onde os grupos de camundongos albinos, não isogênicos, pesando 25 g, recebem injetação no coxin da pata direita (experimental), com 25 L da solução de sPLA2 diluído em salina estéril 0,9%, PS, PLA2:PS e salina como controle. Estes ensaios serão medidos em intervalos de 15min, 30min, 60min, 120min, 180min e 240 min. Todas as drogas utilizadas serão dissolvidas em solução salina estéril (0,9%). O volume da pata será medido antes das injeções e após intervalos de tempo pré-estabelecido, utilizando-se um hidropletismógrafo (modelo 7150, Ugo Basile, Itália). Para cada grupo foram utilizados cinco indivíduos. Os resultados são expressos como aumento do volume da pata (mL), calculado por subtração do volume basal. Em alguns casos, a área sob a curva (AUC) da formação de edema contra o tempo (mL x min) será calculada usando o método trapezoidal. Além disso, foi adotado outro procedimento para o teste de edema de pata onde o PS foi injetado via peritonial 30 minutos antes da injeção de PLA2 na pata, para medir a possível ação anti-inflamatória do composto.

3.9.2. Atividade miotóxica - Determinação de CK

Para determinação dos níveis séricos de Creatinina Quinase (CK) será utilizado o CK- NAC Método Cinético – UV da Laborlab tanto nos animais tratados com as frações bem como nos animais controle. Serão utilizados cinco animais para cada grupo, sendo eles, o grupo controle, o PS, a PLA2, e o produto da incubação de PS com PLA2 (PLA2:PS). Os animais pesaram entre 20 a 25 g que foram inoculados intramuscularmente com 25,0 L. A injeção da solução foi no músculo gastrocnemius direito, e após duas horas o sangue dos animais foi coletado da extremidade caudal. Os animais controle (n = 5) foram submetidos ao mesmo procedimento dos animais tratados, somente inoculados com 25,0 l de salina. As leituras (a 365nm) foram realizadas em intervalos de 1 minuto. A atividade foi expressa como unidade por litro (U/L).