Trypanosoma cruzi
Investigar as causas da avirulência das formas metacíclicas do clone CL-14, em comparação com a cepa CL, com foco no papel da gp82 de superfície.
Capítulo 2 – Expressão e localização celular de moléculas da família gp82 em formas metacíclicas do Trypanosoma cruzi
Caracterizar o repertório das moléculas gp82 expressas nas formas metacíclicas através da análise da expressão e localização celular nas duas cepas filogeneticamente distintas, G e CL.
Capítulo 3 – Indução de apoptose em células de melanoma pela gp82 em sua forma recombinante
Investigar o efeito pró-apoptótico da proteína gp82 do T. cruzi, em sua forma recombinante (J18), sobre as células do melanoma Tm5 e sobre a linhagem de melanócitos melan-a.
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Capítulo 1
Bases moleculares da avirulência do clone
CL-14 do Trypanosoma cruzi
Artigo:
“Molecular basis of non-virulence of Trypanosoma cruzi clone CL-14”
Atayde, V., Neira, I., Cortez, M., Ferreira, D., Freymüller, E., Yoshida, N. International J. Parasitology, 2004, 34: 851-860
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As formas metacíclicas da cepa CL (Brener & Chiari, 1963), que utilizam a gp82 de superfície na invasão celular, são altamente infectivas in vitro e in vivo (Ruiz et al., 1998, Neira et al., 2003). Em contraste, as formas metacíclicas do clone CL-14, derivado da cepa CL (Chiari, 1981), não produzem infecção patente mesmo quando inoculadas em camundongos recém–nascidos (Lima et al., 1990). No entanto, elicitam mecanismos imunológicos protetores contra desafios letais com formas sanguíneas de cepas virulentas (Lima et al., 1990, Paiva et al., 1999). É possível que a manutenção do clone CL-14 em culturas axênicas por longos períodos tenha contribuído para a sua atenuação (Lima et al., 1990).
Nosso principal objetivo foi determinar os fatores associados com a baixa infectividade do clone CL-14. A invasão celular in vitro com formas metacíclicas desse isolado é possível e foi utilizada em nosso estudo, sempre em comparação com a cepa parental, CL (Fig.15). Os resultados mostraram que a reduzida capacidade de invasão do clone CL-14 está associada com a baixa expressão da gp82 em sua superfície e que, aparentemente, utiliza a gp35/50 para a sua internalização. Esses dados reforçam a importância da gp82 da superfície das formas metacíclicas no processo de invasão celular.
CL-14
CL
Figura 15. Invasão celular in vitro por formas metacíclicas da cepa CL e do clone CL-14. Notar a reduzida quantidade de parasitas do clone CL-14 (Giemsa, 1000x).
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Experimentos complementares:
Imagens de células HeLa contendo amastigotas da cepa CL e do clone CL-14 do T. cruzi
A figura 1C do artigo mostra que o clone CL-14 não é capaz de se replicar intracelularmente. Em ensaios mantidos por 72 horas após a invasão com as formas metacíclicas, quase não foram encontrados amastigotas intracelulares do clone CL-14. No caso da cepa CL, muitas células foram encontradas contendo um grande número de amastigotas. Na figura 16, apresentamos imagens que ilustram essa observação.
Figura 16. Replicação intracelular da cepa CL e do clone CL-14 (Giemsa, 1000x).
Níveis “steady-state” dos transcritos gp82 da cepa CL e do clone CL-14 do T. cruzi
Os níveis “steady-state” dos transcritos gp82 de formas metacíclicas da cepa CL e do clone CL-14 foram analisados por “northern blot”. O RNA total extraído dos parasitas foi hibridizado com a sonda J18, produzida a partir de um fragmento de cDNA que contém a fase de leitura aberta do gene gp82, mesma sonda utilizada para as análises de “southern blot” do artigo. Em ambos, foi revelado um fragmento de aproximadamente 2.4 Kb (Fig.17). Esse
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resultado corrobora os dados do artigo que mostram que o clone CL-14, apesar de não expressar a gp82 na superfície, contém a molécula intracelular.
Figura 17. Níveis “steady-state” dos transcritos gp82 da cepa CL e do clone CL- 14 do T. cruzi. (A) Formas metacíclicas (1 x 108) foram ressuspendidas em 1 ml de
Trizol (Invitrogen). Após a homogeneização, foram adicionados 200 l de clorofórmio e a amostra foi centrifugada a 10.800 rpm, 15 min. À fase aquosa, foram adicionados 500 l de isopropanol. Em seguida, a amostra foi centrifugada, lavada com etanol 70% e depois de seca, ressuspendida em água com dietilpirocarbonato a 0.05%. Quantidades de RNA (~8 g) extraído foram desnaturadas a 70oC por 15 min em
tampão de amostra (50 l de MOPS 10X (MOPS 41.6g/l, acetato de sódio 6.76g/l, EDTA 2.72g/l, pH 7.0), 90 l de formaldeído 37%, 250 l de formamida e 2 l de solução de azul de bromofenol 0.01% em MOPS 1X). Após a desnaturação, as amostras foram mantidas em gelo e momentos antes da aplicação no gel (1% agarose, 10% formaldeído em MOPS 1X) foram adicionados 1.5 l de brometo de etídio. (B) Para análise por “northern blot”, após a eletroforese, o RNA do gel foi transferido à membrana e em seguida ligado covalentemente ao nylon através da exposição à luz UV (150 mJ), no sistema GS Gene Linker UV Chamber (Bio-Rad). Em seguida, a membrana foi hibridizada com a sonda J18. Sonda α-tubulina foi utilizada como controle positivo do experimento. Após a hibridização, a membrana foi exposta em filme de raio-X por 72 horas a -70oC. Os números à esquerda indicam tamanhos
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Capítulo 2
Expressão e localização celular de moléculas
da família gp82 em formas metacíclicas
do Trypanosoma cruzi
Artigo:
“Expression and cellular localization of molecules of the gp82 family in Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes”
Atayde, V., Cortez, M., Souza, R., Franco da Silveira, J., Yoshida, N. Infection and Immunity, 2007, 75: 3264-3270
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Pelo menos 50% do genoma do T. cruzi é composto por seqüências repetidas, que podem ser retrotransposons, repetições subteloméricas ou seqüências pertencentes às famílias que codificam proteínas de superfície. Essas famílias multigênicas (MASP, trans-sialidases, mucinas e proteases gp63), representam aproximadamente 18% dos 22.570 genes codificadores de proteínas do parasita (El-Sayed et al., 2005).
O T. cruzi apresenta em seu genoma aproximadamente 60 cópias de seqüências homólogas ao gene gp82, formando a família gênica gp82 (Araya et al., 1994). Essa família é parte da grande família gp85/trans-sialidase, composta por 1430 genes, representando aproximadamente 6% dos genes codificadores do parasita (El-Sayed et al., 2005). Através da análise da estrutura e expressão de genes da família gp82, Songthamwat et al. (2007) identificaram três subfamílias gênicas gp82, com expressão de RNA mensageiro (mRNA) estágio-específica nas formas metacíclicas.
A gp82 apresenta 53.3% de identidade de aminoácidos com a gp85, molécula envolvida na invasão das formas TCT que contém sítios de ligação à laminina e à citoqueratina 18 (Giordano et al., 1999, Magdesian et al., 2001). As regiões de homologia incluem os motivos Asp (SXDXGXTW), descritos nas neuraminidases bacterianas, e o motivo VTV (VTVXNVFLYNR), específico do T. cruzi, ambos característicos da família gp85/trans -sialidase (Crennell et al., 1993, Cross & Takle, 1993, Frasch, 2000) (Fig.18). Apenas 25% da família conservam o motivo VTV, provavelmente devido à forte pressão seletiva sobre seus membros, que são alvos do sistema imune tanto por respostas humorais como celulares (El-Sayed et al., 2005, Tzelepis et al., 2008). No extremo final das duas seqüências há uma região hidrofóbica que é sinal para adição de âncora GPI (Araya et al., 1994, Giordano et al., 1999) (Fig.18).
Duas moléculas gp82 de superfície, reativas com o MAb 3F6, foram caracterizadas a partir de clones de cDNA das cepas G (J18) e CL (R31). J18 e R31 possuem identidade de 97,9% entre suas seqüências peptídicas (Araya et al., 1994, Ruiz, 1998, Yoshida et al., 2006).
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Figura 18. Alinhamento das seqüências de aminoácidos da gp85 (clone Tc85-11, GeneBank AAD13347.1) e da gp82 (clone J18, GeneBank AAA21303). Preto:
representa 100% de identidade, amarelo: motivos Asp, rosa: motivo VTV, verde: sinal de âncora GPI. No caso da gp82, o motivo VTV é subterminal e é detectado um terceiro motivo Asp degenerado.
O clone J18 contém 2.139 pb e sua fase de leitura aberta (ORF) vai do nucleotídeo 231 (ATG) ao 1779 (TGA), contendo 1548 nucleotídeos (Araya et al., 1994). Codifica um polipeptídeo de 516 aminoácidos com massa molecular de 55,6 KDa, menor do que a massa de 70 kDa do polipeptídeo sem os oligossacarídeos N-ligados, precursor da gp82 (Ramirez et al., 1993). Para tentar explicar essa discrepância, uma análise computacional apontou a
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existência de diversos sítios de miristoilação, além dos sítios de N-glicosilação. O tamanho dos mRNA transcritos a partir do gene gp82 foram compatíveis com o da ORF clonada (Araya et al., 1994). Já o clone R31 contém 2.150 pb e sua ORF vai do nucleotídeo 190 (ATG) ao 1786 (TGA), contendo 1596 nucleotídeos (Ruiz, 1998). Anterior à ORF há ainda 77 aminoácidos em fase de leitura, sugerindo que a metionina encontrada pode não ser a primeira e que, parte da região N-terminal da seqüência foi perdida. Sendo assim, R31 pode ser considerado outro membro da família gp82 de maior tamanho em comparação ao J18 (Ruiz, 1998).
Utilizando peptídeos sintéticos baseados na seqüência do clone J18, Manque et al. (2000) mapearam o epítopo do MAb 3F6 (P3, 244-263) e o sítio de adesão à célula hospedeira da gp82 de superfície, ambos presentes na região do domínio central da molécula. O sítio de adesão celular é composto pela justaposição de duas seqüências de aminoácidos separadas por outra altamente hidrofóbica, e sobrepõe-se parcialmente ao epítopo do MAb 3F6 (P4, 254-273 e P8, 294-313) (Fig.19). Isso explica o fato desse anticorpo inibir a invasão in vitro e in vivo de formas metacíclicas de cepas que utilizam preferencialmente a gp82 (Ramirez et al., 1993). J18 e R31 possuem 100% de identidade na seqüência de aminoácidos da região do sitio de adesão à célula hospedeira (Yoshida, 2006).
Figura 19. Representação esquemática da gp82 de superfície de formas metacíclicas do T. cruzi (clone J18).
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Baseando-se na existência da família gênica gp82, nosso objetivo foi caracterizar o repertório das moléculas gp82 expressas nas formas metacíclicas, através da análise da expressão e localização celular nas cepas G e CL. Para isso, clonamos um novo membro da família que, em contraste com J18, não possui o epítopo do MAb 3F6, que caracteriza as moléculas gp82 de superfície. Os dados desse estudo mostraram que moléculas pertencentes à família gp82 não são expressas somente na superfície das formas metacíclicas, sugerindo outras funções além da adesão celular. Além disso, observamos que a cepa G, juntamente com outras cepas do grupo T. cruzi I, possui um conjunto de moléculas gp82 intraflagelares.
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Experimentos complementares:
Análise da expressão de moléculas da família gp82 em formas metacíclicas das cepas G e CL
Utilizando os anticorpos policlonais contra as proteínas recombinantes J18 e C03, contendo ou não o epítopo do MAb 3F6, respectivamente, analisamos os extratos de formas metacíclicas das cepas G e CL por “immunoblot”. Na cepa CL, uma única banda foi detectada pelo MAb 3F6, enquanto os anticorpos policlonais anti-J18 e anti-C03 reconheceram bandas duplas (Fig.20A). Em “immunoblot” bidimensional, as moléculas reativas com o MAb 3F6 focalizaram em pH 4.6 a 5.1 e as moléculas reativas com os anticorpos anti-J18 e anti-C03, em pH 4.6 a 5.4 (Fig.20B). Na cepa G, ao menos duas bandas foram reconhecidas por cada anticorpo (Fig.21A). Em “immunoblot” bidimensional, as proteínas da família gp82 reativas com o MAb 3F6 ou com o anticorpo anti-J18, focalizaram em pH 4.9 a 5.7, e aquelas reativas com o anticorpo anti-C03 focalizaram em pH 4.9 a 5.5 (Fig.21B).
Localização celular de moléculas gp82 reconhecidas pelo anticorpo policlonal anti-C03 em cepas do grupo T. cruzi I ou II
Um resultado inesperado de nossos estudos foi a reação preferencial do anticorpo anti-C03 com componentes intraflagelares da cepa G, o que não foi observado na cepa CL (Fig. 4 e 5 do artigo). Como as cepas G e CL pertencem a grupos genéticos divergentes, procuramos determinar se a localização flagelar de proteínas gp82 reativas com o anticorpo anti-C03 seria uma característica de cepas do grupo T. cruzi I, examinando duas outras cepas deste grupo. Formas metacíclicas das cepas 262 (José-IMT) e 1161 (cedidas pela Dra. Marta Teixeira, USP), permeabilizadas e incubadas com o anticorpo anti-C03, apresentaram o mesmo perfil da cepa G, com marcação predominantemente flagelar (Fig.22). Examinamos também formas metacíclicas de outras duas cepas do grupo T. cruzi II, SC (Covarrubias et al.,
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2007) e Y (Silva e Nussenzweig, 1953), quanto à reação com o anticorpo policlonal anti-C03. Observamos padrão similar ao da cepa CL, com marcação heterogênea no corpo do parasita (Fig.22). Concluímos que a localização preferencial das proteínas gp82 no flagelo pode ser grupo-dependente.
Figura 20. Expressão de moléculas da família gp82 em formas metacíclicas da cepa CL do T. cruzi. (A) Extratos dos parasitas foram analisados por “immunoblot” com os anticorpos indicados. (B) “Immunoblot” bidimensionais de extratos de formas metacíclicas mostrando proteínas separadas por focalização isoelétrica, seguida de separação por SDS-PAGE e reação com os anticorpos indicados. Os números à esquerda indicam as massas moleculares (kDa).
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Figura 21. Expressão de moléculas da família gp82 em formas metacíclicas da cepa G do T. cruzi. (A) Extratos dos parasitas foram analisados por “immunoblot” com os anticorpos indicados. (B) “Immunoblot” bidimensionais de extratos de formas metacíclicas mostrando proteínas separadas por focalização isoelétrica, seguida de separação por SDS-PAGE e reação com os anticorpos indicados. Os números à esquerda indicam as massas moleculares (kDa).