3.2 Metode
3.2.1 Dokumentanalyse
3.2.1.5 Dokumentutval
Os dados quantitativos referentes às contagens celulares foram submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre os grupos para cada um dos intervalos de tempo estudados (0, 24, 48 e 72 h) foi analisada pelos testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando-se um intervalo de confiança de 95% (p<0.05).
5. RESULTADOS
5.1 Efeito da Irradiação Laser na proliferação celular
A curva de crescimento das células-tronco do ligamento periodontal humano analisada pelo método de coloração por azul de tripan nos diferentes grupos estudados é ilustrada na Figura 10. Todos os grupos apresentaram um incremento na proliferação celular com o decorrer do tempo, sendo que o grupo irradiado com dose de 1,0 J/cm2 exibiu maior tendência a proliferação quando
comparado aos demais, principalmente nas últimas 24 horas do experimento.
Figura 10. Curva de crescimento das células-tronco do ligamento periodontal humano submetidas ou não a irradiação com laser durante diferentes tempos de incubação.
Comparando-se a média do número de células dos grupos que receberam laser com o grupo controle, apenas o grupo irradiado com a dose de 1,0 J/cm2 apresentou valores estatisticamente significativos nos dois intervalos de tempo finais estudados (48 e 72 h). O grupo que recebeu a dose de 0,5 J/cm2 apresentou valores semelhantes aos encontrados no grupo controle em
todos os intervalos de tempo do estudo (Tabela 2).
Analisando apenas os grupos que receberam laser, percebeu-se diferença estatisticamente significativa apenas nos intervalos de tempo de 48 e 72 h, com maior taxa de crescimento para o grupo de recebeu a dose de 1,0
Controle Laser 0,5 Laser 1,0
J/cm2 (Tabela 2). Apenas a dose de 1,0 J/cm2 parece influenciar positivamente a proliferação deste tipo celular.
Tabela 2. Análise do crescimento das células-tronco do ligamento periodontal humano em cada intervalo de tempo após a lasertarpia nos diferentes grupos estudados. (Média e desvio-padrão)
*Man-Whitney test; os números em negrito indicam diferença estatística (p<0.05)
A viabilidade celular, analisada a partir do método de coloração por azul de tripan, mostrou-se semelhante tanto no grupo controle quanto nos grupos irradiados em todos os intervalos de tempo analisados como apresentado na tabela 3.
Tabela 3. Percentual de viabilidade das células-tronco do ligamento periodontal humano submetidas ou não a irradiação nos diferentes tempos estudados.
O padrão da atividade mitocondrial das células-tronco do ligamento periodontal humano, analisado pelo ensaio do MTT, é ilustrado na figura 11. A avaliação da atividade mitocondrial dos grupos irradiados (0,5 e 1,0 J/cm²) apresentou comportamento semelhante ao verificado a partir do método de coloração por azul de tripan, quando se compara os grupos irradiados. A dose de 1,0 J/cm² foi significativamente melhor quando comparada com a de 0,5 J/cm² nos dois ultimos intervalos de tempo (48 e 72 h).
Controle Laser 0,5 Laser 1,0 p*
Média ± DP Média ± DP Média ± DP C vs. 0,5 C vs. 1,0 0,5 vs. 1,0
T0 2,5 ± 0,6 2,3 ± 0,9 1,8 ± 0,3 0,6423 0,0885 0,6423
T24 5,8 ± 0,3 5,0 ± 1,2 5,5 ± 0,6 0,6423 0,6423 0,6423
T48 6,8 ± 0,3 7,8 ± 0,9 9,8 ± 0,9 0,0885 0,0284 0,0284 T72 14,8 ± 3,2 16,3 ± 3,2 25,3 ± 6,1 0,3065 0,0284 0,0284
Controle Laser 0,5 Laser 1,0
T0 100% 100% 90%
T24 88,5% 94,4% 96,2%
T48 100% 97,2% 100%
Figura 11. Proliferação das células-tronco do ligamento periodontal humano durante diferentes tempos de incubação. Os valores são médias de percentagens em relação ao controle ± DP. (*p<0,05).
5.2 Efeito da Irradiação Laser no núcleo celular
No que se refere a alterações morfológicas nucleares, após a coloração com o DAPI nos três grupos estudados, não foi observada nenhuma alteração morfológica no núcleo das células, sem a presença de fragmentações nucleares e núcleos pignóticos, tanto das células do grupo controle quanto das células irradiadas, o que sugere integridade do DNA (Figura 12).
Figura 12. Micrografia das células-tronco do ligamento periodontal humano coradas com DAPI. (A) controle (B) laser 0,5 J/cm²; (C) a laser 1,0 J/cm². Aumento original x40.
6. DISCUSSÃO
A cultura de células tem sido bastante utilizada em diversos estudos in vitro devido à sua facilidade de padronização das amostras, no que se refere à parametros como pH, temperatura e pressão, além de se obter amostras totalmente homogêneas (FRESHNEY, 2000). Nos ultimos anos, vários estudos in vitro utilizando cultura de células têm avaliado a utilização de células-tronco na reparação de tecidos (GRONTHOS et al., 2000; MIURA et al., 2003; KRAMER et al., 2004; SEO et al., 2004). O presente estudo teve como foco o ligamento periodontal humano, que é uma fonte bastante acessível para obtenção de células-tronco. Estas apresentam potencialidade de diferenciação em células específicas da cavidade oral (como cementoblastos) e outros tipos celulares (como fibroblastos e osteoblastos), e têm sido foco de diversos estudos visando à regeneração dos tecidos periodontais (KRAMER et al., 2004; SEO et al., 2004; VASCONCELOS et al., 2012)
A aplicação clínica deste tipo celular, com a finalidade de reconstituir um tecido perdido, pode ser bastante útil em processos regenerativos que envolvem o periodonto de proteção e/ou suporte, no caso de pacientes portadores de doença periodontal avançada. No entanto, um dos requisitos necessários para o sucesso da terapia com células-tronco é a obtenção de uma quantidade considerável do tipo celular de interesse. Como a maioria dos tecidos apresenta uma quantidade reduzida destas células, uma terapia que proporcione um aumento na taxa proliferativa das células-tronco em cultura, é de grande interesse para a comunidade científica.
O LBI vem apresentando resultados satisfatórios no que diz respeito à bioestimulação de diversas células em cultura como ceratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, mioblastos e osteoblasto (KREISLER et al., 2002; RENNO et al., 2007; EDUARDO et al., 2007; STEIN et al., 2008) e ainda de células- tronco mesenquimais (TUBY, MALT e ORON, 2007; EDUARDO et al., 2008; AIGHAMIDI et al, 2012). Os resultados do presente estudo reforça a eficácia do LBI em aumentar a proliferação de células-tronco in vitro.
Com relação ao efeito biomodulatório do LBI sobre células-tronco de origem dental, a literatura é bastante escassa, não havendo inclusive nenhuma
investigação com células-tronco oriundas do ligamento periodontal. Após irradiação com laser de baixa intensidade, alguns autores observaram maiores taxas de proliferação de fibroblastos gengivais (KREISLER et al., 2003; DAMANTE et al., 2009), células-tronco da polpa de dentes permanentes (EDUARDO et al, 2008), além de células-tronco derivadas da medula óssea e do tecido adiposo (MVULA et al., 2008; MVULA, MOORE e ABRAHAMSE, 2010; SOLEIMANI et al., 2011), o que também foi observado no presente estudo.
No que se refere a irradiação de fibroblastos gengivais, é possível encontrar resultados distintos na literatura. Uma maior secreção do fator de crescimento fibroblástico (FGF) (DAMANTE et al., 2009) e maior taxa proliferativa (KREISLER et al., 2003) foram resultados condizentes com um efeito biomodulatório positivo promovido pelo LBI. Por outro lado, a diminuição na quantidade de proteinas totais e principalmente de colágeno tipo I (MARQUES et al., 2004) são características relacionadas a propriedades inibitórias. Vale ressaltar que esses estudos utilizaram lasers com comprimentos de onda no espectro infravermelho.
A laserterapia apresenta algumas controvérias na literatura, especialmente referentes ao espectro de luz, à melhor potência de trabalho, à dose e ao comprimento de onda ideais para se obter os resultados desejados ou para a maximização desses resultados.
Nos estudos in vitro, observa-se que tanto o espectro de luz visível quanto o invisível pode estimular a proliferação celular, porém a maioria dos estudos que apresentam resultados satisfatórios utilizam o espectro de luz visível (ALMEIDA-LOPES, 2003; EDUARDO et al., 2008; HORVAT-KARAJZ et al., 2009; MVULA et al., 2010), o qual também foi objeto do presente estudo, variando apenas a dose de irradiação, conseguindo-se assim resultados satisfatórios com a dose de 1,0 J/cm².
O comprimento de onda utilizado durante a instituição da laserterapia parece influenciar o seu efeito nas células em cultura. Estudos anteriores demonstraram que comprimentos de onda no espectro de luz vermelha variando entre 600 a 700 nm, contribuem com o aumento da proliferação e diferenciação celular (WILDEN e KARTHEIN, 1998; TUBY, MALTZ e ORON,
2007; STEIN et al., 2008). Contrapartida, o espectro de luz infravermelho com variação do comprimento de onda entre 810 a 830 nm tem sido associado a inibição da taxa proliferativa de alguns tipos celulares (MOORE et al., 2005; HAWKINS-EVANS e ABRAHAMSE, 2008). Baseado nesse fato, este estudo, semelhante aos realizados por Horvat-Karajz et al. (2009) e Eduardo et al. (2008), utilizou-se o comprimento de onda de 660 nm, o qual resultou em efeitos estimulantes positivos.
Além do comprimento de onda, a dose é outro parâmetro que deve ser considerado quando se deseja a bioestimulação celular. Tuner e Hoder (2007) relataram que o processo de bioestimulação pode ser alcançado com doses muito baixas como 0,001 J/cm2 até doses maiores, sendo referido 10 J/cm2.
Eduardo et al. (2008) obtiveram êxito na proliferação de células-tronco da polpa de dentes permanentes utilizando comprimento de onda de 660 nm e dose de 3,0 J/cm2. De acordo com Karu (1987) o aumento da dose pode provocar danos aos fotorreceptores e como resultado, o efeito biomodulatório do laser é reduzido. Utilizando doses menores (0,5 e 1,0 J/cm2), o presente estudo conseguiu promover a bioestimulação sem causar danos a morfologia do núcleo celular, o que foi demonstrado pela colocação com DAPI das células irradiadas. Assim, é provável que doses menores diminuam o risco de dano celular e, no caso das células-tronco, contribuam para o aumento de sua população, mantendo suas características inicias íntegras.
Além da dose, potência e comprimento de onda, outro ponto ainda bastante controverso sobre o efeito da laserterapia, se refere à quantidade de sessões ideais de aplicações do laser para as diferentes enfermidades. O que verificou-se no presente estudo é que a potência de 30 mW apresenta efeitos positivos quando associada a dose de 1,0 J/cm² e que doses menores que 1,0 J/cm² parecem não influenciar na taxa de proliferação celular para o tipo de célula estudado. Com relação aos intervalos de aplicação do laser, baseado nos resultados encontrados, pode-se afirmar que quando se deseja proliferação celular o intervalo de 48h entre as aplicações parece ter efeito positivo. O mesmo foi observado por Li et al. (2010) quando comparou a proliferação de células-tronco da medula óssea irradiadas uma única vez e com irradiações em um intervalo de 48h durante 13 dias.
Segundo Huang et al (2009) a laserterapia apresenta um efeito dose dependente nas respostas biológicas e parece ter um efeito cumulativo a cada nova dose aplicada. Neste estudo, esse fato se confirma pela forma que as células responderam a laserterapia, uma vez que exibiram curva de crescimento ascendente nas duas doses utilizadas, com ação cumulativa no decorrer do tempo. A resposta celular foi mais evidente quando estas foram irradiadas com dose de 1,0 J/cm2 do que 0,5 J/cm2, apresentando maiores índices proliferativos nos últimos intervalos de tempo do estudo (T48 e T72), após a segunda irradiação.
Assim como encontrado em nos resultados deste trabalho, Stein et al (2008) verificaram melhores resultados no crescimento e diferenciação de osteoblastos humanos durante as primeiras 72 horas de experimento, após irradiação com comprimento de onda de 670 nm e dose de 1,0 J/cm2 e 2,0
J/cm2. Ademais, a dose de 1,0 J/cm2 foi mais eficaz em favorecer a proliferação deste tipo celular nos intervalos de 48 e 72 horas, o que reforça os resultados do presente estudo com relação ao espectro, comprimento de onda e dose mais efetiva.
Com a finalidade de restaurar o tecido periodontal perdido, diversas ferramentas têm sido utilizadas, entre elas o LBI e terapias com células-tronco. Uma melhoria no potencial de regeneração do osso alveolar perdido vem sendo demostrado por diversos autores, quando se utiliza a laserterapia como tratamento alternativo na regeneração periodontal (OZCELIK et al., 2008; ABO- ELSAAD et al., 2009). Por sua vez, a terapia com células-tronco de diversas fontes vem apresentando resultados satisfatórios no que diz respeito a regeneração dos tecidos periodontais de suporte (BARTOLD, SHI e GRONTHOS, 2006; AKIZUKI et al., 2005).
Em resumo, os resultados deste trabalho mostraram que o LBI infuencia positivamente a proliferação in vitro de células-tronco derivadas do ligamento periodontal humano. Baseado nesses dados e na literatura é possível sugerir que a associação da laserterapia com a engenharia tecidual utilizando células- tronco pode melhorar os resultados já apresentados em estudos prévios de regeneração periodontal. No entanto, mais experimentos são necessários para a investigação de outros protocolos de aplicação do LBI, bem como os seus
efeitos sobre as funções celulares, estabelecendo-se assim parâmetros de laserterapia que possam contribuir com resultados clínicos satisfatórios.
7. CONCLUSÃO
Com base nos achados desta pesquisa pode-se concluir que o LBI no espectro de onda vermelho e dose de 1,0 J/cm2 é capaz de contribuir com
proliferação das células-tronco do ligamento periodontal humano sem causar alterações morfológicas nucleares e que doses menores que 1,0 J/cm2
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