Dokumentasjon og gjenbruk

5.2.1 Cromatografia em coluna de bicarbonato de sódio

Objetivos

Separação dos pigmentos carotenoides, clorofilas e flavonoides, presentes nas folhas de plantas verdes e vermelhas e de árvores por cromatografia em coluna.

Materiais e reagentes

Folhas de árvores, arbustos, plantas de interior e jardim, seringa descartável de 20mL, algodão, areia, almofariz, contagotas ou pipeta Pasteur, suporte universal, vidro de relógio, éter de petróleo, solução saturada de bicarbonato de sódio, mistura acetona / éter de petróleo, 10:90 (v/v), mistura acetona / éter de petróleo, 25:75 (v/v), acetona, etanol a 96% e sal de cozinha.

Procedimento experimental

1. Utilizar 12g de tecidos vegetais e triturar num almofariz, de seguida acrescentar

40mL de acetona e deixar macerar durante 15 minutos. O material deve ser mantido tapado com folha de alumínio à temperatura ambiente.

2. Filtrar a solução resultante da maceração com a ajuda de funil e algodão para um

goblé, acrescentar duas espátulas de sal de cozinha e deixar repousar cerca de 10 minutos.

3. Filtrar o líquido sobrenadante através de um filtro de pregas. Reservar o filtrado.

4. Para preparar o extrato sólido anidro colocar duas espátulas de bicarbonato de

sódio numa placa de petri ou vidro de relógio e adicionar cerca de 5mL do filtrado anterior. Deixar a mistura secar ao ar até evaporar toda a acetona (cerca de 5 minutos).

5. Num almofariz triturar o bicarbonato de sódio para desfazer os grumos até ficar

em pó solto.

6. Colocar numa seringa de 20mL um bocado de algodão na extremidade da mesma, com a espessura de aproximadamente 0,5cm e acrescentar uma espátula de areia. Fixar a coluna na posição vertical e adicionar o bicarbonato de sódio lentamente até cerca de três quartos, de modo a obter uma compactação uniforme e novamente uma espátula de areia.

7. Colocar por baixo um goblé.

8. Passar éter de petróleo e quando o líquido atingir a superfície da coluna colocar

o extrato sólido preparado no ponto 4.

9. Continuar a adicionar éter de petróleo até sair a banda amarela.

10. Utilizar agora a mistura acetona / éter de petróleo, 10:90 até arrastar a banda de

cor verde.

11. Seguidamente passar etanol a 96%, para arrastar os outros verdes que ficaram na

coluna.

12. Preparar uma solução saturada de bicarbonato de sódio: medir 20mL de água

para um goblé e adicionar duas espátulas de bicarbonato de sódio. Agitar com a ajuda de vareta.

13. Eluir a coluna com esta solução para arrastar a banda castanha que se encontra

no topo da coluna.

14. Adicionar a esta última fração 3 gotas de HCl 1:1 (ou vinagre) e observar a

5.2.2 Cromatografia em coluna de fécula de batata

Objetivos

Separação dos pigmentos presentes nas folhas verdes e vermelhos encontrados em plantas, arbustos e árvores, por cromatografia em coluna.

Materiais e reagentes

Folhas de árvores, arbustos, plantas de interior e jardim, seringa descartável de 20mL, algodão, areia, almofariz, contagotas ou pipeta Pasteur, suporte universal, vidro de relógio éter de petróleo ou benzina, mistura acetona / éter de petróleo, 10:90 (v/v), etanol a 90% ou 96%, acetona e sal de cozinha.

Procedimento experimental

1. Utilizar 12g de tecidos vegetais e triturar num almofariz, de seguida acrescentar

40mL de acetona e deixar macerar durante 15 minutos. O material deve ser mantido tapado com folha de alumínio à temperatura ambiente.

2. Filtrar a solução resultante da maceração com a ajuda de funil e algodão para um

goblé, acrescentar duas espátulas de sal de cozinha e deixar repousar cerca de 10 minutos.

3. Filtrar o líquido sobrenadante através de um filtro de pregas. Reservar o filtrado.

4. Para preparar o extrato sólido anidro colocar duas espátulas de fécula de batata

numa placa de petri ou vidro de relógio e adicionar cerca de 5mL do filtrado anterior. Deixar a mistura secar ao ar até evaporar toda a acetona (cerca de 5 minutos).

5. Colocar numa seringa de 20mL um bocado de algodão na extremidade da mesma, com a espessura de aproximadamente 0,5cm e acrescentar uma espátula de areia. Fixar a coluna na posição vertical e adicionar a fécula de batata

lentamente até cerca de três quartos, de modo a obter uma compactação uniforme e novamente uma espátula de areia.

6. Colocar por baixo um goblé.

7. Passar éter de petróleo e quando o líquido atingir a superfície da coluna colocar

o extrato sólido anidro.

8. Continuar a adicionar éter de petróleo até sair a banda amarela.

9. Utilizar agora a mistura acetona / éter de petróleo, 10:90 até arrastar as bandas

de cor amarelo escuro seguida de uma verde.

10. Seguidamente fazer passar a mistura acetona / éter de petróleo, 25:75 até

recolher outra banda verde.

11. Passar etanol a 96% até arrastar a banda castanha.

5.2.3 Explicação das atividades de cromatografia em coluna

A cromatografia em coluna foi inicialmente desenvolvida pelo químico do petróleo, o americano D. T. Day, em 1900. O botânico M.S. Tswett usou em 1906, as colunas de adsorção nas suas investigações de pigmentos de plantas, mas só depois de 1930 é que esta técnica foi aproveitada pelos químicos. A cromatografia em coluna pode ser utilizada para a separação dos pigmentos de produtos naturais e em práticas normais de laboratório. Na cromatografia os constituintes da amostra são separados de acordo com a sua afinidade para a fase sólida (fase estacionária) e para os solventes (fase móvel). Os constituintes que têm mais afinidade para a fase estacionária são os últimos a serem separados e os que têm afinidade para os solventes são os primeiros.

Os principais pigmentos fotossintéticos são as clorofilas, os carotenoides e os flavonoides.

Os carotenoides encontram-se nos cloroplastos e acompanham as clorofilas. Dos carotenoides fazem parte os carotenos que são moléculas apolares e as xantofilas que são moléculas polares. Os carotenoides são solúveis em solventes apolares como o éter de petróleo, sendo a primeira fração a sair, têm cor amarela, seguidos pelas xantofilas também com cor amarela

As clorofilas apresentam a cor verde, aclorofila b é mais polar e apresenta a cor verde amarelada, a clorofila a é menos polar e apresenta a cor verde azulada.

A faixa castanha é composta pelos pigmentos flavonoides que são solúveis em solventes aquosos, por isso foi necessário recorrer à solução saturada de bicarbonato de sódio ou ao etanol para os conseguir separar.