Inicialmente foi realizada a amplificação do gene AmBgl1-LP a partir de DNA metagenômico total do Lago Poraquê, a qual amplificou um fragmento específico de tamanho esperado de aproximadamente 1400 pb como pode ser visualizado na Figura 5:
Figura 5 : Amplificação da ORF AmBgl1-LP. M: marcador de massa molecular GeneRuler 1Kb (Fermentas); 1: controle negativo da reação (sem molde); 2 e 3: amostras amplificadas, utilizando 3 e 6 ng de DNA metagenômico do Lago Poraquê respectivamente.
Após a amplificação do gene os fragmentos foram purificados do gel, clivados com as enzimas de restrição Nde-I e BamH-I e utilizados em uma reação de ligação com o
plasmídeo pET-28a clivado com as mesma enzimas. Em seguida foram transformadas células de E. coli linhagem DH5α e a busca por clones recombinantes foi analisada por PCR de colônia e seu resultado pode ser visualizado na Figura 6, a seguir:
Figura 6 : PCR de colônia para a ORF AmBgl1-LP no plasmídeo pET-28a em E. coli DH5α. M: marcador de peso molecular GeneRuler 1 Kb; 1: controle negativo; 2, 3, 5, 6 e 7: clones recombinantes; 4: amostra não amplificada.
Analisando a Figura 6 é possível observar que as bandas amplificadas apresentaram tamanho ligeiramente superior a 1500 pares de base, isto ocorreu devido ao uso de primers específicos para as sequências do promotor e terminador T7, as quais flanqueiam o gene de interesse inserido no plasmídeo pET-28a, aumentando assim o tamanho do produto amplificado.
Posteriormente extraiu-se o DNA plasmidial de 3 clones recombinantes e um destes foi submetido à uma clivagem com as mesmas enzimas utilizadas na clonagem (Nde-I e BamH-I) para mais uma validação da inserção do gene AmBgl1-LP no vetor de expressão pET- 28a, o resultado da clivagem está representado na Figura 7:
Figura 7 : Clivagem do vetor pET-28a contendo o gene AmBgl1-LP. M: marcador de peso molecular GeneRuler 1 Kb (Fermentas); 1: vetor recombinante clivado; 2: vetor recombinante não clivado.
É possível observar na coluna 1 da Figura 7 que a clivagem gerou bandas nas alturas de aproximadamente 6743 (fraca), 5369 e 1374 pb que são referentes aos fragmentos de vetor recombinante linearizado, plasmídeo pET-28a sem inserto e gene AmBgl1-LP, respectivamente. A banda fraca referente ao plasmídeo linearizado pode ter surgido porque a enzima BamH-I apresenta uma eficiência de reação de apenas 20 a 50% de sua atividade máxima no tampão utilizado na reação de restrição, OrangeTM 1X (Thermo Scientific), significando que
apenas a enzima Nde-I, que apresenta atividade de 100% neste tampão, conseguiu clivar completamente o vetor recombinante na reação.
Após a verificação, por sequenciamento, da correta inserção do gene de interesse em correta fase de leitura no plasmídeo pET-28a em um dos clones, transformou-se células
competentes de E. coli linhagem Rosetta (DE3) e iniciou-se a etapa de expressão da proteína recombinante. A indução foi realizada em um período total de 21 horas e alíquotas de 1 mL da cultura foram coletadas nos períodos de 1, 2, 3, 4 e 21 horas de indução para avaliação da produção da proteína recombinante, a qual foi avaliada por SDS-PAGE 12% como pode ser visto na Figura 8:
Figura 8 : Teste de expressão da AmBgl1-LP em E. coli. SDS-PAGE 12% a 37 °C mostrando M: marcador de peso molecular BenchMark (Invitrogen); 1: amostra não induzida; 2: amostra após 1 h de indução; 3: amostra após 2 h de indução; 4: amostra após 3 h de indução; 5: amostra após 4 h de indução; 6: amostra após 21 h de indução; 7: amostra da fração de proteínas insolúveis; 8: amostra da fração de proteínas solúveis.
Como pode ser visto na figura 8 a proteína recombinante foi expressa com sucesso no tamanho esperado de aproximadamente 53,7 kDa. A expressão se mostrou eficiente com rendimento alto a partir de 3 horas de indução, não sendo necessário continuar com a mesma até um período de 21 horas. Um problema identificado nesta indução foi que a maioria da AmBgl1- LP se apresentou na fração de proteínas insolúveis, fato que dificulta os passos posteriores de purificação da proteína, entretanto, decidiu-se realizar a purificação por afinidade molecular da fração solúvel de proteínas para avaliar se era possível utilizar apenas esta fração para isolar a proteína recombinante, os resultados da purificação podem ser vistos na Figura 9, a seguir:
Figura 9 : Purificação da AmBgl1-LP por cromatografia de afinidade molecular ao níquel. SDS-PAGE 12% mostrando em M: marcador de peso molecular BenchMark (Invitrogen); 1: proteína eluída em 75 mM de imidazol; 2 e 3: proteína eluída em 100 mM de imidazol; 4 e 5: proteína eluída em 250 mM de imidazol.
Analisando a Figura 9 é possível concluir que a fração de proteínas solúveis continha a AmBgl1-LP, mesmo que em pequenas quantidades, e a mesma foi purificada com sucesso sem a presença de contaminantes nas eluições contendo 75 a 250 mM de imidazol em tampão de lise.
Com o intuíto de solucionar o problema de baixa solubilidade da proteína recombinante foi realizada uma nova indução a 20 °C. Em menores temperaturas há uma redução na taxa de síntese de proteínas o que proporciona uma menor formação de corpos de inclusão e aumento da solubilidade e a qualidade conformacional das mesmas (Schein & Noteborn, 1988; Vera et al., 2007). Alíquotas de 1 mL de cultura foram retiradas nas mesmas condições descritas na indução anterior, o resultado deste novo experimento pode ser visualizado na Figura 10, a seguir:
Figura 10 : Indução da AmBgl1-LP em E. coli a 20°C. SDS-PAGE 12% mostrando em M: marcador de peso molecular BenchMark; 1: amostra não induzida; 2: amostra após 1 h de indução; 3: amostra após 2 h de indução; 4: amostra após 3 h de indução; 5: amostra após 4 h de indução; 6: amostra após 21 h de indução; 7: fração de proteínas insolúveis; 8: fração de proteínas solúveis; 9: AmBgl1-LP purificada.
A Figura 10 mostra que a indução em 20°C produziu uma quantidade menor de proteína recombinante se comparado com a indução em 37°C, entretanto, a quantidade de proteína na fração solúvel aumentou consideravelmente, o que compensa a redução na produção e propicia maiores níveis de AmBgl1-LP para ser purificada por cromatografia de afinidade. O rendimento final de proteína purificada foi de aproximadamente 5 mg/L na indução em 37°C e aproximadamente 20 mg/L a 20°C quando quantificada pelo método do BCA.
Ensaios iniciais com a enzima eluída em 100-250 mM de imidazol revelaram que a mesma estava ativa, por meio de uma análise qualitativa na qual foi observado que a reação de hidrólise enzimática apresentou coloração amarelada após seu término com adição de tampão glicina NaOH 0,4 M pH 10,8, se comparada com um controle de reação sem coloração no qual a enzima recombinante não foi adicionada. Entretanto, após a diálise realizada em tampão PBS, para retirada do imidazol, foi observado que a enzima perdeu sua atividade embora ela tenha sido quantificada pelo teste de BCA e detectada por SDS-PAGE 12%. Diante deste cenário foram preparados outros tampões de diálise considerando a hipótese de que o contato da enzima recombinante com o tampão PBS a inativou de alguma maneira. Para isto foram realizadas novos
experimentos de diálise nos quais 25 µL de enzima eram colocados sobre uma membrana de nitrocelulose por 30 minutos a temperatura ambiente sobre uma solução dentre as seguintes opções de tampões: fosfato de sódio 50 mM pH 6,5, fosfato de sódio 50 mM pH 8,0, Tris HCl 20 mM pH 7,5 e tampão de lise pH 8,0 (NaCl 100 mM, NaH2PO4 50 mM, Tris 10 mM). Após
concluída a diálise nestas circunstâncias foram realizados novos ensaios enzimáticos, utilizando o mesmo volume de 25µL de enzima proveniente das membranas de nitrocelulose em tampões diferentes, tendo a absorbância resultante de cada tratamento lida em espectrofotômetro PerkinElmer Victor3™ com comprimento de onda de 420 nm (dados não mostrados). O melhor tampão para a diálise foi o tampão de lise pH 8,0 o qual apresentou maiores valores de absorbância se comparado com o controle não dialisado (dados não mostrados), assim passamos a utilizá-lo para fazer a diálise da AmBgl1-LP.