O LHHFI no cumprimento da garantia da qualidade dos serviços que presta ao médico prescritor e ao utente, mantém um Sistema da Qualidade, onde estão envolvidos os cuidados com as fases pré-analítica, analítica e pós-analítica, vigilância de regras do CQI e participação nos Programas de AEQ.
Avaliação Interna da Qualidade
Os equipamentos disponibilizam gráficos de Levey-Jennings, regras de Westgard para avaliar a imprecisão e inexatidão dos resultados dos controlos utilizados e proceder à sua validação.
Avaliação Externa da Qualidade
O LHHIF participa em programas de Controlo de Qualidade Externo (CQE) nacionais e internacionais.
Setor de Hematologia:
AEQ INSA - Avaliação Externa da Qualidade Instituto Nacional da Saúde Dr. Ricardo Jorge:
– VS (método Westergren- mensal e método automatizado Alifax®- trimestral)
PNAEQ – Labquality:
– Exatidão da escala de comprimento de onda do espectrofotómetro (anual).
INSA – Programa de Química Clínica: Ferro;
– Programa da endocrinologia: Ferritina, Folato sérico e Vitamina B12.
UK NEQAS - United Kingdom National External Quality Assessment Service:
– Abnormal Haemoglobins: Teste de falciformação, identificação das fracções, quantificação da HbA2, HbF, HbS;
- Automated Differencial Leucocyte Count: contagem automática de Neutrófilos, Linfócitos, Monócitos, Eosinófilos e Basófilos;
- Blood Films Morphology, Manual Differential and Parasites Identification: morfologia do sangue periférico, identificação de parasitas sanguíneos e formula diferencial manual;
- Full Blood Count: avaliação dos parâmetros do contador automático (Hb, RBC, PCV, MCV, MCH, MCHC, WBC, Plaquetas);
- Rapid Diagnostic Techniques for Malaria: Determinação de antigénios da Malária; - Red Cell G-6-PD Screen and Assay: Pesquisa e determinação da Glucose-6 PD; - Reticulocyte Count: Contagem automática e manual dos reticulócitos;
- Clínical Chemistry: Ferro;
Setor de Hemostase e Fibrinólise
UK NEQAS - United Kingdom National External Quality Assessment Service:
- Blood Coagulation: PT, aPTT, fibrinogénio, TT, heparina, D-Dímeros, anticoagulante lupico; Fatores: II:c, V:c, VII:c, VIII:c, IX:c, X:c, XI:c, XII:c, XIII:c, Fator Von Willebrand (Ag e cofactor da Ristocetina); Plasminogénio funcional, atividade da Proteína C, da Proteína S e da Antitrombina- trimestral;
- Factor V Leiden / Molecular Genetics of Thrombophilia Testing: Mutação da Protrombina G20210A e Mutação Fator V de Leiden (RT-PCR).
Setor de Imunofenotipagem
UK NEQAS - United Kingdom National External Quality Assessment Service:
- Low Level Leucocyte Emuneration: Contagem de leucócitos residuais em amostras de CE e CP;
Estatística
Apresenta-se a seguir, a produção aproximada no SPC referente aos últimos 5 anos de atividade, Tabela 14
Tabela 14. Produção aproximada no SPC
2014 2015 2016 2017 2018 E Variação % 2017/2016 2018/2017 Número Total de Análises 2352000 2449792 2492454 2654172 2711239 6,49 2,15 Número total de análises de rotina 1332736 1454557 1441205 1541318 1614198 6,95 4,73 Número total de análises de urgência 1019264 995235 1051249 1112854 1097041 5,86 -1,42 Hematologia 428981 437659 425713 480504 489706 12,87 1,92 Análises de rotina 205918 223510 215562 237872 249537 10,86 4,90 Análises de urgência 223063 214149 211151 242632 240169 14,91 -1,02
DOENÇAS GENÉTICAS DA HEMOGLOBINA – Variante S da hemoglobina.
Eletroforese capilar
A hematopoiese é o processo biológico que leva à formação de células sanguíneas:
Jagannathan-Bogdan, (2013), eritrócitos ou glóbulos vermelhos, leucócitos, ou glóbulos brancos e plaquetas. São células que possuem uma semi-vida relativamente curta, ou seja, para manter os níveis estáveis ao longo da vida, são necessárias renovações permanentes ajustadas à demanda de necessidades periféricas. (Jiménez, 2017) Os glóbulos vermelhos têm um tempo de vida médio de cerca de 120 dias, as plaquetas, cerca de 8 a 10 dias, e os leucócitos varia de acordo com o seu tipo. Assim, os granulócitos, após cerca de 8 ou 10 horas em circulação na corrente sanguínea, migram para os tecidos onde sobrevivem cerca de 1 ou 2 dias, enquanto os linfócitos sobrevivem por vários anos. A produção diária de glóbulos vermelhos e plaquetas estima-se em cerca de 2.500 milhões por quilo de peso, e a de leucócitos, cerca de 1.000 milhões / kg. (Jiménez, 2017)
A Hemoglobina representa cerca de um terço do volume dos eritrócitos. É uma molécula com um peso molecular de 68 kDa constituída por quatro subunidades, cada subunidade é composta por uma cadeia de globina (subunidade de proteína) e um grupo heme, (Perutz, 1960) As quatro cadeias de globina estão dispostas em pares de duas globinas idênticas (por exemplo, α2 β2) e formam uma estrutura globular com cavidades, onde os grupos heme estão localizados. Cada um deles é composto de um anel de protoporfirina e ferro que se liga à cadeia de globina por uma ligação covalente em locais específicos na cadeia polipeptídica, Figura 1. A hemoglobina define-se como sendo uma molécula complexa composta por quatro cadeias de globina, cada uma encerra parcialmente um grupo heme, que tem como principal função o transporte de oxigénio proveniente dos pulmões para os tecidos. (Bain, 2003)
Figura 1. Estrutura da Hemoglobina, Adaptado de Tarek e Elghetany, 2011
Quando estamos perante defeitos na formação da molécula, cujas alterações se transformam em patologias, destaca-se a principal e mais comum em todo o mundo: a anemia. É considerada anemia, quando estamos na presença de uma concentração de hemoglobina (Hb) ou o hematócrito (Hct), abaixo do limite inferior do intervalo de referência de 95% para a idade, sexo e localização geográfica (altitude) do indivíduo. Significa isto que 2,5% dos indivíduos normais serão classificados como anémicos. Por outro lado, um indivíduo cujo valor da hemoglobina está dentro dos intervalos de referência para os fatores idade e sexo, ainda que significativamente abaixo de seus próprios valores de referência, deve ser considerado um indivíduo anémico. (M. Tarek Elghetany, 2011).
Quando na cadeia polipeptídica, existe lugar uma mutação, Tabela 15, estamos perante patologias associadas a alterações genéticas da hemoglobina.
Uma das causas da anemia que se enquadra no grupo das doenças genéticas hereditárias, são as hemoglobinopatias, e que se dividem em dois grupos. As variantes estruturais, cujo defeito assenta na estrutura e as talassémias, cujos defeitos assentam na síntese de uma cadeia da globina. (Traeger-Synodinos J, et all 2014). E de longa data estão descritos relatos do início da descoberta das hemoglobinopatias. A anemia falciforme foi descrita clinicamente pela primeira vez nos EUA em 1910, nomeadamente a descrição do relato histórico do século XX, com a observação de um jovem estudante de pós-graduação de Grenada, atormentado por uma doença crónica e ligou para o Hospital Dr. James Herrick em Chicago para avaliar esses sintomas cada vez mais problemáticos. A história do Dr. Herrick revelou a questão adicional das dores articulares intermitentes que persistem ao longo de vários anos e que foram caracterizadas por episódios de dor mais generalizada e intensa. O exame do paciente era suscetível apenas para icterícia escleral leve. O aspeto mais marcante da avaliação foi a presença, no esfregaço de sangue periférico, de eritrócitos anormais que tinham a forma de crescentes ou foices. O Dr. Herrick resumiu então os seus achados num relatório de 1910 que forneceu a primeira descrição da doença falciforme na literatura médica. (Kenneth R. Bridge, 2008)
Atualmente, estimam-se em mais de mil as alterações na síntese e/ou na estrutura da hemoglobina. (Forget, B. G., & Bunn, H. F. 2013).
O sangue do adulto normal contém dois subtipos de hemoglobina. O principal componente é a hemoglobina A, com estrutura molecular α2β2, ou seja: duas cadeias α e duas cadeias β. O gene da cadeia α é duplicado e ambos os genes α 1 e α 2, em cada cromossoma são ativos. É composto ainda pela hemoglobina A2, cuja estrutura molecular é representada por α2, δ2. Na eletroforese de um adulto normal, apresenta uma percentagem não superior a 3%, (Stephens AD, 2011)
Sabe-se que as alterações estruturais da cadeia β, são mais frequentes que as da cadeia α, e é nas primeiras que se encontram as três variantes de maior prevalência: Hb S, Hb C e HbE. (Jiménez, 2017)
Os defeitos genéticos da hemoglobina são as doenças genéticas hereditárias mais comuns em todo o mundo e decorrem de mutações genéticas. Ocorrem nas regiões tropicais e subtropicais, aparentemente a maioria foi selecionada porque o estado de portador permite alguma proteção contra a malária. (Hsu, 2018).
É descrito que a hemoglobina falciforme fornece um excelente exemplo de uma mudança na molécula de hemoglobina que prejudica o crescimento e desenvolvimento de malária, Depetris-Chauvin, 2016). As primeiras indicações de relação entre os dois vieram com a perceção de que a distribuição geográfica do gene da hemoglobina S e a distribuição da malária na África praticamente se sobrepõem. (Kenneth R. Bridge, 2008)
Uma das variantes da Hemoglobina é a hemoglobina S - hemoglobina falciforme, uma hemoglobina variante com tendência a polimerizar com baixa tensão de oxigénio, fazendo com que os eritrócitos se deformem na forma de uma foice, Figura 2 (Bain, 2003)
Figura 2.Células falciformes, Adaptado de Bain, 2003
A hemoglobinopatia S é a mais frequente em todo o mundo, estima-se que afeta cerca 8% da população negra americana e cerca de 25% da população africana na sua forma heterozigótica. Fonte: (Jiménez, 2017). Trata se de uma doença debilitante hereditária, causada por uma mutação pontual no gene da beta-globina, que requer diagnóstico precoce após o nascimento e monitorização constante durante toda a vida do paciente. (Qureshi, 2018)
Clinicamente caracteriza-se numa doença com anemia hemolítica e fenómeno vaso- oclusivo. O produto do gene mutante (hemoglobina S [HbS], beta 6glu -> val) tem a tendência de polimerizar a baixa tensão de oxigênio e causar o fenómeno falciforme, Cherrie, (1963). Este tem sido considerado o fator dominante da fisiopatologia da anemia falciforme. Além disso, a HbS instável, a homeostase catiónica alterada e a adsorção da célula falciforme ao endotélio são suficientes para causar impacto nas características clínicas desta patologia. (Sugihara, 1996)
Figura 3. Esquematização mendeliana de portadores de Hemoglobina S
Segundo (Cyrklaff, 2016) sabe-se que o facto de existir certas alterações, nomeadamente mutações na hemoglobina normal, confere algumas propriedades de proteção contra algumas patologias, em particular, os portadores das hemoglobinopatias estruturais S e C e lactentes estão protegidos de doenças graves.
No SPC do HGO, para despiste e diagnóstico da hemoglobinopatia S, é efetuado um pedido geral de despiste de hemoglobinopatias, (Agouti, 2013). Atualmente têm aumentado os pedidos de despiste provenientes da consulta de Infertilidade e para diagnóstico pré-natal, também aqui seguindo uma recomendação da DGS, datada de 2004, que veio revogar uma circular anterior, elaborada em consequência de um estudo efetuado em Portugal que caracteriza a localização geográfica de portadores da hemoglobinopatia.
Atualmente, no SPC, a metodologia utilizada, é a eletroforese capilar, considerada uma das mais usadas e vantajosa para testar hemoglobinopatias. Muitas vezes, na rotina, a eletroforese capilar permite a separação rápida e precisa das frações muito raras de hemoglobina, bem como a sua quantificação. Segundo (S. Barella, 2015) a utilização em laboratório durante cinco meses, permitiu detetar, entre outros, cinco variantes de hemoglobina que relatamos aqui (Hb Belfast, Hb G-San José, Hb J-Sardegna, Hb Sassari e Hb Shelby) e nunca descritos em literatura anterior por esta técnica.
Trata-se de uma técnica poderosa que permite identificar facilmente as variantes da hemoglobina, onde a separação é precisa, no entanto, esta técnica pode ser implementada como um teste de triagem de primeira linha, tendo em consideração que um teste confirmatório ainda é necessário. (S. Barella, 2015)
“Três grandes focos de portadores de células falciformes são conhecidos, nas regiões de Coruche e Alcácer do Sal nos baixos vales dos rios Tejo e Sado respetivamente, e no sudeste Alentejano... Mesmo sem considerar populações especiais em risco, a pesquisa indica a existência entre 73795 e 76528 portadores de talassemia ou AS em Portugal” (M C Martins, 1993)
Assim, e de acordo com o Programa Nacional de Controlo da Hemoglobinopatias, em cooperação com a Organização Mundial de saúde, tendo como objetivos, a prevenção, o diagnóstico e o tratamento das formas graves das hemoglobinopatias, onde é recomendada especificamente a pesquisa de hemoglobinopatias a todas as mulheres em idade reprodutiva, em particular nas consultas de planeamento familiar, pré concecional, ou de caracter urgente na 1ª consulta de gravidez, (Saúde, 2004). A mesma circular normativa justifica esta recomendação pelo facto de acentuada imigração interna para as regiões abordadas assim com aos indivíduos provenientes de regiões do globo com elevada prevalência destas patologias.
No SPC, foi implementado no ano de 2015 o sistema Sebia. A metodologia utilizada por este sistema é o da eletroforese capilar, (Mantikou E, 2010). Apesar de ainda existir atualmente metodologia utilizada para secreening por HPLC, estudos comprovam que não há desvantagem em usar eletroforese capilar, pois está demonstrado por (Trefor Higgins, 2009), que é adequado para a identificação presuntiva e quantificação de variantes de hemoglobina, produzindo resultados comparáveis aos atuais métodos de HPLC e eletroforese, pois a eliminação de interferências, introduzido pelo método da Eletroforese Capilar, nomeadamente ao nível do doseamento da hemoglobina A2, na presença de variantes S e C.
O fundamento da tecnologia do sistema Sebia é o seguinte:
Os sistemas Sebia utilizam o princípio da eletroforese capilar em solução livre.
As moléculas carregadas, são separadas de acordo com a sua mobilidade eletroforética em pH específico utilizando um tampão alcalino. A separação é realizada de acordo com o pH do eletrólito e o fluxo eletroendosmótico. Os instrumentos de eletroforese capilar do Sebia são
extremidade do cátodo do capilar.
Após a análise, os capilares de sílica são imediatamente lavados com uma solução de lavagem e, em seguida, preenchidos novamente com tampão para preparar a análise das amostras seguintes (https://www.sebia.com/es/groupeproduits/electroforesis-capilar, s.d.)
Figura 4. Equipamento Sebia Minicap flex-piercing, Adaptado de sebia.com
O equipamento MINICAP FLEX PIERCING, neste momento a ser utilizado pelo serviço, oferece bastante flexibilidade para laboratórios semelhantes ao do SPC, pois tratando-se de um equipamento, totalmente automático, proporciona respostas adequadas e fiáveis ao fim a que se destina.
Para a análise do sangue total, utiliza-se sangue total anticoagulado com EDTA, os tubos com tampa são suavemente invertidos para garantir uma homogeneização adequada da amostra, o que permite obter resultados precisos, pois também aqui estão postos de lado procedimentos que possam levar a causas de erro e perda de amostra por abertura de tubos.
Para todo este processo analítico, temos disponível um kit de análise: O kit MINICAP HEMOGLOBIN (E), que permite, a separação efetiva das frações de hemoglobina e a deteção de um grande número de perfis de variantes de hemoglobina e talassemia.
As frações de hemoglobina são diretamente detetadas na absorbância específica de 415 nm. O padrão é dividido em 15 zonas. Cada zona exibe uma biblioteca suspensa de possíveis variantes que migram dentro desta zona. Mais de 300 variantes estão identificadas. (https://www.sebia.com/en-EN/produits/minicap-hemoglobine, s.d.). Representa-se nas figuras 7 e 8, o resultado da análise de dois casos tipo, em representação da forma heterozigótica e homozigótica da variante S da hemoglobina, e que da análise informática do equipamento com software próprio, permite a caracterização desta anomalia.
No SPC do HGO, o abandono da metodologia por HPLC, há cerca de 3 anos, deu-se em consequência de necessidades de utilização de métodos inovadores com ganhos evidentes para o serviço, e da existência de literatura científica e estudos que garantam e comprovem a utilização desta tecnologia em benefício e de boas respostas aos doentes. Foi ainda possível abandonar técnicas de doseamento de frações anormais por microcoluna de troca iónica, procedimentos muito manuais e demorados, com exigência de requisitos de recursos humanos escassos, e estruturais, que com a substituição por equipamentos mais eficientes, permite a otimização de todos estes recursos.
Da recolha da informação científica, está evidente a vantagem da utilização da Eletroforese Capilar.
Num estudo, onde, onde foi necessário investigar mais sobre hemoglobinopatias, numa região tropical, conclui-se que a separação exata e precisa dos tipos de hemoglobina, juntamente com a quantificação confiável, é essencial para o diagnóstico diferencial dessas doenças (Sangkitporn S, 2011)
Foi apresentado nesse estudo uma validação multicêntrica de um método de eletroforese capilar totalmente automatizado para separação de hemoglobina e quantificação envolvendo quatro laboratórios de referência na Tailândia. Foram verificadas as características de desempenho analítico, incluindo exatidão e precisão, foram ainda comparadas com os métodos validados de HPLC e LPLC existentes, utilizando 412 amostras de sangue de indivíduos não relacionados. A principal vantagem do sistema de Eletroforese Capilar, é a sua capacidade em separar e quantificar variantes que são importantes parâmetros necessários para o diagnóstico de hemoglobinopatias.
Assim, com a utilização deste equipamento, procedemos automaticamente à execução de todas as etapas necessárias para obtenção de um perfil final claro e nítido, onde a quantificação precisa e a identificação presuntiva das hemoglobinas mais comuns são o único objetivo. A separação de alta resolução das principais variantes da hemoglobina (Hb S, Hb C, Hb D e Hb E) e a quantificação precisa de Hb A2 e Hb F, Hb H e Hb Bart, tornam-se uma mais valia no diagnóstico destas patologias e no auxílio ao seu tratamento.
A eletroforese capilar, é assim considerada uma das técnicas de separação analítica, que tem encontrado uso extensivo em laboratórios pois a metodologia utilizada incluindo melhoria no tempo de resposta, alta produtividade, manipulação mínima da amostra, exigência de pequeno volume de amostra e custo razoável.
“Os critérios para tomar uma decisão pela aceitação do método foram considerados com base nas características de desempenho e aplicação” (Sangkitporn S, 2011)
São vantagens da tecnologia utilizada: • Nenhuma intervenção manual.
• Tipo de amostra: Sangue Completo
• Um instrumento simples e robusto
• O carregamento contínuo da amostra maximiza a produtividade e reduz o risco biológico.
• Reduz significativamente os erros com identificação de amostra positiva verdadeira dos tubos primários.
• Separação clara e precisa
• Reagentes e controles com código de barras evitam as ocorrências de erros
• Manutenção fácil
• Interpretações mais precisas: A Hb A2 precisa pode ser obtida na presença de Hb E, D, S ou G.
• Armazenamento de dados ilimitado
Embora a HPLC seja amplamente utilizada em laboratórios de rotina, muitas substâncias podem produzir interferência neste método, o que leva a necessidade de esclarecer estas situações. Os comumente encontrados na prática clínica incluem variantes de Hb, hemoglobina carbamilada (encontrada em pacientes com insuficiência renal) e HbF (aumentada na β-talassemia, persistência hereditária da hemoglobina HPFH fetal ou em recém-nascidos)”. (Xinqi Cheng, 2015)
A escolha por um método de eletroforese capilar, uma vez que no Laboratório do SPC, labora-se segundo as normas instituídas e de acordo com as guidelines existentes, pois para a quantificação, reprodutibilidade e eficiência na identificação de hemoglobinas parecerem ser precisas, também, o uso de tubos primários permite maior segurança, evitando algumas etapas manuais, que prolongam o tempo de trabalho e são fonte de possíveis erros. (Altinier S, 2013)
Em suma:
A utilização de um método de eletroforese capilar, vai ao encontro das conclusões referidas por estar constatado que: “O desempenho analítico foi aceitável para a determinação de HbA, HbA2, HbS e HbF, com imprecisão <2,0%. A comparação do método mostrou uma correlação linear para as medições de HbA2, HbF e HbS. A concordância clínica foi aceitável ao comparar o EC com o HPLC” (Kieffer, 2014)
Conclusões
A escolha para a implementação da metodologia da eletroforese capilar, foi baseada em literatura científica com evidencia comprovada para que os resultados possam ser viáveis e válidos, com garantia de qualidade e onde seja possível a otimização e racionalização de recursos, sejam eles humanos, materiais e financeiros pois Importa referir que, no âmbito do Programa de Estabilidade e Crescimento (2002-2005) apresentado à União Europeia, Portugal se tinha comprometido expressamente a converter em empresas publicas hospitais de media dimensão e com capacidade estrutural e experiencia positiva de desempenho que lhes permita, com dotação extraordinária de capital, melhorar as condições de qualidade e eficiência de desempenho e resolver o passivo acumulado, segundo o (preambulo da Resolução do Conselho de Ministros n.º 41/2002).
Estão sempre implícitas políticas de financiamento sustentável assim como a aplicação e escolha de metodologias para a realização de parâmetros analíticos, nomeadamente os constantes da metodologia descrita, onde têm que ser implícitas por motivos de constrangimentos orçamentais.
É Imperativo refletir sobre o debate para o financiamento dos cuidados de saúde, que assenta em duas grandes questões: a sustentabilidade, por um lado, e a equidade, por outro. Não se pode ignorar a importância de outros atributos como a efetividade, a eficiência e a qualidade, mas sem sustentabilidade os sistemas não conseguem funcionar e sem equidade perdem a sua razão de ser. (Campos & Simões, 2011)
Com pedidos de despiste de hemoglobinopatias superior a 1200 no ano de 2017, torna-se imperioso utilizar métodos eficazes e eficientes, que pelos motivos supra indicados, possam continuar a dar uma resposta, à missão a que se destina o Hospital Garcia de Orta, e onde e sempre