4 Using Cayuga and TelegraphCQ in the Home Care Scenario
4.6 Conclusion
Além das atividades já mencionadas, alguns ciclotídeos, como a Ciclopsicotrídeo A também apresenta atividade antagonista de neurotensina e inibitória contra tripsina, sendo esta última apresentada pelos McoTI-I e II (WITHERUP et al., 1994; TAM et al., 1999; FELIZMENIO-QUIMIO et al., 2001). Dentre a diversidade de atividades dos ciclotídeos, alguns peptídeos como Kalata B1, B2 e B5 possuem atividade inseticida, quando incorporados em dietas dos lepidópteros Helicoverpa punctigera, H. armigena, que são duas importantes pragas do algodão, apresentaram uma inibição de aproximadamente 70% do crescimento larval (JENNINGS et al., 2005).
Inicialmente, acreditava-se que a atividade inseticida poderia estar diretamente relacionada à inibição de algumas enzimas digestivas do inseto, como a tripsina, quimotripsina ou α-amilase (JENNINGS et al., 2001). Entretanto, em estudos realizados com
41 Kalata B1, demonstrou-se que a atividade inseticida deste ciclotídeo não afeta a atividade das enzimas digestivas do inseto, e sim a mudança na morfologia das células do epitélio do trato intestinal do inseto, levando formação de edema e lise celular (BARBETA et al., 2008).
A hipótese mais provável é que a Kalata B1 rompe a membrana plasmática das células epiteliais do inseto, ligando-se a receptores específicos na membrana do trato intestinal, formando buracos ou poros que conduzem à lise celular das células caliciformes e colunares (BARBETA et al., 2008). Esta hipótese é consistente com observações de outras moléculas que causam mudanças morfológicas semelhantes como as δ-endotoxinas e Vip3A de Bacillus
thugiriensis e da toxina do Complexo A de Photorhabdus luminescens (PURCELL et al.,
1993; BARBETA et al., 2008). Receptores específicos para os ciclotídeos com atividade inseticida não foram relatados, e sua atividade pode estar relacionada com a interação dos resíduos hidrofóbicos dos ciclotídeos expostos com os lipídeos presente na membrana do trato intestinal (KAMIMORI et al., 2005; SHENKAREV et al., 2006; BARBETA et al., 2008). Este modo de ligação foi proposto baseado nos estudos da especificidade da Kalata B1 com as dodecilfosfocolinas presentes na membrana, isto poderia explicar os efeitos específicos sobre as células intestinais dos insetos (SHENKAREV et al., 2006; BARBETA et al., 2008; COLGRAVE et al., 2010).
Também foi constatada atividade moluscicida dos ciclotídeos Cicloviolacina O2 e das Kalatas B1, B2, B7 e B8 contra o caracol maçã golden (Pomacea canaliculata), que ataca plantações de arroz (Oryza sativa). O mecanismo de ação dos ciclotídeos contra o molusco não foi elucidado até o momento, mas a excessiva secreção de muco e o modo de retração do caramujo em suas conchas na presença dos ciclotídeos indicam um processo de toxicidade semelhante ao moluscicida metaldeído (PLAN et al., 2008). O metaldeído causa danos nos mucócitos e parede cutânea do aparelho digestivo do molusco, levando inicialmente a secreção de muco excessivo seguido por alterações no metabolismo energético (TRIEBSKORN et al., 2007). Não está claro como metaldeído provoca a desintegração das células e muco, sendo que os ciclotídeos aparentemente adotam o mesmo mecanismo.
Em estudos recentes foi constatado que as Kalatas B1, B2, B6, B7 e a Cicloviolacina O2 além da atividade inseticida e moluscicida, apresentaram atividade anti-helmíntica contra os nematóides Haemonchus contortus e Trichostrongylus colubriformis, que atacam o sistema gastrointestinal de ruminantes. Contudo, foiSugerido que a atividade do ciclotídeo seja através da interação externa com a membrana epicutícula (rica em lipídeos) do nematóide
42 (LINDHOLM et al., 2002; HUANG et al., 2009; COLGRAVE et al., 2010). A sua atividade está relacionada com a presença de resíduos de carga positiva (COLGREVE et al., 2008; HUANG et al., 2009). Em pesquisas realizadas com modificações na estrutura da Kalata B1, através de inserção de resíduos de lisina em vários loops, foi observado aumento da atividade nematicida com uma inserção tripla de lisina (G1/K1, T20/K20 e N29/K29) localizado nos loops 1 (um), 3 (três) e 6 (seis). Uma diminuição da atividade foi vista em algumas substituições, como no caso V25/K25 (HUANG et al., 2009). Esses resultados mostraram quais são as regiões da estrutura que estavam envolvidas na atividade nematicida, também como, a inserção de cargas nesse loops auxilia na interação com a membrana (HUANG et al., 2009; COLGREVE
et al., 2010)
Em outros estudos alguns ciclotídeos exercem efeitos tóxicos sobre ancilostomídeos, que são os agentes determinantes da ancilostomose, conhecida popularmente com amarelão em humanos e cães (COLGRAVE et al., 2010). Na tabela 2 abaixo apresenta resumidamente algumas atividades dos ciclotídeos mais reportados na literatura.
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Tabela 2: Exemplos da atividade biológica de alguns ciclotídeos.
Ciclotídeos Espécie e Família aa* Atividade
Biológica Referências Kalata B1 Odenlandia affinis (Rubiaceae) 29 Anti-HIV Uterotônica Antimicrobiana Inseticida Hemolítica (SAETHER et al., 1995) (TAM et al., 1999) (JENNINGS et al., 2001) (BARRY et al., 2003) Kalata B2 Odenlandia affinis (Rubiaceae) 29 Antimicrobiana Inseticida Molucicida (JENNINGS et al., 2005) Ciclopsicotrídeo A Psychotria longipes (Rubiaceae) 31 Antagonista da neurotensina Antimicrobiana Hemolítica Citotóxica (TAM et al., 1999) (WITHERUP et al., 1994) Palicoureina Palicourea condensata (Rubiaceae)
37 Anti-HIV (BOKESCH et al., 2001)
Circulina A e B Chassalia parvifolia (Rubiaceae) 31/32 Anti-HIV Antimicrobiana Hemolítica (GUSTAFSON et al., 1994)
MCoTI-I e MCoTI-II Momordica conchinchinensis
(Curcubitaceae)
34 Inibidores de
tripsina (FELIZMENIO-QUIMIO et al., 2001)
Varv-peptídeo A-H Viola Arvensis
(Violaceae) 29 Citotóxica (LINDHOLM et al., 2002) cicloviolinas A-D Leonia cymosa
(Violaceae) A 31, B 28, E e D 30 Anti-HIV (HALLOCK et al., 2000) (PELEGRINI et al., 2007) Vitri A Viola tricolor
(Violaceae) 30 Citotóxica (SVANGARD et al., 2004) Vibi A-K Viola biflora A-D 29
E, I e K 30 F-H e J 31
Citotóxica (HERRMANN et al., 2008)
* número de resíduos de aminoácidos
A família Rubiaceae
A família Rubiaceae é uma das maiores entre as espécies de Angiospermas, sendo constituída por 4 (quatro) subfamílias, 44 (quarenta e quatro) tribos, cerca de 650 (seiscentos
44 e cinquenta) gêneros e mais de 13.000 (treze mil) espécies de hábitos essencialmente tropicais (GRUBER, 2010). As plantas pertencentes a esta família são amplamente distribuídas, adaptam-se a quase todos os ambientes variando de ambientes áridos, desérticos a úmidas florestas tropicais, e de regiões com clima sub-Ártico à tropical (COELHO et al., 2006; GRUBER, 2010).
Em sua maior parte as espécies desta família são características de regiões quentes, essencialmente tropicais, algumas podem ser encontradas em Savanas (COELHO e BARBOSA, 2003). Na América do Sul, uma das regiões que possui os maiores números de espécies de Rubiaceae, apresenta cerca de 1.200 (mil e duzentos) espécies distribuídas em uma faixa que vai do México até o Nordeste da Argentina superando todas as outras regiões do globo terrestre (BOLZANI et al., 2001; COELHO e BARBOSA, 2003). No Brasil, as espécies de Rubiaceae são amplamente distribuídas em 3 (três) dos 6 (seis) Biomas existente no país; como Floresta Atlântica, Floresta Amazônia e no Cerrado, predominando sob a forma de pequenas árvores e semi-arbustos, conferindo às espécies uma grande variedade de formas e estruturas (BOLZANI et al., 2001).
Dentro da famíliaa das Rubiaceaes, encontramos espécies de grande importância econômica, como o café (Coffea arabica) e o jenipapo (Genipa americana), que são de interesse, pois apresentam um caráter alimentício. Também encontramos nessa família a espécie Cinchona pubescens Vahl, conhecida popularmente com casca-dos-jesuítas, planta de grande interesse pelas indústrias farmacêuticas, por produzirem a Quinina, um alcalóide empregado no tratamento da malária (COELHO et al., 2006; GRUBER et al., 2007). Além destas espécies destacadas, existem várias outras que são referidas popularmente como medicinais ou tóxicas, como a murta-do-mato (Coutarea hexandra), vassourinha (Borreria
verticillata) entre outras espécies dos gêneros Cinchona, Richardia que são utilizadas na
medicina popular para o tratamento de diversas enfermidades. E entre as espécies tóxicas encontramos nos gêneros Palicourea e Psychotria, popularmente conhecidas como “mata- rato” (COELHO e BARBOSA, β00γ).
Vários estudos fitoquímicos já foram realizados com espécies de Rubiaceae, esses mostram que entre as substâncias isoladas, há uma grande variedade de classes e atividades biológicas. Com por exemplo: a antraquinina Alizarina obtida da espécie Rubia tinctorum, utilizada como corante; os alcalóides antimálaricos Cinconidina e Quinina isolados de
45 espécies do gênero Coffea, entre outros compostos (SIMÕES e A. E PETROVICK, 1997). A pesar destes estudos, ainda existem muitas espécies de plantas da família das Rubiaceaes que ainda permanecem sem qualquer estudo químico e biológico (GRUBER, 2010).
Desde a descoberta do primeiro ciclotídeo em uma Rubiaceae, várias pesquisas na busca de peptídeos cíclicos foram realizadas em espécies desta família, atualmente mais de 22 (vinte e duas) espécies pertencente as Rubiaceae apresentaram pelo menos um ciclotídeo, onde as principais espécies que apresentaram mais de um exemplar com algum tipo de atividade biológica são: Odenlandia affinis, Chassalia parvifolia, Psychotria vellosiana e Palicourea condensata (GRUBER et al., 2007; GRUBER, 2010). Com base na distribuição
dos ciclotídeos, estima-se que 50.000 destes peptídeos podem ser encontrados em espécies da família das Rubiaceaes (CRAIK et al., 2006; GRUBER et al., 2007; GRUBER, 2010).
Recentemente, Gruber e colaboradores realizaram um levantamento que investigou mais de 200 (duzentos) espécies de Rubiaceae espalhadas em diversos lugares de planeta. Nesse estudo eles descobriram 22 (vinte e dois) espécies que são aptas a expressar os ciclotídeos e outras espécies que foram encotrados moléculas lineares, mas estruturalmente similares com os ciclotídeos (GRUBER, 2010).
O Gênero Palicourea
O gênero Palicourea pertence à Palicoureeae da família Rubiaceae compreende cerca de 230 ( duzentos e trinta) espécies distribuídas do México até o Nordeste da Argentina (BOLZANI et al., 2001). Existem no planeta 3 (três) centros com grande variedades de espécies de Palicourea, e todos se encontram na América do Sul, sendo um deles a região do Planalto Centro Sul do Brasil, especificamente no Cerrado, apresentando cerca de 37 (trinta e sete) espécies diferentes de Palicourea (COELHO e BARBOSA, 2003). Dessas, só na região do Distrito Federal, são encontradas 5 (cinco) espécies diferentes de Palicourea, que são: a P.
coriacea, a P. croacea, a P. marcgravii, a P. officinalis e a P. rigida (COELHO e BARBOSA,
2003; SILVA, 2007).
As espécies de Palicourea destacam-se por apresentar diversas atividades biológicas, algumas com efeitos farmacológicos, podendo estar associados à presença de alcalóides indólicos, cumarinas, ácidos benzóicos, terpenóides, alcalóides, entre outros metabólitos
46 essenciais, muitas vezes tóxicos (KEMMERLING, 1996; RIBEIRO DE ASSIS et al., 2006). Em estudos fitoquímicos realizados em espécies do gênero Palicourea foi descrita a presença de diversos metabólitos , que são responsáveis por suas atividades farmacológicas, como a atividade antitumoral apresentada em espécies de Palicourea, estão associadas à presença de alcalóides indólicos, que muitas vezes estão associados a efeitos tóxicos (RIBEIRO DE ASSIS et al., 2006). Como por exemplo, a P. Marcgravii tem seus efeitos tóxicos atribuídos a fluoracetatos, às substâncias N-metiltiramina e 2-metiltetraidro- -carbolina, e o palicosídeo que é um alcalóide indólico glicosilado (KEMMERLING, 1996).
Já em extrato bruto da espécie P. demissa que possui atividade antiinflamatória e antiviral, foram isolados derivados do ácido benzóico, do triterpeno 3-friedelanona, das Cumarinas: Escopoletina, Isoescopoletina e Umbeliferona (COELHO e BARBOSA, 2003). Em análises feitas em amostras de planta de P. condensata, foi possível o isolamento de um novo peptídeo macrocíclico, pertecente a familias das ciclotídeos, a Palicoureina que possui 37 (trinta e sete) resíduos de aminoácidos apresentando um peso de 3,904 kDa, cujo estudo farmacológico demonstrou inibição “in vitro” de efeitos citopáticos causados pelo vírus HIV em linhagens de células humanas T-linfoblastóide (CEM-SS), apresentando um EC50
(Concentração eficaz, que provê 50% de proteção celular) de 10 μM e um IC50de 1,5 μM. Em
comparação com outros ciclotídeos que apresentam atividade anti-HIV, como as Circulinas A- F e Cicloviolinas A-D com EC50 que variam de 0,005 a β.8 μM respectivamente, a
Palicourena apresenta um EC50 mais alto (BOKESCH et al., 2001).
Em estudos de levantamento da distribuição da família dos ciclotídeos em espécies de Rubiaceae foram constatados que a tribo Palicoureeae e Psychotrieae são as principais fontes de ocorrência destes peptídeos. Nesse sentido das 46 (quarenta e seis) espécies estudadas destas duas tribos, em 10 (dez) foram confirmados a presença de ciclotídeos (GRUBER et al., 2007; GRUBER, 2010).
A Espécie Palicourea rigida
A Palicourea rigida (figura 8) é uma espécie arbustiva que pode atingir até 3 m de altura, possui ramos quadrangulares, suberosos, acinzentados e glabros, apresenta inflorescências terminais, com flores zigomorfas coloridas do amarelo ao laranja
47 avermelhado, polinizadas por beija-flores e grandes abelhas. Os frutos são pequenos e carnosos, quando maduros apresentam colorações de azuis ou pretos azulados que são dispersados por pássaros. Seu período de floração vai do mês de Outubro ao mês de Janeiro e de frutificação de Fevereiro a Maio (BOLZANI et al., 2001; SILVA, 2007).
Figura 8: Palicourea rigida, (Foto: Poliana Barros) encontrada na reserva do Parque Ermida Dom Bosco,
Brasilía-DF.
Sendo essa espécie muito comum na região do Cerrado e campos, apresentando distribuíção pelos Estados da região do Centro-Oeste, passando pelos Estados de Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Bahia. Devido à característica coriáceas de suas folhas, foi nomeada popularmente como Bate-caixa ou Gritadeira, também pode ser conhecida como Douradinha do Campo e Douradão (BOLZANI et al., 2001; LAU e BOSQUE, 2003).
A P. rigida é uma planta muito utilizada na medicina popular, através da preparação de decocto ou infusão das folhas para tratamento de doenças do sistema urinário como, cistite, oligúria, disúria e anúria, expectorante, bronquites, doenças pulmonares e infecções fúngicas e bacterianas. Em algumas regiões do Brasil, suas folhas e raízes são utilizadas no tratamento de sífilis, Já as folhas e casca do caule são utilizadas no tratamento de inflamações do aparelho reprodutor feminino (BOLZANI et al., 2001; SILVA, 2007).
48 Em estudos fitoquímicos foram isolados os triterpenos: 3-friedelanona, 30- hidroxifriedelan-3-ona, 3- -hidroxifriedelana, lupeol e de 3- -glucosilsitosterol, que podem estar relacionados à atividade antiinflamatória e antiviral (BOLZANI et al., 2001). Também foram encontrados iridóides como a loganina e secologanina, que podem estar relacionados com a ação antiiflamatória, antiviral, antimicrobiana entre outras atividades, os alcalóides indólicos monoterpênicos como a Vallesiachotamina, que é responsável pela atividade citotóxica frente às células humanas de melanoma SK MELL 37 (LOPES et al., 2004; SILVA, 2007). Além das antraquinonas como a 7-hidroxi-tectoquinona, que podem estar relacionadas com as atividades microbicidas e tripanocida apresentada pela planta (SILVA, 2007).
Devido à sua grande utilização na medicina popular e ao pouco estudo bioquímico dado a P. rigida. E ao conhecimento da existência de peptídeos cíclicos com atividade anti- HIV na P. condensata, espécie esta pertencente ao mesmo gênero da P. rigida, e da distribuição dos ciclotídeos em Rubiaceae. Torna-se concreta a iniciativa e a perspectiva de pesquisar e identificar a presença destes peptídeos cíclicos na P. rigida. Contudo, ela é uma planta em potencial para a produção de ciclotídeos, com possíveis atividades antimicrobianas ou inseticidas ou até mesmo atividade endógenas com anti-HIV, citotóxica entre outras. Que possam ser utilizados no desenvolvimento produtos e processos biotecnológicos, como novos fármacos ou ser utilizados na agroindústria no controle de pragas.
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JUSTIFICATIVA
No meio que vivemos tanto o homem como as plantas sofrem ataques de diversos patógenos. Entretanto o uso indiscriminado de compostos químicos (medicamentos, agrotóxicos entre outros) com o intuito de combater a proliferação destes agentes agrava este problema cada dia mais. Desta forma, novas doenças por microrganismos patogênicos resistentes surgem a cada dia, gerando graves problemas a saúde humana e a agricultura. Contudo o nosso país é um dos maiores produtores agrícolas, e é de grande importância a busca e desenvolvimento de novos compostos que sejam efetivos no combate as pragas que atacam as lavouras, assim gerando prejuízos consideráveis para os produtores. Entretanto, os peptídeos cíclicos nos últimos anos vêm se tornando fonte de pesquisas, devido ao seu grande potencial para a produção de produtos biotecnológicos. E entre os peptídeos cíclicos encontramos a família dos ciclotídeos, que são amplamente distribuídos em espécies das famílias das Rubiaceae e Violaceae. Além de possuírem uma elevada estabilidade estrutural, eles também apresentam uma variedade de atividade biológica, sendo uma delas potente efeito inibitório sobre o desenvolvimento de larvas de Lepidoptera.
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OBJETIVO
Isolar, identificar e caracterizar peptídeos cíclicos com atividade biológica a partir de folhas da espécie de planta Palicourea rigida pertencente à família das Rubiaceae do Cerrado.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar peptídeos cíclicos das plantas do Cerrado Bate-caixa (Palicoureia
rigida) utilizando métodos cromatográficos como exclusão molecular e de
fase-reversa, utilizando Cromatografia Líquida de Alta Performance e Cromatografia Líquida Ultra Rápida
Análise de massa molecular por meio de Espectrometria de Massa do tipo
Matrix-Assisted Laser Desorption Time of Flight MS (MALDI-ToF/ToF) e por Liquid Chromatography – Mass Espectrometry (LC-MS/MS);
Avaliar a atividade antibacteriana dos peptídeos isolados contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas patogênicas ao homem.
Avaliar a atividade inseticida in vivo dos peptídeos isolados contra larvas de
Diatraea saccharalis, e in vitro contra uma linhagem de célula SF-9, bem
como a sua atividade hemolítica em células de mamíferos;
Seqüenciar os respectivos peptídeos pelo método de novo através de MS/MS; Obter a estrutura tridimensional a partir das seqüências primárias obtidas por
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MATERIAL E MÉTODOS
Extração de Ciclotídeos
As diferentes amostras (folha, inflorescência e pedúnculo) de Palicourea rigida, vulgarmente conhecida como bate-caixa foram coletadas no Parque da Ermida Dom Bosco, em Brasília DF. As coletas ocorreram em dois períodos bem distintos, sendo realizadas no mês de Agosto (período da seca) e no mês de Dezembro (período chuvoso) no Distrito Federal. As amostras foram armazenadas a -80 oC. As diferentes partes da planta foram previamente lavadas com água destilada para remoção de qualquer resíduo de impureza que tenha permanecido no material. Em seguida as amostras foram trituradas em nitrogênio liquido (N2) e submetidas à extração através da homogeneização com a solução extratora de
diclorometano (DCM): metanol (MeOH) (1:1) (v:v), em uma concentração de 3:1 (v:g), permanecendo sob agitação em ambiente refrigerado por 12 h, seguida por filtração em algodão. Em seguida, uma nova porção de DCM:MeOH (1:1) (v:v) foi adicionado ao material triturado, seguindo as mesmas etapas descritas até a filtração. Após reunir todo o material filtrado em um funil de separação, a este foi adicionado 100 mL de H2O destilada, sendo
submetido à agitação vigorosa, seguida de repouso para separação das fases. Sendo que a fase orgânica foi descartada e a fase aquosa coletada em um recipiente. O mesmo procedimento foi repetido duas vezes com a fase aquosa. Então a fase aquosa foi identificada e congelada para ser liofilizada.
Procedimento de isolamento e purificação
Para remoção de taninos livres, a amostra foi aplicada em coluna com resina de poliamida (Fluka). Sendo que a amostra primeiramente foi liofilizada e acidificada com uma solução de ácido acético (AcOH) 2% e depois aplicada em uma coluna contendo 4 g de resina de poliamida. Esta resina já tinha sido previamente lavada com 200 mL da solução de álcool etílico (EtOH) 50%:AcOH 2% e equilibrada com 200 mL de solução de AcOH 2%. A aplicação da amostra tal qual sua eluição foi feita com 250 mL da solução de AcOH 2%, e
52 para a retirada de qualquer resíduo da amostra presente na coluna, foram aplicados 250 mL da solução EtOH 50%:AcOH 2%. Em seguida, as frações foram coletadas, identificadas e liofilizadas. Contudo, o material liofilizado foi então aplicado em uma concentração protéica de 86 μg total, e ressuspendido em 30% acetonitrila:0,1% ácido trifluoracético (TFA) em uma cromatografia de exclusão molecular, utilizando a coluna SuperdexMT Peptide 10/300GL 30 cm (GE Healthcare), com o objetivo de separar as moléculas de acordo com amassa molecular. A cromatografia ocorreu em um fluxo contínuo de 0,5 mL.min.-1. O volume para cada fração coletada foi de 1 mL, as leituras realizadas pelo equipamento, foram monitoradas a 216 nm e 280 nm, posteriormente o material coletado foram identificados e liofilizados. Em seguida, o material liofilizado foi ressuspendido em solução de TFA 0,1% e aplicado em uma coluna analítica de HPLC de fase-reversa (Vydac C-18), com eluição utilizando um gradiente linear de acetonitrila (5-95%) com um fluxo de 1,0 mL.min-1. A eluição protéica foi monitorada a 216 nm e 280 mn. Entretnto, para obter uma melhor purificação as frações coletadas no HPLC foram passada em uma cromatografia líquida ultra rápida (UFLC) em gradiente linear de ACN (05-95%) na eluição das proteínas, com um fluxo de 400 µL.min-1 a uma temperatura de 40 oC, usando uma coluna analítica C-18. As frações coletadas foram liofilizadas e analisadas por espectrometria de massa (CLAESON et al., 1998)
Análises de massa molecular por espectrometria de massa
Tanto os extratos da inflorescência, do pedúnculo, das folhas de diferentes épocas de coletas e a amostra purificada, foram reduzidas, alquiladas e digeridas de acordo com Shevchenko et al. (1996) com modificações. Inicialmente foram preparados 1 mL das soluções: tampão A (1g de cloridrato de guanidina (GdHCl):0,2 M de Tris-HCl pH 8), tampão B: (1g de cloridrato de guanidina (GdHCl):37 mg de iodoacetamida:1 M de Tris-HCl pH 8) e solução a 50 µM diitrotreitol (DTT) em água. Em seguida 200 µg do peptídeo puro foi ressuspendido em 500 µL do tampão A, com posterior adição de 85 µL da solução de DTT e incubada a 70 oC durante uma hora, para que a amostra seja reduzida. Passando este período, o material foi alquilado com adição de 450 µL do tampão B seguido de incubação por mais uma hora no escuro, em temperatura ambiente (SHEVCHENKO et al., 1996). A purificação da amostra foi realizada em coluna de fase-reversa C18 analítica de HPLC, utilizando uma
53 eluição em gradiente linear de acetonitrila (5-95%) com um fluxo de 1,0 mL.min-1, e monitorado por 216 nm e 280 mn. As frações coletadas foram analisadas no MALDI-ToF para verificar qual das frações correspondia ao peptídeo reduzido e alquilado. Contudo, a digestão do peptídeo puro foi realizada com a utilização associada de duas enzimas imobilizadas em gel de agarose; a tripsina (Therma) e a endoprotease Glu-C (endoGlu-C) (Therma). Primeiramente 150 µg do peptídeo reduzido e alquilado foi ressuspendido em 20 µL de solução de bicarbonato de amônio (NH4HCO3) 100 mM pH 8,1. Entretanto, antes das enzimas
serem aplicadas na amostra, tanto a tripsina como a endoGlu-C foram lavadas 3x com 50 µL da solução de 100 mM de NH4HCO3.Então foram adicionados 40 µg da tripsina na amostra
com peptídeo, o tubo contendo o material foi devidamente vedado e colocado sob agitação a