The Committee on Farm Animal Genetic Resources – Current Tasks

3.4.1 Papel da Superóxido Dismutase (S.O.D.) no efeito antioxidante e gastroprotetor do (-)-α-bisabolol em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos.

A atividade da SOD foi medida de acordo com Sun, Oberley e Li (1988). A quantidade da enzima foi avaliada, mediu-se a capacidade de inibir a redução fotoquímica do azul de nitro-tetrazolio (NBT). Nesse método a riboflavina reduzida fotoquimicamente gera O2- o qual reduz o NBT produzindo formazan que absorve no comprimento de onda de 560nm. Na presença de SOD a redução do NBT foi inibida. Os resultados foram expressos em unidades da enzima por grama de proteína, que é a quantidade de SOD necessária para inibir a taxa de redução do NBT em 50%. O homogenato (10% em tampão fosfato) foi centrifugado (10 minutos, 3600 rpm a 4°C). O sobrenadante foi retirado e centrifugado novamente (20 min, 12000 rpm, 4°C). Para o ensaio ultilizou-se o sobrenadante. Numa câmara escura foram misturados 1mL do meio de reação (tampão fosfato 50mM, EDTA 100nM e L-metionina 13mM pH ι,8) 30 μL da amostra, 1η0μL do NBT ιημM e 300 μL riboflavina 2μM. Os tubos contendo a solução obtida serão expostos a lâmpadas fluorescentes (15W) por 15 minutos. Ao término do tempo, levou-se o material ao espectofotômetro 560nm. A concentração de proteínas foi medida utilizando o método de Bradford (1976).

3.4.2 Papel da Catalase (CAT) no efeito antioxidante e gastroprotetor do (-)-α-bisabolol em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos.

A atividade da catalase tem como princípio a medida da velocidade de produção de O2 e H2O à proporção que a H2O2, utilizado como substrato, é hidrolisado de acordo com Maehly e Chance (1954). A atividade da enzima é medida em 230 nm, através de um espectrofotômetro Beckman DU, a atividade enzimática é medida através da leitura da variação da absorbância por minuto, durante 6 minutos e os resultados expressos em

39

µM/min/µg de proteína.

Foi preparado o meio da reação com H2O2 (18 mL) mais Tampão Tris HCl 1M, EDTA 5 mM pH 8,0 (1,0 mL) e H2O Milli Q (0,8 mL). Em seguida foi colocado na cubeta de quartzo 980 µL do meio de reação mais 20 µL do homogenato a 10%, e feita a leitura durante 6 min a temperatura de 37°C em espectrofotômetro a 230nm. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (1976).

3.4.3 Papel da Mieloperoxidase (MPO) no efeito antioxidante e gastroprotetor do (-)-α- bisabolol em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos.

Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do corpo por serem recrutados rapidamente ao local da inflamação através da quimiotaxia (ABBAS et al., 2002). O aumento significativo da atividade da mieloperoxidase (MPO) tem uma proporção direta ao número de neutrófilos infiltrados no tecido, portanto pode se utilizar sua atividade como índice de migração leucocitária e de estresse oxidativo (PERALTA; BARNARD; TURRENS, 1993). Os camundongos foram sacrificados 40 minutos após a administração do etanol, as amostras de estômago foram retiradas, e imediatamente congeladas em nitrogênio liquido. Após o congelamento, as amostras foram homogeneizadas em uma solução de Brometo de hexadeciltrimetilamônio 0,5% (HTAB) em tampão fostato 50mM pH 6.0 (1 ml por 50g do tecido). As amostras foram então centrifugadas a 4000 rpm numa temperatura de 4° C por 15 minutos para remover o material insolúvel. A MPO contida no sobrenadante (0,1ml) foi analisada espectrofotométricamente após a adição de 2,9 ml de tampão fosfato (50mM pH6) contendo 0,1θι mg/ml de hidrocloreto de -dianisidine e 0,0005% de peróxido de hidrogênio. As cinéticas de mudança na absorbância a 470 nm foram medidas no tempo 0 e 5 minutos (BRADLEY; CHRISTENSEN; ROTHSTEIN, 1982). A concentração de proteínas foi medida utilizando o método de Bradford (1976).

3.4.4 Papel da lipoperoxidação no efeito antioxidante, gastroprotetor do (-)-α-bisabolol em modelo de lesão gástrica induzida por etanol em camundongos

O grau de lipoperoxidação nos tecidos será medido através da determinação dos níveis de TBARS, conforme o método de Ohkawa et al. (1979), seguindo o protocolo a seguir.

40

Preparou-se o homogenato dos tecidos gástricos a 10% em solução de cloreto de potássio (KCl) 0,15 M. Retirou-se 250 µL do homogenato, em seguida foi adicionado 1,5 mL de ác. Fosfórico (H3PO4) 1% + 500 µL de solução de ác. Tiobarbitúrico 0,6%. Colocou-se em banho fervente (95-100 C) por 45 minutos. A mistura foi resfriada em água corrente e, em seguida, foi adicionado 2 mL de n-butanol, o tubo foi agito no vórtex por 1 min. O tubo foi centrifugado a 1200rpm/15min. Após a centrifugação foi retirado a fase orgânica para realização da leitura em espectrofotômetro (520-535 nm). Os resultados foram expressos em micromols de malonildialdeído (MDA) por mg de proteína. A concentração de proteínas foi medida utilizando o método de Bradford (1976).

- Curva-padrão de malonildialdeído (MDA)

A partir da solução padrão de MDA , foram preparadas as soluções a 0,627; 1,247; 2,4θ3; 4,8; 9,1θ e 1θ,ιιμmol. O branco foi feito com água destilada. A leitura da absorbância foi realizada a 520 e 535 nm, o valor utilizado foi a subtração da leitura em 535 da leitura em 520, para determinação da equação da curva-padrão de MDA

3.4.5 Dosagem de nitrito na amostra de estômago após lesão induzida por etanol em camundongos

O método é baseado na utilização do reagente de Griess que mostra a presença de nitrito na amostra por uma reação de diazotizerção que forma um cromóforo de cor rósea. O reagente é preparado utilizando partes iguais de Ácido fosfórico 5%, N-1-naftilenodiamina (NEED) 0,1%, Sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5% e Água destilada. Para realização do ensaio foi adicionado 100 µL do sobrenadante do homogenato a 10%, feito com tampão de fosfato de potássio, em 100 µL do reagente de Griess, para o branco foi adicionado 100 µL do reagente em 100 µL de tampão e para a obtenção da curva do padrão foram feitas diluições em série (100, 50, 25 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 µM) de nitrito. Todo o ensaio foi feito em uma placa de 96 poços e a leitura feita na faixa de absorbância de 560 nm. (GREEN; TANNENBAUN; GOLDMAN, 2000).

41

3.4.6 Dosagem de proteínas totais na amostra de estômago após lesão induzida por etanol em camundongos

O método é baseado na interação do corante Coomassie Blue G250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica que absorve fortemente em 595nm. Adicionou- se as soluções (albumina padrão, água destilada, tampão e amostras) aos poços. Em cada poço foi adicionado 40 L de solução. Por exemplo, se no poço foi adicionado 2 L da amostra, também receberá 38 L do tampão utilizado no preparo da amostra. Em seguida foi adicionado 200 L da solução de Bradford (DILUÍDA 5x), composição abaixo, em cada poço. Após 5 minutos foi lido em comprimento de onda de 595nm. (BRADFORD, 1976). - Formulação da solução de Bradford (concentrada 5x):

Coomassie Blue G250 0,1g Etanol absoluto 50mL Ácido o-fosfórico 100mL H2O q.s.p. 200 mL