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Com o objetivo de estudar a interação da enzima EcDHODH através da técnica SDSL, foram também realizadas mutações na região N-terminal para a enzima livre de aminoácidos nativos de cisteína. Para a realização destes estudos as quatro cisteínas nativas (C49, C70, C158 e C260) foram inicialmente mutadas por alaninas. Essas mutações foram feitas pela empresa Mutagenex – Inovative Mutagenesis Service (EUA) e o gene

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mutado religado no vetor pAG1. Para evitar confusões, a construção contendo o gene que codifica EcDHODH onde os códons que codificam cisteína foram substituídos por códons que codificam alanina será denominado de pAG1A.

Os mutantes obtidos com o procedimento descrito na seção 4.1.8.3, foram digeridos com 20 U da enzima de restrição XhoI e 50 U da enzima de restrição HpaI. O sítio de restrição para a enzima HpaI está localizado no gene pyrD antes do códon que codifica o primeiro resíduo de cisteína na seqüência de aminoácidos da EcDHODH, como ilustrado na Figura 16. A digestão foi realizada a 37 °C durante 14 horas.

Figura 16 _{– Esquema ilustrativo do gene codificador da EcDHODH em pAG1. Vermelho} corresponde à seqüência do plasmídeo pAG1; azul, seqüência codificadora de EcDHODH (gene pyrD), destacado em amarelo o códon de início ATG e o códon que codifica o primeiro resíduo de cisteína na seqüência da EcDHODH. XhoI corresponde ao sítio para a enzima de restrição de mesmo nome presente em pAG1. HpaI e KpnI, sítios para as enzimas de restrição presente nas posições 144 e 253 da seqüência de pyrD, respectivamente.

Os fragmentos de DNA foram purificados com o kit “Wizard SV gel and pCR clen-up system”, após eletroforese em gel de agarose 1%. Os fragmentos foram inseridos no plasmídeo pAG1A previamente linearizado com as mesmas endonucleases, Figura 17. A proporção plasmídeo:fragmento utilizada na reação de ligase foi 1:4, juntamente com 2 µL de tampão de ligação (10X) e 1 u/μL de T4 DNA ligase, a mistura foi incubada a 4 °C por 16 horas. As reações de ligação foram usadas para transformar a linhagem de E. coli, SO6740, e as possíveis colônias positivas foram selecionadas em meio de cultura LB contendo 50 µg/mL de ampicilina. Os clones positivos foram confirmados após extração do DNA plasmidial das colônias seguida de análise de restrição (com as enzimas supra citadas)

ATG TGC X h o I H p aI K p n 1 M1 C49

e a seguir enviados para o Laboratório de Cristalografia de Proteínas do IFSC/USP para seqüenciamento.

Todo o procedimento de clonagem realizado neste trabalho foi conduzido de acordo com as técnicas padrão de clonagem molecular descritas por Sambrook et al. [65].

Figura 17 _{– Esquema ilustrativo da clivagem dos fragmentos mutados em pAG1 e ligação} desses fragmentos em PAG1A. Vermelho representa à seqüência do plasmídeo pAG1; azul, representa a seqüência de nucleotídeos codificadora de EcDHODH e verde a seqüência codificadora de EcDHODH onde códons codificadores de cisteínas foram substituídos por códons codificadores de alaninas. Destacado em branco está o códon que codifica o primeiro resíduo de cisteína na seqüência da EcDHODH e a região em amarelo representa a mutação de interesse. XhoI corresponde ao sítio para a enzima de restrição de mesmo nome presente em pAG1. HpaI, sítio para a enzima de restrição presente na posição 144 da seqüência do gene codificador de EcDHODH.

4.1.9.1 Expressão e purificação dos mutantes de EcDHODH

O procedimento de expressão e purificação dos mutantes foi o mesmo adotado para a enzima livre de mutação (descrito nas seções 4.1.1 a 4.1.3), exceto pela utilização da linhagem SO6740 de E. coli para os experimentos de expressão. Esta cepa possui o gene

K p n I pAG1A ATG Xh o I Digestão XhoI/HpaI H p aI Xh o I H p aI Xh o I Digestão XhoI/HpaI ATG Xh o I H p aI Ligação Xh o I ATG H p aI ATG MUT MUT MUT

DNA mutado em pAG1

pAG1A + MUTAÇÃO

H

p

aI

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pyrD deletado para evitar a contaminação dos mutantes com a proteína nativa expressa pela bactéria.

4.1.9.2 Ressonância Paramagnética Eletrônica  Marcação de spin Sítio

dirigida (SDSL)

Alíquotas de 5 μL da solução estoque do marcador de spin MTSL a 200 mM em acetonitrila foram colocadas em tubos cônicos de vidro e secadas com nitrogênio a fim de promover a evaporação da acetonitrila. O filme de MTSL foi resuspenso em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, Triton X 100 0,1 % (v/v), agitado em vortex por alguns minutos e submetido a sonicação em sonicador de banho por 5 minutos para total solubilização do marcador de spin. A solução de MTSL e tampão foi adicionada à solução da EcDHODH nativa ou aos mutantes de EcDHODH obtidos como descrito na seção 4.1.9. A mistura proteína-MTSL foi mantida sob agitação suave, 4 °C durante a noite (aproximadamente 16 h) a fim de maximizar a marcação.

Como o detergente Triton X-100 em altas concentrações pode interferir na interação marcador-proteína podendo diminuir a acessibilidade do marcador à cisteína livre, a marcação foi testada em diferentes etapas do processo de purificação dos mutantes de EcDHODH: 1) a marcação da EcDHODH mutante foi feita com a solução de proteína eluída da coluna DEAE Sepharose, sendo que após a marcação os demais passos cromatográficos foram mantidos para a obtenção de amostras homogêneas e livres de contaminantes, como descrito na seção 4.1.3.2; 2) a marcação da enzima EcDHODH mutante foi feita com a solução de proteína eluída durante a ultima etapa cromatográfica na coluna Phenyl Sepharose. A seguir a amostra foi concentrada e dialisada exaustivamente (a fim de promover a remoção das moléculas de marcador livres na solução) para a realização das medidas de RPE. No ultimo caso o tampão utilizado para resuspender o filme de MTSL foi fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, EDTA 0,1 mM, Triton X-100 0,5 % (v/v).

Após marcação as amostras foram incorporadas a vesículas de DOPC, como descrito na seção 4.1.7. As amostras foram colocadas em cela chata de quartzo (100 μL) e as medidas de RPE foram realizadas à temperatura ambiente no espectrômetro Varian E109 descrito anteriormente. As condições de medida foram: modulação 100 kHz, amplitude de modulação 1,0 G; potência 20 mW e varredura 100 G.

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