Foi realizada análise genotípica da região HR1 e HR2 da gp41 do HIV-1, por meio de sequenciamento gênico, a fim de avaliar retrospectivamente a presença de mutações de resistência em amostras de plasma de indivíduos respondedores e não respondedores ao tratamento com T20.
O indivíduo foi considerado respondedor quando apresentou carga viral do HIV-1 com nível abaixo de 50 cópias/mL após seis meses de tratamento com T20.
De um total de 33 pacientes selecionados para o estudo, 18 foram excluídos devido à ausência no banco de amostras e falta do paciente em uma das coletas pré-agendadas anteriormente ao nosso estudo. Dos 15 restantes, onze tiveram as três amostras encontradas referentes aos momentos antes do tratamento (baseline), seis meses e 12 meses após início do tratamento com T20 e quatro
tiveram duas amostras encontradas, referentes às coletas das visitas baseline e seis
meses. Após separar, aliquotar e estocar este material, havia um total de 41 amostras para análise. Purificamos e realizamos as PCRs das 41 amostras separadas, e todas tiveram o resultado positivo. No sequenciamento foram geradas 82 sequências, mas não foi possível a edição de cinco delas, excluindo no final dois pacientes (os dois com três visitas). Após esta etapa, verificamos que sete indivíduos apresentavam um perfil de resposta ao tratamento com T20 por um período de 12 meses, 4 apresentavam um perfil de resposta por pelo menos 6 meses e dois pacientes não haviam respondido ao tratamento entre 6 e 12 meses.
Onze pacientes entraram no estudo com a contagem de linfócitos T CD4+ abaixo de 200 células/mm3. A exceção foram os pacientes 2 e 8 que tinham 656 e 826 células/mm3, respectivamente, e 2 log10 de carga viral (CV), que por critério médico receberam o T20 por apresentarem perfil de resistência ao HAART observado no teste de genotipagem para os genes da transcriptase reversa e protease. As cargas virais após 6 meses foram indetectáveis (<50 copias/mL) em 69,23% (9/13) dos pacientes.
A média de idade dos indivíduos avaliados foi de 44,92 ± 5,39, sendo 46,16% do sexo feminino e 53,84% do sexo masculino. Dos 13 pacientes analisados no nosso estudo, 12 pertencem ao subtipo B e 1 ao subtipo F1 (Tabela 5). Em
relação ao tropismo, oito pacientes apresentaram o correceptor CCR5 e cinco o correceptor o CXCR4 (Tabela 6). De acordo com referências da literatura e com o consenso da agencia francesa ANRS (National Agency for AIDS Research) não
foram encontradas mutações de resistência entre as posições 36 a 45 da HR1 (incluindo o GIV) em todos os momentos avaliados de cada paciente.
No paciente 4 observamos a presença da mutação primária N42S que reverteu após seis meses. Este paciente teve a viremia indetectável após seis meses e manteve ganho na contagem de linfócitos T CD4+ (166,41%). O paciente 11 também apresentou a mutação N42S com reversão em seis, mas manteve a viremia em nivel detectável e perda de linfócitos T CD4+ por oito meses. O paciente 5, que apresentou as mutações T133N, E137K e S138T, manteve a carga viral acima do nível de detecção e perdeu TCD4+ ao longo dos nove meses de acompanhamento.
Em dois pacientes (2 e 8) já mencionados, por apresentarem contagem de linfócitos T CD4+ acima de 500 células/mm3, um (paciente 2) teve perda de células nos primeiros seis meses e a carga viral somente indetectou com 12 meses de tratamento, enquanto o paciente 8 manteve contagem acima de 500 células/mm3 e também somente indetectou no mês 12.
Para analisar as trocas de aminoácidos, comparamos as sequências geradas de cada paciente nos momentos seis e 12 meses após o inicio do tratamento com T20 com a sequência do momento baseline. Assim, avaliamos a influência da
presença das mutações primárias sobre a resposta ao T20 e se estas mutações persistem com o tempo.
Na região HR1 foram analisadas as trocas de aminoácidos nas posições 25 a 84, e na região HR2 as posições analisadas foram da 126 a 162, referentes aos 36 aminoácidos que constituem o T20.
Após a análise dos aminoácidos na região HR1 no período de 6 meses em relação ao momento baseline (13 pacientes), não encontramos modificações nas
posições 36 a 45. De um total de 59 aminoácidos analisados nessa região, observamos 15 trocas diferentes em 11 destas posições (18,64%), são elas: T25M, N32Q, N42S, K46R, A50V, H53Q, I62V, V69L, I69V, R77Y, R77G, G77K, Q80R, I84L e R84I (6,66% cada). Entre as trocas descritas tivemos a N42S que é responsável por diminuição da susceptibilidade da droga (Tabela 3).
Tabela 3 – Mutações encontradas entre os aminoácidos 25 a 84 da região HR1 do gene da gp41 das sequências de DNA estudadas.
As trocas de aminoácidos nos momentos seis e doze meses após o inicio do tratamento com T20 foram comparadas com a sequência do momento baseline, assim foi possível avaliar a importância das substituições dos aminoácidos intra-paciente ao longo do tratamento com T20.
O símbolo "•" indica que não houve troca de aminoácidos em relação a sequência baseline de cada paciente.
Respondedor: paciente que apresenta CV indetectável (<50 copias/mL) após seis meses de
tratamento com T20.
Não respondedor: paciente que apresenta falha virológica (aumento da CV), definida pela não
manutenção da CV indetectável: CV maior que 400 cópias/mL após 24 semanas; CV maior que 50 cópias/mL após 48 semanas e Indivíduos que tiveram rebote (CV passando de indetectável para maior que 400 cópias/mL).
Na região HR2 nesse mesmo período, encontramos 22 trocas em 14 posições diferentes (38,88%), são elas: T133N e L135I (9,09% cada); N126S, T128S, N129D, N129G, L130E, T130L, S133K, T133R, E136A, E136Y, E137N, E137K, Q147L, A151K, Q154K, S156A, S157N e S160T (4,54% cada) (Tabela 4).
Tabela 4 – Mutações encontradas entre os aminoácidos 126 a 162 da região HR2 do gene da gp41 das sequências de DNA estudadas.
As trocas de aminoácidos nos momentos seis e doze meses após o inicio do tratamento com T20 foram comparadas com a sequência do momento baseline, assim foi possível avaliar a importância das substituições dos aminoácidos intra-paciente ao longo do tratamento com T20.
O símbolo "•" indica que não houve troca de aminoácidos em relação a sequência baseline de cada paciente.
Respondedor: paciente que apresenta CV indetectável (<50 copias/mL) após seis meses de
tratamento com T20.
Não respondedor: paciente que apresenta falha virológica (aumento da CV), definida pela não
manutenção da CV indetectável: CV maior que 400 cópias/mL após 24 semanas; CV maior que 50 cópias/mL após 48 semanas e Indivíduos que tiveram rebote (CV passando de indetectável para maior que 400 cópias/mL).
Com a análise dos aminoácidos na região HR1 no período de 8 meses ou mais em relação ao momento baseline (9 pacientes), não encontramos modificações
nas posições 36 a 45. De um total de 59 aminoácidos analisados nessa região, observamos 12 trocas diferentes em 9 destas posições (15,25%), são elas: T25M, S42N, K46R, H53Y, I62V, V69L, I69V, R77Y, G77K, Q80R, I84L e R84I (8,33% cada) (Tabela 3). Na região HR2 nesse mesmo período, encontramos 20 trocas em 13 posições diferentes (36,11%), são elas: T133N e L135I (10% cada); N126S, T128S, N129D, N129G, S129N, L130E, T130L, S133K, T133R, E136A, E137K, Q147L, A151E, Q154K, S157N e S160T (5% cada) (Tabela 4).
Para verificarmos se houve resposta virológica sustentada, aplicamos o teste t de student pareado para variáveis dependentes, a fim de comparar as médias
de CV apenas dos indivíduos com três visitas (9 pacientes, sendo 7 respondedores e 2 não respondedores), Desta forma, as visitas referentes a 8 meses ou mais pertencem ao mesmo grupo.
Em seguida aplicamos novamente esse mesmo teste estatístico, mas apenas nos indivíduos respondedores e com as três visitas, sendo a última delas a de 12 meses.
No Box-plot abaixo observamos o teste t de student pareado que aponta
que há uma significativa redução da média de carga viral do baseline para 6 meses
(p=0.034), mas não há diferença significativa quando se compara a média de 6 meses com a média de 8 meses ou mais.
Amost ra C a rg a V ir a l ( cp / m L) 8 meses ou mais 6 meses Antes 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0
Grágico 1 - Box-splot Ilustrando a Média de Carga Viral nas visitas: baseline (Antes), 6 e 8 meses ou mais.
O Gráfico abaixo demonstra que no teste t de student pareado há uma
significativa redução da média de carga viral do momento antes para 6 meses (p=0.013), mas não há diferença significativa quando se compara a média de 6 meses com a média de 12 meses.
C a rg a V ir a l ( cp / m L) 12 meses 6 meses Antes 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0
Grágico 2 - Box-splot Ilustrando a Média de Carga Viral nas visitas: baseline (Antes), 6 e 12 meses.
A recuperação do sistema imunológico foi estudada por comparações dos momentos baseline, seis e 12 meses após o início do tratamento com T20. Na
contagem de linfócitos T CD4+, não encontramos diferença estatística significante entre as médias dos diferentes grupos de amostras quando aplicamos a análise de variância (ANOVA – p=0,1).
O teste de Wilcoxon foi aplicado para verificar se o uso de T20 interfere de maneira significativa nesta contagem. Este é um teste não-paramétrico equivalente ao teste t pareado. O Box-plots a seguir ilustra estes resultados:
C o n ta g e m d e C D 4 12 meses 6 meses Antes 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
Grágico 3 - Box-splot Ilustrando a Média de Contagem de Linfócitos T CD4+ nas visitas:
baseline (Antes), 6 e 12 meses.
Foi observado por meio do gráfico acima que o uso do medicamento tem interferência significativa quando são comparadas as amostras no momento antes e 6 meses (p=0.004) e no momento antes e 12 meses (p=0.022). Entre 6 meses e 12 meses a interferência não foi significativa.
Tabela 5 – Características dos pacientes estudados.
Subtipo: subtipagem feita utilizando sequências da região gp41 (envelope). CV: carga viral
(cópias/mL); CD4: contagem de linfócitos T CD4+ (células/mm3).
M: masculino; F: feminino.
Respondedor: paciente que apresenta CV indetectável (<50 copias/mL) após seis meses de
tratamento com T20.
Não respondedor: paciente que apresenta falha virológica (aumento da CV), definida pela não
manutenção da CV indetectável: CV maior que 400 cópias/mL após 24 semanas; CV maior que 50 cópias/mL após 48 semanas e Indivíduos que tiveram rebote (CV passando de indetectável para maior que 400 cópias/mL).
HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment; AZT: zidovudine; 3TC: lamivudine; TDF: tenofovir; EFV: efavirenz; SQV: saquinavir; RTV: ritonavir; LPV: lopinavir; DRV : darunavir; T20: enfuvirtide e Kaletra: lopinavir/ritonavir.
Com o intuito de se verificar como as variáveis respondedor, presença do correceptor CXCR4 e diferentes mutações na região V3 se relacionam, foi realizada a análise por agrupamento hierárquico (HCA). Esta técnica faz parte de uma categoria de métodos conhecidos em conjunto como análises de clusters e é
similares. Uma análise de clusters se inicia com a construção de uma matriz de
dados. Enquanto as colunas contem dados dos objetos dos quais se deseja estimar a similaridade, as linhas são os atributos ou propriedades desses objetos.
Nesse estudo, as variáveis, respondedores, correceptor X4 e as diferentes mutações na região V3 são os objetos, enquanto os atributos correspondem à presença ou ausência de cada objeto para os diferentes pacientes. A matriz construída baseia-se em dados binários (zero e 1, que correspondem respectivamente à ausência ou à presença de um determinado objeto). A HCA foi aplicada por clusterização de variáveis e, empiricamente, os melhores resultados para análise de agrupamentos entre as diferentes variáveis foram obtidos utilizando o método Average Linkage ou ligação por média utilizando medida de distância por
correlação e nível de similaridade de 0,5 para a formação dos clusters. Este método
levou à construção de dendrogramas de similaridade envolvendo todas as variáveis citadas.
A interpretação de um dendrograma de similaridade entre amostras fundamenta-se na intuição. Duas amostras próximas devem ter também valores semelhantes para as variáveis medidas, ou seja, elas devem ser próximas matematicamente no espaço multidimensional. Portanto, quanto maior a proximidade entre as medidas relativas às amostras, maior a similaridade entre elas. O dendrograma hierarquiza esta similaridade de modo que podemos ter uma visão bidimensional da similaridade ou dissimilaridade de todo o conjunto de amostras ou variáveis utilizado no estudo.
O dendrograma abaixo mostra que a maioria dos indivíduos que responderam ao tratamento com T20, possui genótipo R5 (tropismo por monócitos, macrofragos). Dois pacientes respondedores ao T20 apresentaram genótipo X4. Entre as variáveis indivíduos respondedores e genótipo R5 há alto valor de similaridade (76.98). Ocorreu agrupamento entre as duas amostras dos respondedores com genótipo X4 com as mutações 306, 311 e 320, que o caracterizam.
Variables S im ila ri ty 327K 329Y 316A 304R 303R 315L 320R 311R 306G CXCR 4 310A 313R 308H 300S 311W 309M R5 Resp onde r -0.00 33.33 66.67 100.00
Gráfico 4 - Dendrograma Ilustrando os Agrupamentos Obtidos a partir da Análise por HCA (agrupamento hierárquico) com Método Complete Likage e Nível de Similaridade de 0.5.
Tabela 6 - Mutações encontradas entre os aminoácidos 296 a 330 da região V3 do gene do envelope do HIV-1 das sequências de DNA estudadas.
O símbolo "•" indica que não houve troca de aminoácidos em relação a sequência de referência indicada no site geno2pheno® [coreceptor] (2007) (http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de).
Respondedor: paciente que apresenta CV indetectável (<50 copias/mL) após seis meses de
tratamento com T20.
Não respondedor: paciente que apresenta falha virológica (aumento da CV), definida pela não
manutenção da CV indetectável: CV maior que 400 cópias/mL após 24 semanas; CV maior que 50 cópias/mL após 48 semanas e Indivíduos que tiveram rebote (CV passando de indetectável para maior que 400 cópias/mL).