Bransjeanalyse - “Porter’s 5 krefter”

mesenteroides FT045B

3.2.1. Organismo

Leuconostoc mesenteroides FT 045 B foi isolada de usina de açúcar e álcool pela Divisão de Controle Microbiológico de Processo Industrial da Fermentec (Brasil).

3.2.2. Enzimas

(a) Leuconostoc mesenteroides B-512FMC dextranasacarase (portanto B- 512FMC dextransucrase) foi obtida do mutante constitutivo Leuconostoc mesenteroides B-512FMC (Kim & Robyt, 1994a; Kim & Robyt, 1994b). O

sobrenadante da cultura foi concentrado e dializado em tampão piridina acetato (pH 5,2) através de cartucho “hollow fiber” (10 cm x 1m, H5P100-43, Amicon, Inc., Beverly, MA) (KITAOKA e ROBYT, 1998). A atividade da dextranasacarase B512FMC foi de 89 IU/mL pelo método 14C-sacarose, no qual 1.0 IU = 1,0 µmol de ᴅ-glicose incorporada na dextrana por minuto;

(b) Leuconostoc mesenteroides FT045B dextranasacarase (portanto FT045B dextranasacarase) foi obtida a partir da Leuconostoc mesenteroides FT045B. O meio de crescimento para a bactéria Leuconostoc mesenteroides FT 045 B foi composto por sacarose (40 g/L), extrato de levedura (20 g/L), K2HPO4 (20 g/L), CaCl2 (0,02 g/L), MgSO4 (0,2 g/L), NaCL (0,01 g/L), FeSO4 (0,01 g/L) and MnSO4 (0,01 g/L). Esta linhagem foi estocada à -20° C em soluções criogênicas até a preparação do inoculo (5% v/v) para a fermentação. O micro-organismo foi transferido a partir da cultura estoque para meio similar e foi incubado a 25° C por 18h. O meio de cultura foi centrifugado por 30 minutos à 13.300g pelo método 14C- sacarose, no qual 1,0 IU = 1,0 µmol de ᴅ-glicose incorporada na dextrana por minuto;

(c) A Dextranase de Penicillium sp foi obtida da Sigma (pó liofilizado, 10- 25 unidades/mg sólidas, uma unidade libera 1,0 µmol de isomaltose (quantificado como maltose) por minuto em pH 6,0 a 37° C, usando dextrana como substrato. O pó foi dissolvido em solução tampão (piridina/acetato 20 mM, pH 5,5) para obtenção de 5 IU/mL.

3.2.3. Dextrana referência

Dextrana B512F adquirido da Sigma Company.

3.2.4. Produção de Dextrana

A reação enzimática foi preparada pela adição de 40 mL de solução tampão (piridina/acetato 20 mM, pH 5,2) a 50 mL de solução sacarose 400 mM e aquecimento a 30 ºC por 10 minutos. A reação enzimática teve início pela adição de 10 mL da enzima dextranasacarase (2 UI/mL) produzida por Leuconostoc mesenteroides FT045B a 30 ºC por 33 horas (2 períodos de conversão). No final do tempo reacional, 200 mL de etanol gelado foi adicionado à reação para precipitar a dextrana produzida, sendo posteriormente mantida a 4 ºC por 24 horas.

A dextrana precipitada foi centrifugada a 13300 g por 30 minutos e dissolvidas em água. Após completa solubilização, a solução foi resfriada em gelo por 10 minutos. A dextrana foi precipitada novamente pela adição de 200 mL de etanol, agitada e centrifugada por 30 minutos a 13300 g. A solubilização e a precipitação foram repetidas mais uma vez para garantir que não havia frutose nem sacarose presentes. A dextrana foi tratada de cinco a sete vezes com acetona e uma vez com etanol anidro e seca em forno à vácuo a 40 ºC por 18 horas.

3.2.5. A massa molar media e o grau de polimerização

A massa molar media e o grau de polimerização (DPn) (JANE e ROBYT, 1984) da dextrana foi determinada pela medição do valor de redução usando o método bicincroninato de cobre e a quantificação dos carboidratos pelo método fenol-ácido sulfúrico (FOX e ROBYT, 1991). Grau de polimerização = DPn = [(carboidratos totais em µg de D-glicose)÷(valor redutor em µg de maltose)] x 1,9; massa molar média = Mn = [(DPn) x 162] + 18.

3.2.6. Hidrólise da dextrana por endodextranase

A dextrana produzida (10 mg) foi dissolvida em 960 µL de solução tampão (piridina/acetato 20 mM, pH 5,5). Uma alíquota de 40 µL de endodextranase (5 IU/mL) foi adicionada e incubada a 37 ºC por 14 horas. Alíquotas de 100 µL foram retiradas em 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 840 minutos.

5 µL de ácido trifluoracético foram adicionados à cada uma das alíquotas, que foram aquecidas a 50 ºC por 10 minutos para parar a reação.

3.2.7. Análise dos produtos da hidrólise, usando cromatografia em camada delgada

Uma alíquota de 1 µL de cada amostra da hidrólise com endodextranase e padrões de isomaltodextrina e maltodextrina foram aplicados à 15 mm a partir da base da placa de CCD (Whatman 5K), com micro seringa Hamilton.

Os tamanhos das aplicações foram mantidos entre 2 e 3 mm pela adição de 1 µL por vez, secando nos intervalos. A placa foi irrigada até o topo de 20 a 22 ºC usando acetonitrila/acetato de acetato de etila/1-propanol/água 85:20:50:70 (v/v/v/v) em três ascensões. Após a separação, os carboidratos puderam ser visualizados pelo mergulho da placa de CCD em solução de etanol contendo 0,5% (m/v) α-

naphthol e 5% (v/v) H2SO4. Após a secagem, a placa de CCD foi colocada em forno por 10 minutos a 120 ºC. As manchas dos carboidratos tiveram sua densidade mensurada pela utilização de Densitômetro de Imagem (Bio-Rad densitometer, Model GS-670).

3.2.8. Valores redutores dos produtos da hidrolise da dextrana

Os valores redutores dos produtos da hidrolise da dextrana foram quantificados pelo método bicincroninato de cobre (FOX e ROBYT, 1991). Os valores obtidos foram plotados versus tempo de reação.

3.2.9. Reação do aceptor com maltose e sacarose (1:1)

A reação enzimática foi preparada pela adição de 5 mL de sacarose 400 mM e maltose 400 mM preparados em solução tampão (piridina/acetato 20 mM, pH 5,2) à 5 mL da enzima dextranasacarase (2 IU/mL) produzida por Leuconostoc mesenteroides FT045B e incubada à 30 ºC por 10 horas. Alíquotas de 200 µL foram retiradas em 5, 10, 30, 60, 120, 180, 300 e 600 minutos.

10 µL de ácido trifluoracético foram adicionados a cada alíquota, que foi aquecida à 50 ºC por 10 minutos para parar a reação. A mesma reação foi conduzida com a dextranasacarase produzida por Leuconostoc mesenteroides B512FMC.

3.2.10. Análise dos produtos da reação do aceptor da dextranasacarase usando CCD

Uma alíquota de 1 µL de cada amostra e padrões de isomaltodextrinas foi aplicada à 15 mm da base da placa de CCD (Whatman 5K), com micro seringa Hamilton. O tamanho das aplicações foram mantidos entre 2 e 3 mm pela adição de 1 µL por vez, secando nos intervalos. A placa foi irrigada até o topo de 20 a 22 ºC usando acetonitrila/acetato de acetato de etila/1-propanol/água 85:20:50:70 (v/v/v/v) em três ascensões. Após a separação, os carboidratos puderam ser visualizados pelo mergulho da placa de CCD em solução de etanol contendo 0,5% (m/v) α- naphthol e 5% (v/v) H2SO4. Após a secagem, a placa de CCD foi colocada em forno por 10 minutos a 120 ºC. As manchas dos carboidrados tiveram sua densidade mensurada pela utilização de Densitômetro de Imagem (Bio-Rad densitometer, Model GS-670).

3.2.11. Espectroscopia de 1H NMR

Os espectros de 1H NMR da dextran B512-F e FT045B foram obtidos em D2O usando um Bruker spectrometer a 500 MHz (Germany).

3.2.12. Análise de espectrofotometria de infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR)

O espectro FT-IR para as dextranas B512-F e FT045B foram obtidos pelo preparo de pastilha com 150 mg de KBr e 5 mg de dextrana sob pressão.

3.3. Otimização do meio de cultura para produção de dextranasacarase