2.4 Supervised learning
2.4.3 How the bias-variance tradeoff affects modelling in practice 17
Na primeira administração de MNPs via endovenosa, encontrou-se uma hipotensão transitória com uma queda de aproximadamente 47% da PAM em níveis pré-administração, no grupo1, e uma queda de aproximadamente 49% da PAM, no grupo 2, como mostram as figuras 26 e 27, respectivamente.
Figura 26 - Média da PAM sem MNPs (basal) e após a primeira administração de MNPs no grupo 1. (***)p<0,001.
54 Figura 27 - Média da PAM sem MNPs (basal) e após a administração de MNPs no
grupo 2. (***)p<0,001.
A comparação entre a queda da PAM na primeira administração de MNPs nos animais do grupo 1 com queda encontrada na a administração do grupo 2, está apresentada na figura 28.
Figura 28 – Porcentagem média de queda da PAM na primeira administração de MNPs nos animais do grupo um em comparação coma porcentagem de queda encontrada na administração de MNPs nos animais do grupo 2.
55 A primeira administração de MNPs apresentou uma hipotensão nos dois grupos de animais. Os testes estatisticos não revelaram diferença significativa entre a primeira administração de 0,3ml de MNPs no grupo 1 e a administração de 0,9ml de MNPs no grupo 2. Esses dados mostram que a queda da PAM não aumenta com o aumento da dose de MNPs.
A figura 29 apresenta a média das porcentagens da variação da PAM em administrações consecutivas.
Figura 29 – Porcentagem médias de queda da PAM em cada uma das administrações de MNPs no grupo 1.
O teste estatístico aplicado encontrou diferenças significativas entre as diferentes administrações, o que significa que as administrações adicionais promovem menor queda na PAM do que a primeira administração. O teste estatístico apresentou uma tendência linear, ou seja, a cada administração a PAM tende a cair menos, o que torna relativamente simples o possível controle de hipotensão em estudos futuros utilizando a associação de drogas vasoconstritoras como a fenilefrina. Além disso, a menor queda da PAM em administrações adicionais permitem reajustes da dose de MNPs, quando necessária, em casos terapêuticos, como entrega guiada de fármacos ou hipertermia magnética. Essa hipotensão transitória pode se dar por estresse de cisalhamento das MNPs na parede dos vasos, o que acarreta em liberação de óxido nitrico pelas células endoteliais dos vasos sanguíneos culminando em vasodilatação e consequente
56 hipotensão, e pode se dar, também, por outros mecanismos cardíacos e/ou vasculares que influenciam os valores de PA.
Os tempos de manifestação do pico de hipotensão encontrados estão apresentados na figura 30.
Figura 30 - Médias dos tempos de manifestação da hipotensão máxima observada em cada uma das administrações no grupo 1.(****) p<0,0001.
Existiram diferenças significativas nos tempos de manifestação de hipotensão entre a primeira e as demais administrações, porém os tempos de manifestação encontrados nas segundas e terceiras administrações não diferem estatísticamente entre si. A ocorrência dessa diferença estatística encontrada pode ser explicada pela biodisponibilidade de óxido nítrico, ou outros agentes de regulação pressórica, no organismo do animal, ou seja, nas primeira administração as células endoteliais dos vasos apresentavam grande biodisponibilidade de agentes de regulação pressórica e consequentemente a liberação destes agentes foi maior do que nas últimas administrações, onde a reserva pode ter diminuido consideravelmente. Essa questão abre, ainda, um nicho de possíveis estudos visando o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos com a hipotensão transitória após administração endovenosa de MNPs, os quais não foram alvo deste trabalho.
A figura 31 apresenta a comparação entre as médias dos tempos de manifestação da hipotensão máxima entre a primeira administração do grupo1 e a adiministração no gurpo 2.
57 Figura 31 - Médias dos tempos de manifestação da hipotensão máxima observada em
cada grupo.
Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os tempos de manifestação de hipotensão máxima entra a primeira administração no grupo 1 e a administração no grupo 2.
Os tempos de recuperação da PAM, nas três administrações realizadas no grupo 1, estão apresentados na figura 32.
Figura 32 - Médias dos tempos de retorno da PAM aos níveis pré-administração em cada uma das administrações no grupo 1.(****)p<0,0001.
58 O tempo de recuperação da PAM à níveis pré-administração foi de aproximadamente 5,9 ± 0,6 minutos na primeira administração, 0,56 ± 0,13 minutos na segunda administração e 0,64 ± 0,2 minutos na terceira administração, o que evidencia o perfil transitório de hipotensão encontrado. Desta forma, apesar da administração endovenosa de MNPs, nas doses utilizadas neste trabalho, apresentar uma queda significativa da PAM, essa hipotensão se apresenta com perfil transitório e de fácil recuperação. Em adição pode ser reportada também a ausência total de óbitos dos animais empregados neste estudo, corroborando o fato de que a hipotensão se mostra de fácil recuperação e não letal.
Foi realizada a comparação dos tempos recuperação da PAM na primeira administração de MNPs no grupo 1 com a administração de MNPs no grupo 2, como mostra a figura 33.
Figura 33 - Médias dos tempos de recuperação da hipotensão máxima observada em cada grupo
A comparação exposta na figura 33 mostra que não existiram diferenças significativas entre os tempos de recuperação da primeira administração de MNPs no grupo 1 e a administração realizada no grupo 2. A partir deste dados, e de anteriores, pode-se concluir que a dose de MNPs não influencia diretamente nos parâmetros hemodinâmicos, pois em todas as comparações hemodinâmicas realizadas entre as primeiras administrações de 0,3ml e as administrações de 0,9ml de MNPs, não existiram diferenças significativas, o que indica a possibilidade de que o fator
59 preponderante nas alterações hemodinâmicas, é a presença de MNPs na corrente sanguínea, e não a dose.
A figura 34 e 35 mostram que a primeira administração endovenosa de MNPs, em ambos os grupos, causou pequenas alterações na FC.
Figura 34 - Média da FC sem MNPs (basal) e após a primeira administração de MNPs no grupo 1.
Figura 35 - Média de FC sem MNPs (basal) e após a administração de 0,9ml de MNPs no grupo 2.
As figuras 34 e 35 mostraram que a média da FC cardíaca obteve uma pequena queda, porém significativa (p=0,0184 para o grupo 1 e p=0,0003 para o grupo 2). Na primeira administração de MNPs no grupo 1 a FC teve aproximadamente -7 ± 2% de
60 queda. Enquanto que no grupo 2, a administração de 0,9ml de MNPs apresentou uma queda de aproximadamente -7 ± 1%. Porém esse parâmetro (FC) é passível de alta variabilidade e apresenta valores muito diferentes ao longo do dia para o mesmo animal. A partir desta afirmação e observando as mínimas variações encontradas, foi realizado um teste estatístico de colunas nas três administrações do grupo 1, onde foi observado se essa variação encontrada é diferente de zero (figura 36).
Figura 36 - Média da porcentagem de alteração da FC em cada uma das administrações de MNPs no grupo 1.
A figura 36 mostra as variações de FC em cada uma das administrações do grupo 1. A estatística de coluna comparou cada valor de variação de FC com o valor hipotético, sendo neste caso o valor hipotético igual à zero, e não obteve diferenças estatisticas significativas, ou seja, apesar da figura 34 e 35 apresentarem uma queda significativa na FC, essas variações ao longo das administrações consecutivas, não diferiram de zero. Esses dados mostram que se essa variação existe, ela é mínima, não diferindo de zero no teste estatístico de colunas. Uma vez que as MNPs se mostram quase que inertes sobre a FC, isso sugere um perfil seguro de administração endovenosa das MNPs do ponto de vista da FC.
Foram, também, realizadas quantificações de arritmias cardíacas por meio de análise de perfil elétrico cardíaco. A figura 37 quantifica as arritmias encontradas no periodo pré administração e após a primeira administração de MNPs no grupo 1.
61 Figura 37 - Arritmias cardíacas no período pré administração e após a primeira
administração de MNPs nos animais do grupo 1.
A figura 38 apresenta os valores de arritmia por minuto encontrados no período pré administração de MNPs e após a administração de 0,9ml de MNPs nos animais do grupo 2.
Figura 38 - Arritmias cardíacas no período pré administração e após a administração de MNPs nos animais do grupo 2.
62 As arritmias encontradas em cada uma das administrações nos animais do grupo 1 estão apresentadas na figura 39.
Figura 39 - Arritmias cardíacas encontradas em cada administração de MNPs nos animais do grupo 1.
As análises de perfil elétrico cardíaco, apresentadas na forma de arritmias por minutos, não apresentaram diferenças estatísticas significantes em relação aos valores encontrados no período pré-administração, como pode ser observado nas figuras 37 e 38. A figura 39, que apresenta os valores de arritmia por minuto nas três administrações consecutivas de MNPs, mostra que também não existiram diferenças estatísticas entre a primeira e as demais administrações. Os dados apresentados nas figuras 37, 38 e 39 solidificam a hipótese de que a administração endovenosa das MNPs utilizadas neste trabalho não causa arritmia cardíaca no animal, mostrando um perfil seguro de administração do ponto de vista do perfil elétrico cardíaco.
63
5
Conclusão
Conclui-se, então, que o sistema BAC obteve bom rendimento quando aplicado para o monitoramento das MNPs no sistema circulatório de pequenos animais. O sistema foi capaz de detectar as MNPs na circulação sanguínea, detectar a chegada das MNPs no coração e inferir sobre o perfil de captação e retenção das MNPs pelo organismo em tempo real pela avaliação do perfil de decaimento do sinal, avaliações que não eram possíveis até o momento devido à falta de instrumentação com alta resolução temporal e capacidade de aquisição online. Também concluiu-se que o sistema BAC é capaz de detectar pequenos volumes de MNPs perfundidas em órgãos e tecidos, fazendo um paralelo com a instrumentação encontrada na área de medicina nuclear, porém sem o uso de radiação ionizante e com um menor custo. A BAC se mostra vantajosa neste tipo de análise, já que outras metodologias que utilizam o principio de ressonância magnética (como a relaxometria ou a espectroscopia ressonância paramagnética eletrônica (EPR)) são de alto custo, complexos e não são capazes de obterem dados online ligados à dinamicidade das MNPs no organismo do animal vivo.
O sistema BAC também obteve ótima performance quando comparado com a técnica de EPR na avaliação do destino final das MNPs no organismo do animal. O sistema BAC apresentou uma ótima correlação linear com a técnica de EPR e as análises de concordância de Bland Altman corroboram a validação da BAC para análises de biodistribuição. A BAC ainda obtém vantagens sobre o sistema de EPR no que diz respeito às suas características de viabilidade, pois apresenta menor custo e portabilidade.
O perfil de biodistribuição mostrou maior retenção de MNPs no fígado, pulmão e baço, respectivamente, devido às características morfofisiológicas destes órgãos. A partir destes dados, o sistema se mostrou capaz, também, de avaliar a biodistribuição das MNPs no organismo do animal através da quantificação do sinal da BAC referente a cada órgão coletado, viabilizando uma nova ferramenta em estudos de biodistribuição e perfusão de órgãos e sistemas.
As MNPs utilizadas neste trabalho (MnFe2O4 – recobertas com citrato)
64 primeira administração, num período de aquisição de sinais de aproximadamente 30 minutos, o que torna viável a sua utilização como contraste em estudos fisiológicos onde o marcador, ou traçador, necessite de características como tamanho reduzido, dinamicidade e tempo de meia vida eficiente. MNPs semelhantes já são utilizadas como contraste na área de ressonância magnética e se mostraram como um contraste seguro, bem tolerado e com bons resultados, sendo eliminados da circulação após certo período de tempo (KONG et al., 2012; NUNES et al., 2014; WAGNER et al., 2002; WUNDERBALDINGER et al., 2002b).
Na primeira administração no grupo 1 e na administração no grupo 2, o efeito hipotensor se manifestou entre o 1º e 2º minuto. Nas segundas e terceiras administrações no grupo 1 esse efeito se mostrou mais rápido, se manifestando em torno de 20 segundos após a administração. Após a 1ª administração a PAM retorna em aproximadamente 5 minutos aos valores basais, enquanto que nas administrações seguintes esse intervalo é muito menor, em torno de 35 segundos. A administração endovenosa não promove alterações bruscas na FC, muito menos no perfil elétrico cardíaco. Apesar de ter sido observada uma hipotensão, ela se mostrou transitória e de fácil e rápida recuperação, o que faz com que a administração endovenosa das MNPs seja relativamente segura. Ainda que neste trabalho tenha sido encontrada essa hipotensão transitória e leve alteração da FC, na literatura existem trabalhos de impacto que não encontraram essas alterações (NUNES et al., 2014). Porém no presente estudo as doses utilizadas foram maiores e com uma taxa de administração diferente de trabalhos anteriores, além de utilizar um tipo diferente de anestésico, mais potente, que deprime o sistema nervoso central, responsável pelo controle de uma série de mecanismos hemodinâmicos e cardiovasculares.
Os resultados obtidos até o presente momento sugerem fortemente o uso da técnica BAC como método de avaliação destes parâmetros e motivam ensaios adicionais visando futuras caracterizações pré-clinicas de MNPs em termos de T1/2 e perfis de
biodistribuição. Sendo assim, a Biosusceptometria AC oferece uma valiosa alternativa na área devido às características intrínsecas da técnica (aquisição online, resolução temporal, custo e invasividade baixos). Dentro deste contexto, este trabalho se mostra relevante, uma vez que há uma grande quantidade de tipos de MNPs disponíveis na literatura a serem testadas, órgãos a serem pefundidos e monitorados em situações normais e alteradas, além de inúmeras possibilidades de marcação de tecidos como
65 tumores e células tronco. Em adição, as avaliações realizadas ainda podem ser aprimoradas, utilizando uma bomba de infusão mecânica, diferentes conjugações de MNPs que inerfiram de formas diferentes na PAM e comparação dos resultados obtidos com outras técnicas padrão.
66
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Referências bibliográficas
AGOSTINHO, M. et al. Ac biosusceptometry as a method for measuring gastric contraction. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, v. 2010, p. 5740-3, 2010a. AMERICO, M. F. et al. Scintigraphic validation of ac biosusceptometry to study the
gastric motor activity and the intragastric distribution of food in humans.
Neurogastroenterol Motil, v. 19, p. 804-11, 2007.
ANDREIS, U. et al. Gastric motility evaluated by electrogastrography and alternating current biosusceptometry in dogs. Physiol Meas, v. 29, p. 1023-31, 2008. AXEL, L. Blood-flow effects in magnetic-resonance imaging. American Journal of
Roentgenology, v. 143, p. 1157-1166, 1984.
BAFFA, O. et al. Analysis and development of ac biosusceptometer for orocaecal transit time measurements. Med Biol Eng Comput, v. 33, p. 353-7, 1995. BAKUZIS, A. F. et al. Chain formation and aging process in biocompatible
polydisperse ferrofluids: Experimental investigation and monte carlo simulations. Advances in Colloid and Interface Science, v. 191, p. 1-21, 2013. BAKUZIS, A. F.; MORAIS, P. C.; PELEGRINI, F. Surface and exchange anisotropy fields in mnfe2o4 nanoparticles: Size and temperature effects. Journal of
Applied Physics, v. 85, p. 7480-7482, 1999.
BELLIVEAU, J. W. et al. Functional cerebral imaging by susceptibility-contrast nmr.
Magn Reson Med, v. 14, p. 538-46, 1990.
BENMAIR, Y. et al. Study of gastric-emptying using a ferromagnetic tracer.
Gastroenterology, v. 73, p. 1041-1045, 1977a.
BENMAIR, Y. et al. Evaluation of a magnetic method for measurement of small intestinal transit-time. American Journal of Gastroenterology, v. 68, p. 470- 475, 1977b.
BERGEMANN, C. et al. Magnetic ion-exchange nano- and microparticles for medical, biochemical and molecular biological applications. Journal of Magnetism and
Magnetic Materials, v. 194, p. 45-52, 1999.
BERNARD, S. L. et al. High spatial resolution measurements of organ blood flow in small laboratory animals. Am J Physiol Heart Circ Physiol, v. 279, p. H2043- 52, 2000.
BRANQUINHO, L. C. et al. Effect of magnetic dipolar interactions on nanoparticle heating efficiency: Implications for cancer hyperthermia. Scientific Reports, v. 3, p. 2013.
BRANQUINHO, L. C. et al. Effect of magnetic dipolar interactions on nanoparticle heating efficiency: Implications for cancer hyperthermia (vol 3, 2887, 2013).
Scientific Reports, v. 4, p. 2014.
BULTE, J. W. M. et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nature Biotechnology, v. 19, p. 1141-1147, 2001. CANNON, J. A. et al. Experience with a new electro-magnetic flow-meter for use in
blood-flow determinations in surgery. Ann Surg, v. 152, p. 635-47, 1960. CARRIAO, M. S.; NETO, K. S.; BAKUZIS, A. F. Mass magnetophoretic experiment
67 for magnetohyperthermia. Journal of Physics D-Applied Physics, v. 47, p. 2014.
CHEN, L. T.; WEISS, L. The role of the sinus wall in the passage of erythrocytes through the spleen. Blood, v. 41, p. 529-37, 1973.
CHERTOK, B. et al. Comparison of electron spin resonance spectroscopy and inductively-coupled plasma optical emission spectroscopy for biodistribution analysis of iron-oxide nanoparticles. Molecular Pharmaceutics, v. 7, p. 375- 385, 2010.
CHERTOK, B. et al. Iron oxide nanoparticles as a drug delivery vehicle for mri monitored magnetic targeting of brain tumors. Biomaterials, v. 29, p. 487-496, 2008.
CHOI, H. S. et al. Renal clearance of quantum dots. Nature Biotechnology, v. 25, p. 1165-70, 2007.
COLE, A. J. et al. Magnetic brain tumor targeting and biodistribution of long- circulating peg-modified, cross-linked starch-coated iron oxide nanoparticles.
Biomaterials, v. 32, p. 6291-301, 2011.
CORA, A. et al. Magnetic images of the disintegration process of tablets in the human stomach by ac biosusceptometry. Physics in Medicine and Biology, v. 50, p. 5523-5534, 2005a.
CORA, L. A. et al. Disintegration of magnetic tablets in human stomach evaluated by alternate current biosusceptometry. Eur J Pharm Biopharm, v. 56, p. 413-20, 2003.
CORA, L. A. et al. Pharmaceutical applications of ac biosusceptometry. Eur J Pharm
Biopharm, v. 74, p. 67-77, 2010.
CORA, L. A. et al. Influence of compression forces on tablets disintegration by ac biosusceptometry. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 69, p. 372-379, 2008.
CORA, L. A. et al. Gastrointestinal transit and disintegration of enteric coated magnetic tablets assessed by ac biosusceptometry. Eur J Pharm Sci, v. 27, p. 1-8, 2006. CORA, L. A. et al. Ac biosusceptometry in the study of drug delivery. Adv Drug Deliv
Rev, v. 57, p. 1223-41, 2005b.
DAGHASTANLI, N. A. et al. Oesophageal transit time evaluated by a biomagnetic method. Physiol Meas, v. 19, p. 413-20, 1998.
ECKENHOFF, J. E.; HAFKENSCHIEL, J. H.; ET AL. The measurement of coronary blood flow by the nitrous oxide method. Am J Med Sci, v. 214, p. 693, 1947. FONSECA, P. R. Imaging regular phantoms through acb tomography. 18th
International Conference on Medical Physics, v. p. 2011.
GAMARRA, L. F. et al. Quantitative ferromagnetic resonance analysis of cd133 stem cells labeled with iron oxide nanoparticles. Journal of Physics-Condensed
Matter, v. 20, p. 2008.
GILL, R. W. Measurement of blood-flow by ultrasound - accuracy and sources of error.
Ultrasound in Medicine and Biology, v. 11, p. 625-641, 1985.
GOODWILL, P. W. et al. Narrowband magnetic particle imaging. Ieee Transactions
on Medical Imaging, v. 28, p. 1231-1237, 2009.
HAFELI, U. O. et al. Optical method for measurement of magnetophoretic mobility of individual magnetic microspheres in defined magnetic field. Journal of
68 KETTERING, M. et al. Magnetic nanoparticles as bimodal tools in magnetically induced labelling and magnetic heating of tumour cells: An in vitro study.
Nanotechnology, v. 18, p. 2007.
KETY, S. S. The theory and applications of the exchange of inert gas at the lungs and tissues. Pharmacol Rev, v. 3, p. 1-41, 1951.
KONG, S. D. et al. Magnetic targeting of nanoparticles across the intact blood-brain barrier. J Control Release, v. 164, p. 49-57, 2012.
KRAUSE, H. J. et al. Magnetic particle detection by frequency mixing for immunoassay applications. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, v. 311, p. 436-444, 2007.
KRISTENSEN, J. K.; WADSKOV, S. Studies on 133xe wash-out from human skin: Quantitative measurements of blood flow in normal and corticosteroid-treated skin. Journal of Investigative Dermatology, v. 68, p. 196-200, 1977.
LEE, J. H. et al. Artificially engineered magnetic nanoparticles for ultra-sensitive molecular imaging. Nature Medicine, v. 13, p. 95-99, 2007.
LEWIN, M. et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nature Biotechnology, v. 18, p. 410-414, 2000.
LOICHEN, J.; HARTMANN, U. Cell-surface interactions involving immobilized magnetite nanoparticles on flat magnetic substrates. European Biophysics
Journal with Biophysics Letters, v. 38, p. 891-901, 2009.
LUBBE, A. S.; ALEXIOU, C.; BERGEMANN, C. Clinical applications of magnetic drug targeting. Journal of Surgical Research, v. 95, p. 200-206, 2001.
MARCIANI, L. Assessment of gastrointestinal motor functions by mri: A comprehensive review. Neurogastroenterology and Motility, v. 23, p. 399- 407, 2011.
MARCUS, M. L.; WILSON, R. F.; WHITE, C. W. Methods of measurement of myocardial blood-flow in patients - a critical-review. Circulation, v. 76, p. 245- 253, 1987.
MIQUELIN, C. A. et al. Pharyngeal clearance and pharyngeal transit time determined by a biomagnetic method in normal humans. Dysphagia, v. 16, p. 308-12, 2001. MIRANDA, J. R. A. et al. Susceptometric measurement of gastric-emptying.
Biomagnetism : Clinical Aspects, v. 988, p. 635-638, 1992.
MIRANDA, J. R. A. et al. A novel biomagnetic method to study gastric antral contractions. Physics in Medicine and Biology, v. 42, p. 1791-1799, 1997. MORAES, R. et al. Measurement of gastric contraction activity in dogs by means of ac
biosusceptometry. Physiol Meas, v. 24, p. 337-45, 2003.
MOREIRA, M.; MURTA, L. O.; BAFFA, O. Imaging ferromagnetic tracers with an ac biosusceptometer. Rev. Sci. Instrum., v. v. 71, p. n. 6, 2000.
NUNES, A. D. et al. Manganese ferrite-based nanoparticles induce ex vivo, but not in vivo, cardiovascular effects. Int J Nanomedicine, v. 9, p. 3299-312, 2014. OLIVEIRA, R. B. et al. Evaluation of a biomagnetic technique for measurement of
orocaecal transit time. Eur J Gastroenterol Hepatol, v. 8, p. 491-5, 1996. OLIVEIRA, R. B. et al. A biomagnetic technique for orocecal transit-time
measurement. Biomagnetism : Clinical Aspects, v. 988, p. 631-634, 1992. OLSON, T. P. et al. Effects of respiratory muscle work on blood flow distribution
during exercise in heart failure. J Physiol, v. 588, p. 2487-501, 2010.
OVITT, T. W. et al. Intravenous angiography using digital video subtraction: X-ray imaging system. AJR Am J Roentgenol, v. 135, p. 1141-4, 1980.
69 PAIXAO, F. C. et al. A novel biomagnetic instrumentation with four magnetoresistive sensors to evaluate gastric motility. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, v.