PGE2
Na figura 20, observou-se que o pré-tratamento com os antagonistas seletivos dos receptores canabinoides, CB1 e CB2, respectivamente, AM251 e AM630, reverteu de forma significativa (p<0,05) a antinocicepção da colite experimental induzida por TNBS (três dias após a indução) tanto na hipernocicepção induzida por carragenina (painel A) quanto por PGE2 (painel B)
quando comparado esse grupo de animais com o grupo etanol (EtOH) e o grupo salina. A reversão da antinocicepção da colite por TNBS foi observado em todos os tempos em estudo. (painéis A e B). A administração dos antagonistas canabinóides em animais sem colite não exerceu nenhum efeito sobre a hipernocicepção da carragenina ou da PGE2.
Figura 20 - Participação da via endocanabinóide no efeito antinociceptivo da colite por TNBS sobre a hipernocicepção induzida por Carragenina ou PGE2. Três dias após a indução das colites por TNBS ou etanol (EtOH) ou administração de salina via transanal, a atividade antinociceptiva das colites foram avaliadas 3 e 4 horas após a injeção intraplantar de carragenina (500µg/pata; 100 µl; painel A) ou PGE2 (100ng/pata; 50µl; painel B) através da
medida da força em gramas (g), aplicada por meio de um analgesímetro digital. AM 251 (80 µg/pata; 50 µl) e AM 630 (25 µg/pata; 50 µl) foram administrados intraplantarmente 30 minutos antes da administração da carragenina ou PGE2. As barras representam a média ± força
expressa em gramas (n = 6). *p<0.05 em relação ao grupo salina. (a) p<0.05 em relação ao grupo etanol. (#) p <0,05 em relação ao grupo TNBS+PGE2 ou TNBS+Carragenina.
ANOVA/BONFERRONI.
sal EtOH AM251 AM630 AM251 AM630 sal EtOH AM251 AM630 AM251 AM630 0 10 20 30 40 50 TNBS Carragenina TNBS Carragenina
*
*
# # # 3ª hora 4ª hora # A a a In tensi d ad e d e hi p e rn o c ic ep çã o Δ d a for ça e m gr a m a ssal EtOH AM251 AM630 AM251 AM630 sal EtOH AM251 AM630 AM251 AM630 0 10 20 30 40 50 TNBS PGE2 TNBS PGE2
*
# #*
# # 3ª hora 4ª hora B a a In te nsi d a d e d e hi p e rn o c ic e p ç ã o Δ da f o rç a e m g ra m a sFigura 21 - Foto micrografia mostrando o aumento da expressão de receptores
canabinoides tipo I (painel C) e tipo II (painel D) no colon de animais com colite induzida por TNBS quando comparados esses grupos de animais com animais que receberam somente salina via anal. Esses grupos de animais sem colite estão representados nos painéis A (canabinoide tipo I) e B (canabinoide tipo II). Aumento de 100X.
DISCUSSÃO
Vários são os fatores descritos como causadores de doenças inflamatórias intestinais. Na tentativa de elucidar os possíveis mecanismos envolvidos na fisiopatologia dessas doenças foram desenvolvidos vários modelos de doenças inflamatórias intestinais. Um modelo clássico na indução de colite é administração colônica de TNBS. Estudos realizados por Wallace et al. (1995) mostraram que a administração do TNBS no cólon por via retal aumentou a atividade de MPO no colon e levou a um aumento dos escores macroscópicos de lesão. Outro dado na literatura também mostrou que o TNBS diluído em etanol a 50% foi capaz de produzir colite levando a um aumento dos escores macroscópicos de microscópicos de lesão (APPLEYARD; WALLACE, 1995).
Os nossos resultados mostraram que os grupos de animais que receberam etanol a 50% ou TNBS tiveram um aumento significativo do peso úmido de seus cólons quando comparados com os animais que receberam somente salina via transanal três e quatorze dias após a indução das colites experimentais. Além disso, os mesmos grupos (grupo etanol e TNBS) de animais tiveram também aumento significativo dos escores microscópicos e macroscópicos de lesão e aumento da atividade de MPO no colón após o terceiro dia da indução das colites. A partir desses resultados foi possível confirmar a eficácia das substâncias em estudo na indução das colites experimentais.
Vários estudos da literatura vêm propondo que uma das hipóteses para a instalação da fisiopatologia da doença de Crohn é a falha na produção de
substancias pró-inflamatórias agudas responsáveis por atraírem neutrófilos para o foco da infecção. Dentre essas substancias, estão as citocinas, como por exemplo, a IL-1, a IL-8 e o TNF-α. A liberação dessas citocinas por macrófagos é essencial para a ativação e atração neutrofílica para o local da lesão tecidual e para o início do combate contra a proliferação da doença (STROBER et al., 2002). Outro dado da literatura mostrou que pacientes com doença de Crohn apresentavam falha na migração de neutrófilos não só para o foco da infecção, mas também para uma região distante do foco primário da lesão (colon) e que essa falha viria associada também com a diminuição produção de citocinas, como por exemplo, a IL-8 (MARKS et al., 2006). Além disso, vários dados da literatura que estudam de forma clínica ou experimental as colites, mostraram que essas doenças colônicas influenciam diretamente na sensibilidade neuronal periférica, levando a um aumento do limiar de dor ao calor e a estímulos mecânicos (CHANG et al., 2000; TRAUB et al., 2004). Assim, uma proposta por nós sugerida foi a de estudar a influência da doença de Crohn experimental sobre a hipernocicepção inflamatória induzida longe do foco primário da lesão colônica.
Após a validação dos modelos de doenças inflamatórias intestinais, foi investigada a influência dessas doenças em eventos hipernociceptivos e inflamatórios agudos. Estudos mostraram que colites induzidas por óleo de mostarda produziam antinocicepção a estímulos térmicos aplicados nas patas de ratos. Reforçando essa hipótese outro achado revelou que a inflamação colônica em pacientes ativava uma via descendente contra-regulatória hipossensitiva que ativava a liberação de opióides endógenos levando a uma diminuição da excitabilidade neuronal nociceptiva e a uma modulação da
sensação dolorosa (CHANG et al., 2000). Confirmando os achados da literatura nossos resultados mostraram que em animais com colite induzida por TNBS, observou-se uma diminuição da intensidade de hipernocicepção quando comparados com os outros grupos em estudo. Essa antinocicepção foi observada tanto na hipernocicepção induzida tanto por carragenina (Cg) quanto por PGE2 (três e quatorze após a indução) e em todos os tempos em
estudo. O fenômeno da hipernocicepção/hiperalgesia é induzido por mediadores inflamatórios, como, prostaglandinas (PGE2) e aminas simpáticas,
que sensibilizam diretamente neurônios nociceptores periféricos. Essa mesma hiperalgesia, quando induzida por Cg, é gerada de uma forma indireta. A Cg desencadeia a liberação de bradicinina que provoca a liberação de medidores pro - inflamatórios, como por exemplo, a IL-β e TNF-α. Esses mediadores juntos estimulam a produção e liberação de prostaglandinas e aminas simpáticas e o acúmulo de substancias pró-inflamatorias irão sensibilizar o terminal nociceptivo (FERREIRA et al., 1979; NAKAMURA et al., 1987; CUNHA
et al., 2008). A partir dos nossos dados, podemos inferir que a colite induzida por TNBS produz antinocicepção por inibir de uma forma direta a hiper excitabilidade neuronal induzida por Cg ou PGE2.
A cascata de eventos inflamatórios desencadeados pela administração Cg inicia-se com a liberação de bradicinina e IL-1β e TNF-α e termina com a produção e liberação de prostanóides (PGE2). Essas substâncias liberadas são
crucias para a instalação e manutenção do processo inflamatório agudo. Como a colite induzida por TNBS produziu antinocicepção tanto na hipernocicepção induzida por Cg quanto por PGE2, uma segunda proposta nossa foi verificar se
uma correlação direta com a diminuição da intensidade de parâmetros inflamatórios agudos.
Assim, o primeiro parâmetro inflamatório estudado foi o edema de pata. Trata-se de um modelo experimental utilizado para se avaliar a resposta inflamatória aguda. Esse sinal cardinal da inflamação pode ser induzido por varias substancias como, por exemplo, carragenina (Cg) e dextran (DXT). Os nossos resultados demonstraram que animais com colite induzida por TNBS tiveram diminuição da atividade edematogênica induzida por carragenina (três e quatorze dias após a indução das colites). Esse resultado demonstra que esse modelo de colite é capaz de diminuir um dos parâmetros da resposta inflamatória aguda. Dados na literatura mostram que o edema de pata gerado por Cg aumenta o volume da pata de uma forma tempo-dependente e essa droga induz edema em duas fases, sendo uma inicial e a outra final (VINEGAR et al., 1969). A fase inicial do edema induzido por carragenina é resultante do aumento da concentração de histamina e serotonina liberados por células mastocitárias (KULKARNI et al., 1986). A fase tardia do edema é produzida por citocinas liberadas por células residentes e por migração neutrofílica (DiROSA et al., 1971; VINEGAR et al., 1969,1982). Como o edema de pata induzido por Cg possui um componente celular, decorrente da migração neutrofilica, e um componente vascular, onde o aumento do volume da pata é decorrente da ação de mediadores (histamina e serotonina) sobre os vasos, realizamos o experimento de edema de pata induzido por DXT, que é mediado por um aumento da permeabilidade vascular, acumulo de fluidos e por degranulação de mastócitos, (LO et al., 1982) para identificarmos se a diminuição da resposta edematogênica gerada por carragenina teria sido mediada por um mecanismo
puramente vascular ou puramente dependente da infiltração de neutrófilos. Os nossos resultados demonstraram que animais com colite induzida por TNBS também tiveram diminuição da atividade edematogênica induzida por DXT (três dias após a indução das colites). Assim, possivelmente a colite induzida por TNBS diminuiu esse parâmetro inflamatório agudo independente da infiltração neutrofílica.
Para confirmar essa hipótese por nós sugerida, foram propostos protocolos que avaliassem a influência das colites sobre a migração de células inflamatórias, como por exemplo, o MPO e a pleurisia, que avaliaram a migração de neutrófilos para as patas e para pleura dos grupos em estudo, respectivamente. Na avaliação da atividade de MPO na pata de ratos os nossos resultados mostraram também que não houve diferença na atividade dessa enzima, que é expressa durante a migração de neutrófilos, quando se comparou o grupo controle, que recebeu por via intraplantar Cg e salina por via transanal e os grupos experimentais (animais com colite), que também receberam Cg. Na avaliação da pleurisia os nossos resultados demonstraram que na migração de neutrófilos para pleura induzida por Cg não houve diferença dessa atividade, quando se comparou o grupo controle (salina anal) que recebeu Cg na cavidade pleural com os grupos experimentais (animais com colite) que também receberam Cg na mesma cavidade.
Uma das características principais da resposta inflamatória a patógenos e a injúrias teciduais por estímulos químicos e físicos é o recrutamento de células polimorfas nucleadas para o foco da inflamação. Após serem ativados por substâncias inflamatórias os neutrófilos produzem citocinas e quimiocinas, que atraem outros neutrófilos e outras células do sistema imune. (DALSECCO
et al., 2006). Além disso, em eventos de dor inflamatória, os neutrófilos possuem um papel fundamental na ativação da cascata de eventos que originam a hipernocicepção mecânica (CUNHA et al., 2008).
Assim, esses resultados demonstram preliminarmente que a colite induzida por TNBS produz antinocicepção por diminuir eventos inflamatórios agudos que sensibilizam diretamente neurônios nociceptores produzindo hipernocicepção inflamatória, mas esse potencial antinociceptivo da colite por TNBS não dependente da infiltração de neutrófilos.
Então, como a antinocicepção mediada pela colite por TNBS possivelmente seja alcançada por diminuir a sensibilidade neuronal de uma forma direta, fomos avaliar a participação de vias bioquímicas que produzam antinocicepção por agirem diretamente na terminação nervosa nociceptiva. Assim fomos verificar se a via NO/GMPc/PKG/K+ATP teria também uma participação na antinocicepção periférica observada em animais com colite induzida por TNBS. Vários dados da literatura mostraram que pacientes com colites, apresentavam altos níveis plasmáticos de NO e de seus metabólitos (nitrato e nitrito) (KIMURA et al., 1997). Outro estudo mostrou que possivelmente esse aumento dos níveis plasmáticos de NO seria devido ao aumento da atividade de neurônios produtores de NO na camada submucosa e no plexo mio entérico em pacientes portadores de doença de Crohn (GEBOES et al., 1993). É bem conhecido na literatura que o efeito analgésico e antinociceptivo de certas drogas, como por exemplo, a ação periférica de opioides é mediada pela liberação de NO na terminação nervosa nociceptiva (DUARTE et al., 1990; FERREIRA et al., 1991).
A partir disso, outra proposta nossa foi verificar se essa antinocicepção gerada pela colite induzida por TNBS tinha a participação da via do NO. Os nossos resultados mostraram que quando usamos o L-NOARG, que é um bloqueador específico da enzima NO sintetase neuronal (NOn), a antinocicepção produzida pela colite induzida por TNBS foi bloqueada e quando a L-Arginina foi administrada esse efeito da colite foi restaurado..
A partir dos dados obtidos e discutidos podemos inferir que a colite induzida por TNBS possivelmente gerou uma diminuição da resposta hipernociceptiva por ativar endogenamente a produção de NO. Esse gás endógeno produz uma diminuição da sensibilidade dos neurônios nociceptivos periféricos e como conseqüência final leva a diminuição da hipernocicepção inflamatória (SACHS et al., 2004).
O efeito antinociceptivo do NO depende diretamente da ativação da enzima guanilato ciclase solúvel e aumento dos níveis intracelulares de GMPc (DUARTE et al., 1990; DUARTE et al., 1992; SACHS et al., 2004). Os nossos
resultados mostraram que quando usamos o ODQ, que é um bloqueador específico da enzima guanilato ciclase solúvel, o efeito antinociceptivo da colite induzida por TNBS foi bloqueado. Vários estudos na literatura mostraram que o efeito analgésico de muitas drogas utilizadas no tratamento de dor neuropática, como por exemplo, tramadol e gabapentina e o efeito antinociceptivo de drogas antiinflamatórias, como a dipirona e indometacina, dependem da produção de GMPc que é estimulada pelo NO (BRITO et al., 2006). Possivelmente, a partir dos resultados obtidos podemos inferir que o efeito antinociceptivo da colite induzida por TNBS dependa diretamente da ativação da via NO/GMPc.
(SOARES et al., 2000; DAL et al., 2006; ORTIZ et al., 2006; VENTURA- MARTINEZ et al., 2004; SACHS et al., 2004).
Os protocolos experimentais que vieram na seqüência foram executados com a intenção de verificarmos se na antinocicepção periférica atingida pela colite induzida por TNBS haveria a participação da proteína quinase G e dos canais de potássio sensíveis ao ATP, além da participação do NO e do GMPc, Os nossos resultados mostraram que quando usamos o KT 5823, que é um bloqueador específico da proteína quinase G (PKG), e a glibenclamida, que é uma droga bloqueadora dos canais de potássio sensíveis ao ATP, o aumento do limiar nociceptivo produzido pela colite induzida por TNBS foi bloqueado. Sachs e colaboradores demonstraram em 2004 que a ativação da proteína quinase G garantida pelo aumento da concentração de GMPc é necessária para gerar a abertura dos canais de potássio sensíveis ao ATP na analgesia periférica.
Outros achados na literatura mostraram que o NO pode ativar diferentes tipos de canais de potássio sensíveis a voltagem em diferentes tipos de tecidos por um aumento da concentração de GMPc intracelular (LECTURE et al., 2006; KUBO et al., 1994; MURPHY et al, 1995). Outro estudo mostrou que a antinocicepção periférica alcançada por um doador de NO (nitropussiato de sódio) após a indução de hiperalgesia mediada por PGE2 na pata de ratos foi
dependente da ativação direta desses mesmos canais de potássio. (SOARES et al., 2001). Baseado nos nossos resultados podemos sugerir que possivelmente a colite induzida por TNBS ative a produção endógena de NO e que essa substância gera um mecanismo de antinocicepção periférica através da via NO/GMPc/PKG/K+ATP.
Outra hipótese por nós proposta foi a de que a antinocicepção periférica em animais com colite induzida por TNBS seria modulada pela ativação da via NO/GMPc/PKG/K+ATP e que a ativação dessa via, possivelmente dependeria da participação conjunta das vias opióide e endocanabinóide. Dado da literatura demonstrou que na colite induzida por TNBS observou-se um aumento da expressão do receptor canabinóide tipo I no cólon de animais e um aumento da produção colônica e sistêmica de anandamida (SANSON et al., 2006). Outros achados demonstraram que possivelmente a antinocicepção periférica alcançada pelos endocanabinoides em eventos de dor inflamatória seria mediada pela produção de opioides e ativação da via NO/GMPc/K+ATP (REIS et al., 2009; REIS et al., 2011).
Na tentativa de validar-mos a nossa hipótese, quando usamos a naloxona, que é uma droga antagonista inespecífica dos receptores opioides, e os antagonistas do receptor canabinoide tipo I (AM 251) e tipo II (AM 630), a antinocicepção atingida pela colite induzida por TNBS foi bloqueada.
Um estudo mostrou que em tecidos normais do trato digestivo, receptores canabinoides, como por exemplo, receptor canabinoide tipo I, é importante para a motilidade e secreção gastrintestinais quando ativados por agonistas canabinoides (anandamida e 2-AG) (MASSA et al., 2004; PERTWEE et al., 2001; STORR et al., 2003; DI CARLO et al., 2003). Outros achados da literatura mostraram que em tecidos inflamados, ocorria um aumento da expressão de receptores opióides e canabinoides, como por exemplo, em modelos de doença inflamatória intestinal, principalmente quando se avaliava os gânglios das raízes dorsais e cólons de animais com colite. (STEIN et al., 2003). Outro dado da literatura revelou que a ativação dos receptores
canabinóides ou opióides pode produzir efeitos fisiológicos semelhantes, incluindo antinocicepção, hipotermia, sedação, hipotensão, inibição da motilidade intestinal e depressão motora, sugerindo uma similar distribuição e mecanismo de ação de seus receptores. (MANZANARES et al., 1999; CICHEWICZ, 2004).
Dados recentes da literatura demonstraram a existência de uma via contra-regulatória descendente da nocicepção. A ativação dessa via seria mediada pelo sistema endocanabinoide a nível central e isso levaria a uma antinocicepção em neurônios periféricos (MAIONE et al., 2011).
Mesmo sabendo que estudos posteriores devem ser realizados para a elucidação completa do mecanismo de antinocicepção periférica da colite induzida por TNBS, podemos sugerir que a partir dos nossos achados o possível mecanismo pelo qual a colite induzida por TNBS produza efeito antinociceptivo periférico seja por ativar essa via contra-regulatória decendente em patas de ratos e isso seja mediado pela ação sistêmica da anandamida. Isso provavelmente favorece a produção e liberação de opioides endógenos a partir da ativação de seus receptores situados em neurônios periféricos nociceptores com a ativação da via final NO/GMPc/PKG/K+ATP, já que Cunha e colaboradores em 2010 demostraram que a analgesia periférica da morfina, que é uma agonista opióide, em eventos de hipernocicepção inflamatória seria mediada pela ativação final dessa mesma via.
É bem descrito que a doença de Crohn curse com dor visceral provavelmente decorrente da inflamação intestinal. Por outro lado, alterações na sensibilidade nervosa periférica neste grupo de pacientes ainda foram pouco estudadas. Vem sendo descrito que pacientes portadores de doença de
Crohn apresentam alterações na sensibilidade periférica, sendo observado diferentes fenótipos de polineuropatia (GONDIM et al., 2005). Recentemente, em pacientes do Hospital Universitário Walter Cantídeo, da Universidade Federal do Ceará observamos uma alta prevalência de polineuropatias sensoriais e sensor motoras em pacientes com doença de Crohn (OLIVEIRA et
al., 2008). Nossos dados propõem um possível mecanismo, envolvido na alteração da sensibilização periférica neuronal, no curso de um modelo de colite experimental que se assemelha com a doença de Crohn. Acreditamos que nossa proposta pode contribuir para elucidar as alterações sensoriais em neurônios periféricos associadas à doença de Crohn.
Aumento da expressão de recptores canabinoides I e II Infiltração neutrofílica Isquemia Injúria Lesão tecidual
CONCLUSÕES
A partir dos nossos resultados podemos concluir que a colite induzida por TNBS diminuiu a hipernocicepção inflamatória induzida tanto por carragenina quanto por PGE2 por dimimuir parâmetros inflamatórios agudos
como a resposta edematogênica a estímulos inflamatórios. Além disso, esse efeito antinociceptivo parece ser independente da infiltração de neutrófilos, mas dependente da ativação da via final NO/GMPc/PKG/K+ATP e estimulada pelas ações dos opióides e canabinóides endógenos.
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