Tendo como base a OIV, a ocratoxina A pode ser detectada em vinhos através de uma coluna de imunoafinidade, sendo posteriormente quantificada por HPLC com detector de fluorescência. Segundo a mesma fonte, a primeira etapa do ensaio envolve a concentração e a purificação da ocratoxina A na amostra a analisar, seguida da quantificação referida anteriormente (Compendium-OIV, 2013c).
A cromatografia por imunoafinidade teve origem nos anos 50, tendo sido Campbell e os seus colaboradores dos primeiros a fazer uso desta técnica, em que a afinidade de ligação de um antigénio a um anticorpo constitui a base da separação. Este tipo de cromatografia é
constituído por uma fase estacionária sólida em que os anticorpos se encontram associados a uma matriz cromatográfica. Dependendo da afinidade para com analito, este é retido e concentrado, sendo as impurezas removidas por lavagem. Os antigénios de interesse são depois eluídos por forma a originar um produto puro. A fase móvel da cromatografia é um tampão aquoso de diferentes composições e serve de transportador para o analito (Abi- Ghanem e Berghman, 2012; Bhargav et al., 2012).
Outros técnicas analíticas utilizadas na detecção e/ou quantificação de ocratoxina A são as técnicas ELISA, a electroforese capilar e a LC-MS/MS (Romer Labs, 2012; Ismail et al., 2010).
Figura 6.2 - Cromatografia por imunoafinidade (Fonte: www.as.nchu.edu.tw/english)
6.4 Parâmetros Analíticos da Empresa José Maria da Fonseca
As tabelas seguintes representam os dados da JMF correspondentes aos teores de ocratoxina A dos vinhos produzidos na empresa e/ou comprados a fornecedores, sendo que os dados foram obtidos em laboratórios acreditados.
A tabela 6.1 corresponde aos resultados obtidos por análises feitas em 2008 no Canadá, como referido anteriormente, um dos principais destinos de exportação da empresa. As análises correspondem a vinhos tintos, que a par dos moscatéis podem ser mais problemáticos em relação à OTA devido à maceração no processo produtivo, ou seja, ao contacto entre mosto e os restantes componentes da uva.
Após análise da tabela é possível afirmar que os valores obtidos se encontram bastante abaixo do valor máximo admissível previsto na legislação, como também já foi indicado.
Tabela 6.1 - Resultados de análises a ocratoxina A efectuadas no Canadá (Fonte: JMF 2008, comunicação pessoal de Laboratório de Química).
Tipo de Vinho
Origem
OTA (µg L
-1)
VMA (µg L
-1)
Montado Tinto
JMF
˂ 0,5
2
Na tabela 6.2 encontram-se resultados mais recentes, obtidos por um laboratório externo em Portugal, por HPLC e purificação com coluna de imunoafinidade. Os vinhos analisados são o Periquita Branco da colheita de 2012 produzido pela JMF, um vinho rosé da colheita de 2012 de origem externa à empresa e um vinho branco com as mesmas características, elaborado a partir de uvas da colheita de 2012 mas de terceiros. Para além dos vinhos referidos, também o moscatel de setúbal da colheita de 2011 foi analisado, sendo que este vinho licoroso é também produzido na JMF. Tal como nos vinhos tintos, a maceração no processo de elaboração de moscatel pode contribuir para a presença de OTA neste tipo de vinho licoroso. Contudo, para qualquer vinho analisado, o resultado indica valores muito baixos, bastante inferiores ao valor máximo admissível.
Tabela 6.2 - Resultados de análises a ocratoxina A (Fonte: JMF 2012, comunicação pessoal de Laboratório de Química).
Tipo de Vinho
Origem
OTA (µg L
-1)
VMA (µg L
-1)
Periquita Branco
JMF
˂ 0,2
2
Vinho Rosé
Externa
˂ 0,2
2
Vinho Branco
Externa
˂ 0,2
2
Moscatel de
Setúbal
JMF
˂ 0,2
2
Para qualquer umas das tabelas referidas, os resultados demonstram que os vinhos produzidos pela JMF, assim como os vinhos comprados a fornecedores que vão incorporar os produtos finais da empresa não possuem ocratoxina A, ou possuem quantidades vestigiais, muito próximas de zero, estando bastante distanciadas do valor máximo admissível. Estas análises são importantes para comprovar a sanidade dos produtos finais uma vez que nem toda a matéria-prima utilizada nos vinhos da empresa é de origem interna à mesma.
Tal como acontece para os metais pesados, também as análises para detectar e quantificar a presença de ocratoxina A são efectuadas após o loteamento dos vinhos, ficando estes à espera de aprovação para serem engarrafados e posteriormente colocados nos diferentes mercados. Mais uma vez, se as análises efectuadas determinarem a presença desta micotoxina em quantidades superiores às permitidas por lei, os lotes em análise são rejeitados. É possível afirmar que, relativamente à contaminação dos seus vinhos por ocratoxina A, a JMF tem o processo sob controlo.
Na figura 6.3 encontra-se esquematizado sucintamente o processo produtivo da JMF. Neste esquema é identificado o ponto no processo em que os lotes de vinhos vão ser analisados (ponto de controlo) para despistar as possíveis contaminações por OTA, permitindo rejeitar os vinhos loteados ou dar o aval para o engarrafamento dos mesmos. Tal como foi verificado para o controlo de contaminação por metais pesados, também a monitorização de
OTA é adequada, sendo a eficácia do controlo demonstrada pelos resultados das análises a esta toxina de origem alimentar.
Figura 6.3 - Fluxograma geral da empresa com destaque para o controlo de ocratoxina A após loteamento dos vinhos (Adaptado de JMF 2012, comunicação pessoal da Qualidade). CEN- Centro de Vinificação; PAL-Produção e Armazenamento de Lotes; RAC-Refrigeração e Acabamento de
Vinhos; ENG-Linhas de Engarrafamento; APA-Armazém de Produto Acabado).
Kruger e os seus colaboradores (2012) avaliaram a ocorrência de OTA em vinhos de colheitas entre 2002 e 2008. Do total de amostras analisadas, quarente e três eram brasileiras, país onde foi realizado o estudo, trinta e dois vinhos eram argentinos e cinco chilenos.
Por HPLC e purificação com coluna de imunoafinidade os investigadores obtiveram a indicação de que apenas o resultado de vinte e cinco amostras se situava acima do limite de quantificação para a técnica, sendo considerados resultados positivos. Estes vinhos eram todos brasileiros e os valores determinados estavam situados entre 0,020 µg L-1 e 0,050 µg L-1, valores bastante inferiores aos 2 µg L-1 legislados. Neste trabalho, Kruger e os seus colaboradores indicam ainda que noutros estudos foram determinados valores de OTA entre 0,10 e 1,33 µg L-1 em vinhos brasileiros e entre 0,03 e 0,3 µg L-1 em vinhos importados pelo Brasil. Mais uma vez, estes valores respeitam a legislação.
Por seu lado, Battilani e Pietri (2002) indicam que vários estudos em vinhos europeus permitiram identificar os valores entre 0,01 e 3,4 µg L-1 como o intervalo de valores para o teor
Clientes
Uvas
Mosto/Vinho
Fornec.
APA RAC CEN PAL (Loteamento) ENGAnálises Externas
Ocratoxina A
de OTA presentes nos vinhos dessa região. Mais ainda, os investigadores afirmam que a incidência e concentração desta micotoxina nos vinhos são superiores nos países do sul, sendo superior em vinhos tintos, depois em vinhos rosés e finalmente em vinhos brancos.
Belajová e Rauová (2007) investigaram a ocorrência de ocratoxina A em vinhos produzidos no ano 2005. No estudo desenvolvido foram analisados vinhos tintos e brancos eslovacos disponíveis comercialmente, vinhos tintos e brancos eslovacos de origem caseira e vinhos tintos e brancos estrangeiros. Nalguns vinhos não foram detectados vestígios de OTA. Na sua grande maioria os vinhos tintos apresentaram quantidades de OTA entre 0,011 e 0,033 µg L-1, sendo que apenas três vinhos apresentaram valores desta micotoxina superiores a 0,033 µg L-1, dois vinhos tintos eslovacos com 0,036 µg L-1 e 0,463 µg L-1 e um vinho macedónio tinto doce com 0,122 µg L-1. Perante estes dados pode-se concluir mais uma vez que os vinhos tintos possuem maiores teores de OTA que os vinhos brancos, assim como que esses valores estão dentro do especificado pela legislação europeia.
Otteneder e Majerus (2000) analisaram quatrocentas e vinte amostras de vinhos de vários pontos do mundo. Deste número de amostras, sessenta eram vinhos brancos, cinquenta e cinco vinhos rosados e trezentos e cinco tintos. Após avaliação dos teores de OTA presentes nessas amostras concluíram que esta micotoxina estava presente em 25% dos vinhos brancos, com uma média de 0,108 µg L-1. Relativamente aos vinhos rosés, esta toxina de origem alimentar estava presente em 40% dos vinhos, com uma média de 0,119 µg L-1. Para os vinhos tintos, a OTA foi detectada em mais de metade (54%) situando-se a média dos teores da mesma nos 0,201 µg L-1. Este último valor corresponde no entanto a cerca de um décimo do valor máximo admissível.
Rotaru e os seus colaboradores (2011) analisaram noventa e nove vinhos por HPLC, sendo essa amostragem composta por cinquenta e cinco vinhos brancos e quarenta e quatro vinhos tintos. Do total de vinhos brancos analisados, foi detectada a ocratoxina A em 32,7% desses vinhos, em valores que se situavam entre 0,06 e 0,99 µg L-1. Nos vinhos tintos, como era esperado a percentagem de vinhos com esta micotoxina foi superior (38,6%), apesar do menor número de amostras. Para estes, os teores de OTA estavam situados entre 0,19 e 1,89 µg L-1, valores superiores aos detectados nos vinhos brancos, como era também expectável.
Os estudos mencionados continham na sua maioria resultados dos teores de OTA dentro dos valores especificados na legislação. Já Quintela e os seus colaboradores (2012) indicam que o valor mais elevado de OTA que verificaram na literatura foi em Itália, com 15,6 µg L-1, não especificando no entanto o tipo de vinho relativamente aos teores de açúcares ou outros factores.
Por seu turno, Soufleros e os seus colaboradores (2003) também identificaram quantidades elevadas de OTA em vinhos gregos. Foram analisados vinhos brancos, rosés e tintos tendo sido verificada a presença desta micotoxina em 62,8% das amostras. Se na maior parte dos vinhos o teor de OTA era inferior a 0,05 µg L-1, em vinhos com teores de açúcares mais elevados os valores de ocratoxina A variaram entre 0,02 e 3,2 µg L-1.