Os procedimentos de análises microbiológicas em biodiesel seguiram de acordo com a norma ASTM para Líquidos Combustíveis, especificamente a norma ASTM D6974-4 (Standard Pratice for Enumeration of Viables Bacteria and Fungi Liquid Fuels - Filtration
and culture Procedures). Os testes microbiológicos foram realizados no Laboratório de
Segurança Ambiental (LABSAM) do Departamento de Engenharia Mecânica da UnB.
O experimento consistiu em avaliar a possível presença de micro-organismos no óleo diesel e biodiesel disponíveis para aos testes. Para isso, foram preparadas misturas padrões com o biodiesel produzido na Microusina de Biodiesel: B0 (Óleo diesel puro), B5, B20, B50 e B100, todas sem a presença de aditivos, para verificação das características microbiológicas do biodiesel e suas misturas.
164
Figura A.16 - Bancada para Testes Microbiológicos localizado no LABSAM/UnB.
Antes da preparação das placas e soluções procedeu-se a esterilização do ambiente em que a capela também foi irradiada por luz ultravioleta durante 20 minutos. A vidraria foi mantida em estufa (forno de Pasteur) durante 2 horas a 160°C. Quando levadas de um ponto a outro se tampou com papel alumínio. A água e soluções foram esterilizadas em autoclave segundo a norma seguida, e ao manual de preparação do meio de cultura (TSA) disponível em seu rótulo.
Durante a etapa de filtração das amostras com o filtro de porosidade 0,47 µm, observou-se que quanto maior a quantidade de biodiesel na amostra maior o tempo de filtração, principalmente na lavagem do filtro com a água deionizada e a solução Ringer (descrita na norma ASTM). Isto aconteceu possivelmente pelo entupimento dos poros com a borra formada na autoxidação do biodiesel, em que quanto maior a concentração de biodiesel, mais partículas presentes.
Após cada filtração o respectivo filtro foi depositado na placa, com a face contendo o filtrado em contato com o meio de cultura Ágar Triptona de Soja (TSA), o qual foi doado pelas Indústrias Miracema. As placas foram levadas à estufa bacteriológica para incubação, numa temperatura controlada de 25 ± 2°C, como descrito na norma.
Para visualização das placas e contagem das colônias utilizou-se o equipamento contador de colônias CT 600 Plus, marca Phoenix. Para a visualização de amostras de colônias foi
165
utilizado um microscópio ótico. Com o uso destes equipamentos e de aparelhos fotográficos, obtiveram-se os resultados dispostos abaixo.
• Placas com meio de cultura TSA após 3 dias de incubação:
Figura A.17 - Placas Microbiológicas de amostras B0 e B20, após três dias de incubação em TSA.
Figura A.18 - Placas Microbiológicas de amostras B50 e B100, após três dias de incubação em TSA.
Observam-se nas figuras A.17 e A.18 que todas as placas tiveram a presença de microrganismos. As possibilidades de contaminação durante os procedimentos foram mínimos, devido às técnicas de esterilização aplicadas. Conclui-se que, provavelmente, o óleo diesel já continha focos de contaminação. Duas foram as possibilidades:
1°) O reservatório-tubulação continham estes microrganismos; 2º) Houve contaminação no momento da coleta do óleo diesel.
166
No entanto, a amostra B100, isto é, que continha somente biodiesel, também demonstrou contaminação microbiana e aparentemente são os mesmos microrganismos encontrados no diesel (B0). Isto nos leva a supor que a contaminação ocorrida possivelmente foi do mesmo meio transmissor. Visualmente observou-se a presença de três tipos de microrganismos, de características muito similares aos micro-organismos comumente encontrados em combustíveis contaminados (Klofutar e Golob, 2007):
1. Colônias brancas: possivelmente uma bactéria gram-negativas chamada
Pseudomonas aeruginosa encontrada frequentemente no solo;
2. Colônias amarelas: possivelmente uma espécie de fungo chamado Candida
tropicalis. São leveduras ovais com cerca de 5 micrômetros cada; .
3. Colônia Negra com cílios brancos: possivelmente é um gênero de fungo chamado de Cladosporium, frequentemente encontrado em plantas e são levados pelo ar.
As características dos microrganismos e sua contagem foram detalhadas na tabela A.2 a seguir:
167
Tabela A.2 – Características dos microrganismos em amostras de diesel e misturas diesel- biodiesel de óleo de fritura após 3 dias de incubação.
*Contagem não realizada pela distribuição ter-se apresentado muito densa e irregular.
De acordo com a contagem e figuras A.17 e A.18 apresentadas, observou-se que quanto maior a quantidade de biodiesel presente na amostra, maior foi a quantidade de colônias presentes, de ambos os tipos de microrganismos observados. Em geral, a ordem de quantidade de colônias foi : B0 < B20 < B50 < B100.
Considerando o trabalho de Klofutar e Golob (2007) supõe-se que a contaminação apresentada está intimamente relacionada a micro-organismos presentes em reservatórios B0
Cor Tamanho
(mm) Quantidade Forma Elevação Bordos Estrutura Amarela
Brilhante (úmida)
1 (pequena)
40 Circular convexa Liso Lisa
Branca; membranosa; opaca; leitosa.
3 (média) 17 Irregular Convexa Ondulados;
lobados. Rugosa B20 Amarela Brilhante (úmida) 1 (pequena)
65 Circular convexa Liso Lisa
Branca; membranosa; opaca; leitosa.
* Irregular Convexa Ondulados;
lobados. Rugosa Com centro escuro e pelugem branca na superfície 5,915 mm 1 Circular convexa B50 Amarela Brilhante (úmida) 1
(pequena) 74 Circular convexa Liso Lisa
Branca; membranosa; opaca; leitosa.
* * Irregular Convexa Ondulados; lobados. Rugosa B100 Amarela Brilhante (úmida) 1
(pequena) 192 Circular convexa Liso Lisa Branca;
membranosa; opaca; leitosa.
* * Irregular Convexa Ondulados;
168
de petróleo, neste caso levado pelo óleo diesel, e à contaminação por solo e/ou pelo ar, possivelmente encontrados nos reservatórios de armazenamento e/ou transporte. Tais resultados demonstram a necessidade de incrementar-se um aditivo biocida a fim de eliminar ou diminuir estes possíveis contaminantes, os quais, dentre várias desvantagens, geram resíduos que entopem filtros e bicos injetores além de produzirem água e substâncias ácidas que prejudicam a qualidade do combustível e contribuem na corrosão de reservatórios e peças do motor. Os aditivos biocida avaliados, em testes sinergéticos, foram descritos no item 4.2.3 desta pesquisa.