a) Imunomarcação de apomucinas gástricas
Os padrões de diferenciação gástrica foram avaliados por método imunohistoquímico com anticorpos que reconhecem antigénios habitualmente expressos por células epiteliais “maduras” da mucosa gástrica (MUC5AC e MUC6), identificadores de um padrão de diferenciação terminal.
Para o reconhecimento de MUC5AC foi utilizado o anticorpo monoclonal de ratinho, clone CLH2, cedido pela Profª. Leonor David, IPATIMUP, Portugal. Para o reconhecimento de MUC6 foi utilizado o anticorpo comercial clone CLH5 (Novocastra Laboratories ®).
Para os anticorpos das mucinas MUC5AC e MUC6 utilizaram-se, como controlos positivos, fragmentos de mucosa gástrica normal. Considerou-se como padrão normal e específico a marcação citoplasmática difusa das células mucosas da superfície foveolar e dos colos das glândulas gástricas com anti - MUC5AC (Figura 2) e a marcação das células mucopépticas com anti - MUC6 (Figura 3).
5.
Figura 3 – Padrão de imunomarcação com o anticorpo anti-MUC6 na mucosa gástrica normal: marcação citoplasmática das células mucopéticas
Figura 2 – Padrão de marcação com o anticorpo anti-MUC5AC na mucosa gástrica normal: marcação citoplasmática nas células dos colos das glândulas e do epitélio foveolar.
A técnica de imunohistoquímica foi realizada em máquina automática (Labvision®). O protocolo utilizado foi o seguinte:
Desparafinação dos cortes histológicos em xilol e hidratação em solutos de etanol com concentrações decrescentes (100º, 95º e 70º).
Lavagem com PBS.
Bloqueio da peroxidase endógena com solução comercial de peróxido de hidrogénio (H2O2) pré-diluído durante 10 minutos.
Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Recuperação antigénica pelo calor em panela de pressão com tampão citrato a 0,01M - pH6 durante 2 minutos (pressão máxima).
Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Incubação dos anticorpos primários durante 45 minutos à temperatura ambiente, com as seguintes diluições:
MUC5AC – 1:20 MUC6 – 1:50
Incubação com polímero conjugado com enzima peroxidase, pré-diluído durante 30 minutos à temperatura ambiente.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Revelação com o cromogénio 3.3’ – diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) com “Kit” comercial de acordo com protocolo específico (Liquid DAB+ Substract Chromogen System, DAKO®), 10 minutos.
Contraste das lâminas com hematoxilina de Harris durante 1minuto. Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Diferenciação com álcool clorídrico 1% durante 1 minuto. Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Desidratação em solutos de etanol com concentrações crescentes (70º, 95º, 100º).
Diafanização em xilol.
Montagem com meio sintético.
b) Técnica de imunomarcação dos factores de transcrição SOX2 e Pdx1
Para a identificação da expressão da proteína dos factores de transcrição SOX2 e Pdx1 foram utilizados anticorpos monoclonais comerciais anti-h/m SOX2 (clone 245610, RD Systems®) e anti-h/m Pdx1 (clone 267712, RD
Systems®). Para estes anticorpos foi necessário proceder à optimização para
amostras fixadas em formol e incluídas em parafina. Foi também necessário seleccionar amostras de tecidos humanos adequados como controlos positivos. Assim, utilizaram-se secções de embriões humanos com uma idade gestacional de 8 / 9 semanas, em que se obteve marcação nuclear intensa do tubo neural, das células de revestimento interior de brônquios e do epitélio de revestimento do estômago embrionário com anti - SOX2 (Figura 4) bem como do epitélio de revestimento interior do estômago, duodeno e ductos pancreáticos com anti - Pdx1 (Figura 5). Utilizaram-se também cortes histológicos de mucosa gástrica normal, em que se verificou existir marcação focal de núcleos de células epiteliais mucopépticas e em células neurais do corion e submucosa com anti - SOX2 e também marcação nuclear de células mucopépticas e foveolares com anti - Pdx1 (Figura 6 e Figura 7).
9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.
Figura 4 – Padrão de imunomarcação com anti - SOX2 em embriões humanos com uma idade gestacional de 8 / 9 semanas: marcação nuclear intensa das células de revestimento interior de brônquios e do revestimento interior do estômago.
Figura 5 – Padrão de imunomarcação com anti – Pdx1 em embriões humanos com uma idade gestacional de 8 / 9 semanas: marcação nuclear intensa do epitélio de revestimento interior do estômago, duodeno e ductos pancreáticos.
Seleccionaram-se para este passo do estudo apenas os 89 casos em que se havia observado expressão das apomucinas gástricas (MUC5AC, MUC6 ou ambas), uma vez que se pretendia avaliar qual a sua relação com a expressão dos factores de transcrição SOX2 e Pdx1.
Figura 6 – Cortes histológicos de mucosa gástrica normal: marcação nuclear focal de células mucopepticas e foveolares com anti - Pdx1 e marcação focal de núcleos de células epiteliais mucopepticas com anti - SOX2.
A técnica de imunohistoquímica (incubação dos anticorpos) foi manual, com o seguinte protocolo:
Desparafinação dos cortes histológicos e hidratação em soluções de etanol com concentrações decrescentes (100º, 95º e 70º).
Lavagem com PBS.
Recuperação antigénica em panela de pressão com tampão citrato a 0,01M durante 6 minutos, à pressão máxima.
Bloqueio da avidina e biotina endógenas com “Kit” comercial, de acordo com protocolo específico (Avidin/biotin Blockimg Kit, referência 00- 4303, Zymed®), 10minutos + 10minutos.
Incubação dos anticorpos primários durante 18 horas, a 4º C, com as seguintes diluições: 1. 2. 3. 4. 5.
SOX2 – 1:600 Pdx1 – 1:800
Incubação do anticorpo secundário biotinilado durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Lavagem com PBS
Incubação com estreptavidina conjugada com peroxidase durante 15 minutos.
Revelação com o cromogénio 3.3’ – diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) com “Kit” comercial de acordo com protocolo específico (Liquid DAB+ Substract Chromogen System, DAKO®), durante 10 minutos.
Contraste das lâminas com hematoxilina de Harris durante 1minuto. Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Diferenciação com álcool clorídrico 1% durante 1minuto. Lavagem em água corrente durante 5 minutos.
Desidratação em solutos de etanol com concentração crescente (70º, 95º, 100º).
Diafanização em xilol.
Montagem com meio sintético.
Figura 7 – Corte histológico de mucosa gástrica normal: marcação nuclear de células mucopepticas e foveolares com anti - Pdx1 e marcação citoplasmática de células epiteliais foveolares com anti - MUC5AC.
6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
Consideraram-se positivos os casos em que foi possível identificar imunomarcação em 5% ou mais do total das células avaliadas. Definiram- se quatro “graus” de imunomarcação: negativo (menos de 5% das células marcadas), 1 + (entre 5% e 25% das células marcadas), 2 + (entre 25% e 50% das células marcadas) 3 + (mais de 50% das células marcadas). Nos casos em que foi possível identificar áreas de displasia ou neoplasia invasiva avaliou-se a imunomarcação em mucosa quer neoplásica quer não neoplásica.
Como controlos negativos utilizaram-se, para os dois tipos de reacção (apomucinas e factores de transcrição), fragmentos de mucosa do cólon endoscopicamente e histologicamente normais, provenientes de indivíduos sem história clínica de diarreia.