As diferenças genéticas que determinam a diferenciação entre indivíduos residem nas moléculas do DNA e a determinação do perfil genético, com base no DNA dos organismos, é o método mais recente de individualização biológica. A singularidade genética é adquirida por herança ou por mutação. Nos organismos diplóides, uma cópia do genoma é herdado do progenitor feminino e a outra do progenitor masculino. O processo de recombinação que ocorre na meiose assegura a originalidade do genoma
dos descendentes, de tal forma que o dos progenitores nunca é globalmente reconstituído. Existem dois tipos de recombinação homóloga, o crossing over (recombinação recíproca) e a conversão genética (recombinação não-recíproca). A recombinação recíproca envolve a troca equitativa de sequências homólogas entre cromossomas homólogos, produzindo combinações novas nos segmentos dos cromossomas. Neste processo, normalmente, a organização espacial dos genes mantém-se inalterada. Na recombinação não-recíproca ocorre a troca desigual de sequências ou seja, uma sequência é substituída por outra, com perda de uma das sequências envolvida no mecanismo de recombinação. Quando se pretende determinar a relação de semelhança ou de diferença que existe entre indivíduos de uma mesma espécie, analisam-se regiões do genoma que diferem com frequência de indivíduo para indivíduo ou seja, locais polimórficos (Krawczak e Schmidtke, 1998). Uma população é monomórfica num determinado locus se esse locus possuir apenas um alelo. Um locus diz-se polimórfico se dois ou mais alelos coexistirem numa população. Mas, num locus polimórfico, quando um dos alelos tem uma frequência superior ou igual a 99 %, há pouca probabilidade de observar os outros alelos, a não ser que a amostra seja muito grande. Por isso, em termos práticos, considera-se que um locus é polimórfico quando a frequência do alelo mais comum é inferior a 99 %. Uma das formas mais simples de medir o nível de polimorfismo numa população é calcular a percentagem de loci polimórficos (P) dividindo o número de loci polimórficos pelo número total de loci analisados. Esta medição depende do número de indivíduos em estudo, porque quanto mais pequena for a amostra, mais difícil se torna identificar loci polimórficos (Graur e Li, 1999). A diversidade genética ao nível do DNA pode resultar, por mutação, da substituição de uma ou mais bases, da perda de segmentos de DNA de tamanho variável por eliminação, da aquisição de segmentos de DNA por inserção ou duplicação e de mecanismos moleculares de rearranjo (inversão). A eliminação e a inserção podem ocorrer por crossing over desigual entre dois cromossomas, de tal forma que a perda dum segmento num cromossoma, resulta na adição desse segmento ao outro cromossoma. A probabilidade de ocorrerência de crossing over desigual aumenta quando existem no DNA segmentos duplicados colocados uns a seguir aos outros (tandem). Um outro mecanismo de eliminação consiste num crossing over intra-cromossómico, que resulta da recombinação de duas sequências que são repetição uma da outra e que estão localizadas no mesmo cromatídeo e na mesma orientação. Os mecanismos de inversão podem resultar de crossing over intra-cromossómico entre dois segmentos
homólogos orientados em sentidos opostos (Graur e Li, 1999; Krawczak e Schmidtke, 1998). Para além dos mecanismos mutacionais, existem outros mecanismos que contribuem para a variabilidade das espécies tais como o fluxo de genes, a selecção natural de genótipos mais aptos em determinadas condições ou o denominado “desvio genético” (genetic drift). O fluxo de genes pode resultar, por exemplo, de fenómenos de hibridação ou do cruzamento entre populações isoladas fisicamente. A selecção natural de genótipos é um mecanismo pouco compreendido verificando-se que, apesar de todos os indivíduos numa população terem a mesma probabilidade de contribuir com os seus genes para as gerações futuras, a ligação genótipo-fenótipo determina que apenas alguns génotipos tenham continuidade na descendência. O “desvio genético” é o processo pelo qual há flutuação aleatória da frequência alélica ao longo das gerações, observando-se que a sobrevivência de alelos raros depende da sua frequência inicial (Krawczak e Schmidtke, 1998).
Uma das consequências desastrosas da expansão das populações humanas é a extinção de outras espécies de seres vivos. Num levantamento feito recentemente, foram registadas cerca de 9000 espécies de árvores em vias de extinção incluindo mais de metade das 600 espécies de coníferas existentes no mundo (Newton et al., 1999). Após reconhecimento da destruição causada surgiu a vontade de conservar, constatando-se que a escolha das estratégias a adoptar é dificultada pela ausência de critérios objectivos e pela escassez de informações. Nos programas de conservação, a abordagem científica passa pelo estudo da variabilidade genética das espécies de árvores. O grau e a distribuição da variação genética nas populações que fazem parte de uma espécie, são de uma importância fundamental para o seu potencial evolutivo e determinam a sua probabilidade de sobrevivência. Segundo Newton et al., (1999) a variação intra- específica define-se como o grau de variação genética existente nas populações que compõem uma espécie e, quando é avaliada com recurso a marcadores moleculares, deveria denominar-se “variação genética por marcadores moleculares”, para se diferenciar da determinação quantitativa da variação genética obtida a partir de dados fenotípicos que, segundo estes autores, fornece mais informações acerca da capacidade adaptativa das populações.
Q. suber tem sido, recentemente, uma das espécies referidas para integração em programas de conservação, não porque esteja em vias de extinção mas porque sofre de um acentuado declínio e porque a sua manutenção em determinadas regiões é crucial para a fixação de populações e para evitar a erosão dos solos e a desertificação. O
elevado valor económico da cortiça também torna o sobreiro num candidato prioritário a estes programas. Ter um conhecimento aprofundado da variação genética desta espécie torna-se crucial para a definição de estratégias a adoptar nos programas de selecção e de manutenção da sua diversidade genética.
A diversidade genética em Quercus tem sido estudada com recurso a características morfológicas, químicas, bioquímicas e moleculares. A análise morfológica das bolotas produzidas por populações de Q. ilex, com proveniência em Espanha e em Itália, revelou que as formas dos frutos eram comuns, mas que em Espanha existe uma heterogeneidade morfológica superior entre indivíduos da mesma espécie e entre bolotas da mesma árvore. As mesmas bolotas foram analisadas quanto ao seu conteúdo em estigmasterol, brassicasterol e colesterol, verificando-se que o teor destas substâncias nas amostras de Espanha é inferior ao das amostras de Itália. O oposto acontece relativamente ao teor em avenasterol. A análise em componentes principais realizada com a globalidade dos resultados não mostra separação entre os frutos provenientes dos dois países (Pelleau, 1984; citado por Lebreton et al., 2001). A variabilidade genética do complexo Q. ilex foi analisada com recurso à morfologia, a isoenzimas e ao DNA dos cloroplastos, tendo sido observado que a relação entre a diversidade genética e a localização geográfica varia consoante o tipo de marcador considerado (Michaud, 1993). No estudo isoenzimático, por exemplo, foram encontrados vários alelos característicos de determinadas populações e a separação destas populações relativamente a outras está de acordo com a barreira que representa o mar Mediterrâneo (Michaud, 1993). Lebreton et al. (2001) estudaram a variabilidade de vários parâmetros foliares do complexo Q. ilex em populações provenientes de 11 regiões do Mediterrâneo ocidental, ao nível intra-individual (para evidenciar diferenças existentes entre as folhas de uma mesma árvore), ao nível intra-populacional (entre árvores de uma determinada população) e ao nível intra-específico (entre populações do complexo Q. ilex). Estes autores verificaram que os coeficientes médios de variação intra-individual e intra-populacional são semelhantes no que diz respeito aos parâmetros morfológicos do comprimento (L; 16 %), da largura (l; 18 %), do alongamento (L/l; 13 %) e do índice de espinescência (28 %). O número de nervuras é um parâmetro menos variável entre indivíduos duma mesma população do que é em cada indivíduo dessa população, de tal forma que a análise da variabilidade individual tem de se efectuar num número elevado de folhas. O peso das folhas também se revelou um parâmetro inter-individual bastante variável (coeficiente de variação de 28 %). Ao nível intra-populacional os
parâmetros bioquímicos apresentam uma variabilidade semelhante à dos parâmetros morfológicos, cerca de 20 % para três flavonóides. Quer para os parâmetros morfológicos quer para os bioquímicos, a variabilidade ao nível inter-populacional é inferior ao valor da variabilidade intra-populacional ou seja, estatisticamente, a diferença média existente entre duas populações é menor do que a existente entre dois indivíduos de uma mesma população, considerados ao acaso. Estes autores concluíram que a variabilidade do grupo taxonómico (complexo Q. ilex) está representada a vários níveis e, por esse motivo, são compreensíveis as dificuldades encontradas quanto à escolha de parâmetros eficazes que permitam identificar, na natureza, as diferenças com objectividade (Lebreton et al., 2001).
Tal como Lebreton et al. descreveram para o complexo Q. ilex, também Natividade refere, em 1950, relativamente a Q. suber, que “…Quercus suber é uma espécie extremamente polimorfa e o número de formas botânicas referido na bibliografia suberícola eleva-se a algumas dezenas”. Este autor faz referência às variedades genuína P. Cout., occidentalis (Gay) e subcrinita P. Cout., que incluem várias formas, alertando para o facto dos exemplos referidos não traduzirem o intenso polimorfismo do sobreiro, mas reunirem apenas os biótipos mais característicos e distinguíveis de acordo com a forma das cúpulas, folhas e frutos. Entre os caracteres que apresentam a variação mais acentuada é feita referência à arborescência e ao vigor, à forma, recorte e dimensões das folhas, à época de floração, à cor do perianto das flores masculinas, porosidade e cor do tecido suberoso, entre outras. Natividade descreve, também, a existência de diferenças morfológicas acentuadas entre indivíduos descendentes de uma mesma árvore, assim como a ocorrência de várias gradações entre caracteres do mesmo órgão. E, para expressar a grande diversidade encontrada no sobreiro, Natividade, escreveu que “….em rigor, cada indivíduo se pode considerar uma forma botânica distinta.”.
A variabilidade genética em Q. suber tem sido muito estudada com recurso a isoenzimas. Toumi e Lumaret, em 1998, investigaram a variabilidade genética de 11 loci, em 40 populações de Q. suber da bacia mediterrânica ocidental e encontraram uma percentagem de polimorfismo (P) de 76 %. O valor médio da heterozigocidade observada (Ho=0,283), a diversidade genética total (Ht=0,31) e o número médio de alelos, por locus e por população (At=2,0), observados por estes autores, são semelhantes aos que foram obtidos por Elena-Rossello e Cabrera (1996), quando estudaram 13 loci de 7 sistemas enzimáticos em 7 populações de sobreiros da região
mediterrânica. Os valores de heterozigocidade (Ho=0,28) e do coeficiente de diferenciação inter-populações (Fst=11 %) obtidos por Toumi e Lumaret são superiores aos valores referidos por Jiménez et al. (1999) (Ho=0,145; Fst=3,3 %) num estudo realizado em 18 populações de Q. suber, localizadas em Portugal, Espanha, Marrocos e Itália, com 12 sistemas enzimáticos. Segundo Jiménez et al. (1999) os resultados deste estudo não são comparáveis com os resultados de Elena-Rossello e Cabrera (1996) e Toumi e Lumaret (1998), porque o número de loci analisados em comum é muito pequeno e porque dos sistemas enzimáticos analisados por Elena-Rossello e Cabrera e por Toumi e Lumaret faziam parte peroxidases e estearases, sistemas enzimáticos que apresentam uma variabilidade elevada e dependente do estado de desenvolvimento da planta e dos tecidos analisados. Na análise efectuada por Jiménez et al. (1999), a diferenciação inter-populações corresponde a apenas 3 % da diversidade total.
Kremer e Petit (1993) apresentaram uma síntese bibliográfica dos estudos realizados com isoenzimas em 33 espécies do género Quercus. A extensão e organização da diversidade genética foram investigadas a três níveis hierárquicos: complexo, espécie e população. A diversidade total ao nível da espécie e da população varia muito entre as espécies (de 0,06 a 0,4). Espécies distribuídas por grandes áreas, em contínuo, tais como Q. petraea e Q. rubra, exibem níveis elevados de diversidade genética. Num complexo, a maior parte da diversidade genética nuclear está distribuída no interior das populações (74 %). A diferenciação entre espécies é responsável por 23 % da diversidade genética e a diversidade entre populações contribui com apenas 3 %.
Em 2001, Toumi e Lumaret alargaram a análise isoenzimática realizada em Q. suber a mais três espécies de folha perene da região mediterrânica, Q. ilex, Q. coccifera e Q. alnifolia com o objectivo de estabelecer relações taxonómicas entre estas espécies. O valor mais elevado para a diversidade total (Ht=0,40) e para a diversidade genética no interior das populações (Hs=0,33) foi observado em Q. coccifera, enquanto os valores mais baixos (Ht=0,13; Hs=0,12) foram observados em Q. alnifolia. Os valores observados em Q. ilex e Q. suber são intermédios, aproximando-se dos valores observados em Q. coccifera. A proporção atribuída à diferenciação entre populações não excedeu os 19 %. Relativamente às distâncias genéticas intra-específicas, o valor mais elevado foi observado em Q. coccifera e o mais baixo em Q. suber, indicando que nesta espécie a semelhança genética entre as populações é grande. Estes autores sugerem que os parâmetros At e Ht podem estar relacionados positivamente com a área de distribuição da espécie (isto é, o seu valor ser directamente proporcional áquela
área). Verificaram que Q. coccifera é a espécie que possui os parâmetros At e Ht mais elevados e que é a espécie com a área de distribuição mais vasta (partes ocidental e oriental da bacia mediterrânica). Em oposição, os valores mais baixos dos referidos parâmetros foram obtidos em Q. alnifolia, cuja área de distribuição está restrita aos solos muito básicos do centro de Chipre. Contudo, a hipótese não se adequa ao perfil genético e à área geográfica ocupada por Q. suber. Nesta espécie, os valores de At e Ht são intermédios em relação aos das outras duas espécies, devido à baixa frequência com que aparecem loci com alelos raros e à pequena diferenciação observada entre as populações de Q. suber que ocupam a área de distribuição observada. Portanto, At e Ht não são proporcionais com a extensa área geográfica povoada por esta espécie. Como explicação, estes autores sugerem que a causa se deve à intervenção do homem, que seleccionou, de forma empírica, sementes de sobreiros produtores de cortiça de boa qualidade, e que homogeneizou geneticamente as populações ao fazer a sua dispersão (Toumi and Lumaret, 2001). Jiménez et al. (1999) interpretam a estrutura genética da espécie de maneira diferente. Estes autores encontraram níveis de diversidade semelhantes entre as populações naturais de Q. suber e as populações em que há intervenção do homem e, por esse motivo, consideram que a distância que separa duas áreas povoadas por Q. suber não é suficiente para evitar a troca de genes entre as populações, que adquirem, rapidamente, a mesma estrutura genética. O facto da maior parte da variação genética estar distribuída no interior das populações é, segundo os autores, um reflexo da existência de cruzamentos com outras espécies do mesmo género, situação comum nos carvalhos.