A identificação humana através do estudo dos polimorfismos do DNA empregando a PCR necessita que o DNA extraído das amostras em estudo esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reação. Isto, muitas vezes, poderá implicar, além de procedimentos de extração propriamente ditos, os procedimentos de purificação do DNA extraído.
O primeiro passo para o isolamento do DNA é extraí-lo das células nucleadas de uma amostra obtida no curso da investigação criminal (amostra questionada), bem como isolá-lo de uma amostra referência de um tecido ou sangue de uma pessoa em questão.
O tipo de vestígio biológico, sua quantidade e seu estado de conservação vão ter influência na escolha da metodologia a ser adotada para o isolamento do DNA. Entretanto, independentemente da escolha feita, os métodos de extração e purificação do DNA consistem em três etapas. Na primeira delas ocorre a lise ou ruptura das membranas celulares e solubilização do DNA. Na segunda etapa emprega-se um método enzimático ou químico para remover as proteínas contaminantes e outras macromoléculas. Na terceira e última etapa, ocorre a precipitação geralmente alcoólica do DNA (HIRATA; HIRATA, 1998).
Alguns métodos envolvem uma morosa digestão com proteinase K, utilização de solventes orgânicos altamente tóxicos como fenol, clorofórmio e álcool isoamílico. Ainda que estes métodos propiciem a extração do DNA de uma grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos analíticos que podem incluir a transferência dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vários filtros ou colunas comerciais. Estes passos adicionais podem dar azo a transferências cruzadas de amostras ou a introdução de contaminantes.
Outras técnicas mais simplificadas ditas inorgânicas, como a que emprega
chelex15 para extração ou a baseada na precipitação salina (salting out), evitam o uso de solventes orgânicos de alta toxicidade e digestão pela proteinase K (BUDOWLE, 1996).
O princípio da extração orgânica (MANIATIS; SAMBROOK; FRITSH, 1996) consiste na remoção dos resíduos de proteínas do DNA através da combinação de dois solventes orgânicos diferentes: fenol e clorofórmio. O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeneizador, a lise celular com um detergente iônico, a extração fenólica e a precipitação etanólica do DNA.
Outro método orgânico compreende a solubilização dos tecidos ou células com detergente iônico e utilização de proteinase K para digerir as proteínas celulares. O isolamento do DNA segue basicamente o princípio anterior (HIRATA; HIRATA, 1998).
O princípio da extração de DNA por precipitação salina, também conhecida por salting out (MILLER; DYKES; POLESKY, 1988) consiste na remoção do sal da proteína celular, através da desidratação e precipitação com solução saturada de cloreto de sódio.
A metodologia que emprega chelex para extração de DNA (WALSH; METZGER; HIGUCHI, 1991; BUDOWLE, 1996) baseia-se no princípio que a presença desta resina no processo de ebulição do DNA evita sua degradação por complexação ou quelinitização de íons metálicos que podem agir como catalíticos na quebra do DNA em altas temperaturas e em soluções de baixo conteúdo iônico. Os procedimentos adaptados para as amostras forenses envolvem a fervura de células em uma suspensão de chelex a 5%.
Como anteriormente salientamos, a escolha da metodologia a ser aplicada para a extração deverá ser pautada no tipo, na quantidade e qualidade das amostras em análise. Em função disto, no decorrer dos vinte anos de aplicação do DNA na elucidação de crimes e identificação de pessoas, inúmeros protocolos de extração foram desenvolvidos
15 Resina quelante com alta afinidade por íons ou metais polivalentes, composta por polímeros de divinilbenzeno estireno com íons iminodiacetato com ação quelante (formação de qualquer composto em que se forma um anel graças a um enlace coordenado entre dois ou mais sítios de uma molécula e um íon metálico) (CALABREZ, 1999).
e aprimorados para contemplar necessidades específicas, em face da diversidade de vestígios biológicos e suas formas de apresentação. Neste sentido, por exemplo, foi editado um manual sobre protocolos de tipagem de DNA (BUDOWLE et al., 2000) contendo as metodologias de extração de DNA adotadas pelo FBI.
A agência norte-americana preconiza o uso da extração orgânica, com emprego de fenol-clorofórmio, em protocolos que incluam precipitação alcoólica para extração de sangue líquido, manchas de fluidos corpóreos, esperma e células vaginais. Indica a extração orgânica com utilização de filtro concentrador de DNA para manchas de sangue, manchas de saliva, swabs vaginais e manchas de sêmen. A extração orgânica tradicional é indicada para extração de DNA contido em abas de envelopes, selos, bitucas de cigarros, tecidos moles, cabelos, ossos, incluindo várias alternativas protocolares, e dentes.
O emprego de chelex é recomendado para extração de DNA de sangue total, sangue em manchas, sêmen contido em manchas, saliva contida em swabs, papel de filtro, abas de envelopes, selos e bitucas de cigarros. Pode ainda o chelex ser aplicado em cabelos, especificamente para análise de DNA mitocondrial.
Por último, a agência recomenda o método inorgânico (salting out) para extração de DNA de sangue total. Este manual contém também método de preparação para retirada de DNA imobilizado em cartão FTA®, mormente empregado para armazenagem e conservação de sangue em temperatura ambiente.
O DNA extraído de vestígios, oriundos de locais de crime, necrotérios ou os obtidos em atos exumatórios, se apresenta, amiúde, em baixa concentração, deteriorado ou contaminado e, como vimos, por isso, passível de análise, na maioria das vezes, apenas por métodos baseados na PCR pelo estudo de STRs ou pelo DNA mitocondrial.
Devido à baixa qualidade e quantidade do DNA extraído, tem sido comum o emprego de filtros concentradores de DNA para otimização das análises, bem como o uso de produtos para sua purificação, uma vez que a presença de contaminantes ou interferentes pode inibir a reação de PCR. Para ajudar na superação destes problemas,
houve o desenvolvimento de kits e produtos por empresas comerciais que são de grande auxílio aos analistas forenses.
Dentre os vários produtos disponíveis no mercado e que contribuem para a melhoria na obtenção de DNA, podemos destacar o tubo MICROCON™ YM-100 da Millipore. Trata-se de uma membrana filtrante que promove a concentração e a purificação do DNA. A Promega Corporation também oferece vários produtos para a extração e purificação do DNA. Entre eles ressaltamos os sistemas ReadyAmp™, DNA-IQ™ e Differex™.
O sistema ReadyAmp™ é utilizado para o isolamento e purificação do DNA genômico contido em manchas de sangue altamente degradadas empregando chelex. O sistema DNA-IQ™ utiliza partículas paramagnéticas para isolar o DNA de inibidores da PCR. Este sistema pode ser empregado na extração de vários tipos de vestígios, porém sua grande contribuição em nosso entender é a de propiciar sensível melhora na obtenção de DNA de ossos, verdadeiro calcanhar-de-aquiles dos analistas forenses. O sistema recém- lançado denominado Differex™ se propõe a substituir a tradicional extração diferencial pelo método orgânico, empregada para análise de vestígios de crimes sexuais, quer por sua praticidade quer por sua atoxicidade. Entretanto, ainda não temos parâmetro para avaliação da eficiência deste sistema.
A técnica que o sistema Differex™ quer superar é um procedimento empregado praticamente sem modificações há quase vinte anos. Desenvolvida por Gill, Jeffreys e Werret (1985), a extração diferencial pelo método orgânico é laboriosa, porém de grande eficiência, valendo a pena tecer alguns comentários sobre ela.
Nos crimes sexuais, espermatozóides podem estar misturados com células epiteliais da vítima. Os analistas geralmente tentam separar o material masculino do feminino em dois extratos ou frações, usando um procedimento chamado lise diferencial16
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Laboratórios forenses que dispõem de equipamentos para estudos de mtDNA podem obter informações acerca da origem étnica de um estuprador desconhecido. Isto é possível através do seqüenciamento das regiões da alça de deslocamento (alça-D) do mtDNA extraído dos espermatozóides após lise diferencial incompleta, ou seja, sem a total separação dos espermatozóides das células femininas. Estudo recente demonstrou que a lise incompleta impede a perda dos flagelos dos espermatozóides evitando com isso a concomitante perda da informação mitocondrial dos espermatozóides, fenômeno comum na lise completa (ANSLINGER et al., 2005).
que emprega detergentes fracos para liberar DNA das células epiteliais, seguidos da utilização de detergentes fortes para liberar o DNA dos espermatozóides. Isoladas as frações, ambas são submetidas à extração por fenol-clorofórmio (THOMPSON; KRANE, 2003).
Os principais protocolos utilizados para extração pelo Laboratório de DNA do Instituto de Criminalística de São Paulo (ANEXO 2) empregam quatro metodologias: 1) extração de DNA pelo iodeto de sódio, rotineiramente empregada para sangue in natura e bem conservado; 2) extração de DNA com fenol-clorofórmio, utilizada para ossos e dentes ou para manchas de sangue ou sangue in natura em péssimo estado de conservação; 3) extração de DNA de osso usando DNA-IQ™, empregada para ossos em péssimo estado de conservação e 4) extração diferencial de DNA pelo método orgânico, utilizada para manchas, lâminas e swabs contendo esperma.
No campo do isolamento do DNA, devemos ainda registrar o emprego de sistemas automatizados. A introdução de dispositivos robóticos se deu há mais de duas décadas para processamento de amostras líquidas de espécimes clínicos e nos dez últimos anos esta tecnologia foi transferida aos laboratórios forenses. A automatização foi empregada originalmente nos laboratórios criminais para ajudar no processamento de milhares de amostras de sangue líquido e de swabs orais usados como referência nos casos estudados, bem como para alimentar os bancos de dados de perfis genéticos de condenados, tal qual o CODIS - Combined DNA Index System, norte-americano. O sistema robotizado propicia a extração, amplificação e tipagem automáticas do DNA.
O uso da robótica para análise de vestígios criminais encontra vários obstáculos. O primeiro deles é a etapa de extração de DNA, uma vez que estas amostras normalmente sofrem insultos ambientais, além de serem encontradas em qualquer tipo de suporte imaginável que pode, muitas vezes, acrescentar inibidores ao extrato. Além disto, os casos mais comuns submetidos aos laboratórios de DNA são aqueles relacionados com crimes sexuais em que a separação do esperma das amostras pode ser um desafio. Outro obstáculo a ser vencido pela robotização é a quantificação destas amostras, pois diferentemente da amostra-referência, elas devem ser necessariamente quantificadas (CROUSE; CONOVER, 2004).
Considerando estas dificuldades, o uso da robótica para análise de vestígios encontrados em locais de crime começou há poucos anos e vem sendo incrementado à medida que os cientistas forenses fazem ensaios de validação de protocolos para extração e quantificação de DNA para este tipo de plataforma.
O incremento na incorporação da robótica deve-se também ao fato dela propiciar a redução da necessidade de trabalho intenso com fenol-clorofórmio, reagentes de alta toxicidade, nas extrações de DNA (MONTPETIT; FITCH; O‟DONNELL, 2005).