Dados publicados na literatura propõem que os decaimentos transversais das amostras de leite são monoexponencial56,57,59 com obtenção de um único valor de T2, referente ao sinal de 1H da água livre. Neste contexto, um procedimento univariado foi proposto para efetuar a classificação e quantificação das amostras de leite adulterada e não adulterada.
Na Figura 3.6 têm-se as curvas de CPMG das amostras de leite não adulterada e adulterada com água em 5, 15, 25, 35 e 50% v/v. Nesta figura, observa-se que o decaimento do sinal torna-se mais longo com o aumento da porcentagem de adulteração, indicando um aumento nos valores de T2 com o aumento da taxa de adulteração.
FIGURA 3.6. Curvas de CPMG das amostras de leite não adulterado e adulterado com água em 5, 15, 25, 35 e 50% v/v.
Este mesmo comportamento foi observado para os demais adulterantes estudados (soro, leite sintético, urina sintética e ureia), com exceção do peróxido de hidrogênio. No caso da adulteração com peróxido de hidrogênio, observou-se uma variação no valor de T2 devido à formação/liberação de oxigênio, mencionada anteriormente.
Sentido do aumento da porcentagem de água em leite bovino
-0,1 0,4 0,9 1,4 1,9 2,4 -0,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 Inte ns id ad e ( u.a .) T2 (s)
Na Tabela 3.4 têm-se os valores de T2 obtidos para as amostras adulteradas com água, soro, leite sintético, urina sintética e peróxido de hidrogênio. Nesta tabela, observa-se uma variação nos valores de T2 de 0,171 (para amostra de leite não adulterada) até 0,307 s (amostras de leite adulterada em 50% v/v). Para as amostras de leite adulteradas com peróxido de hidrogênio em 5% v/v o valor de T2 foi inferior ao obtido para uma amostra de leite não adulterada. O mesmo comportamento foi observado para as amostras adulteradas em 15 % v/v. Para a amostra de leite adulterada em 25 % v/v, observou-se um aumento no valor de T2 quando comparado aos obtidos com as amostras adulteradas em 5 e 15% v/v, no entanto o valor foi inferior aos apresentados pelas demais amostras adulteradas em 25% v/v. Estes resultados apresentam concordância com os apresentados na Figura 3.4, onde as amostras de leite adulteradas em 5 e 15% v/v encontram-se no quadrante inferior esquerdo (peso negativo para PC1 e PC2).
TABELA 3.4. Valores de T2 para as amostras de leite. Adulterante T2 (s) 5 % 15 % 25 % 35 % 50 % Água 0,187± 0,002 0,213 ± 0,003 0,243 ± 0,002 0,279 ± 0,007 0,362 ± 0,005 Soro 0,189 ± 0,002 0,207 ± 0,001 0,234 ± 0,002 0,280 ± 0,011 0,342 ± 0,007 Leite sintético 0,188 ± 0,001 0,212 ± 0,002 0,240 ± 0,002 0,282 ± 0,010 0,363 ± 0,004 Urina sintética 0,190 ± 0,001 0,210 ± 0,008 0,243 ± 0,003 0,286 ± 0,012 0,377 ± 0,006 Peróxido de hidrogênio 0,135 ± 0,006 0,161 ± 0,006 0,205 ± 0,005 0,283 ± 0,014 0,403 ± 0,017 *T2 para amostra de leite não adulterada igual 0,171 s.
Na Figura 3.7 têm-se os gráficos de correlação entre os valores de T2 e as porcentagens de adulteração para as amostras adulteradas com água (A), soro (B), leite sintético (C), urina sintética (D) e peróxido de hidrogênio (E).
FIGURA 3.7. Correlações obtidas entre os valores de T2 e as porcentagens de adulteração para as amostras de leite adulteradas com água (A), soro (B), leite sintético (C), urina sintética (D) e peróxido de hidrogênio (E).
0 10 20 30 40 50 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 (A) T2 ( s) Porcentagem de água (v/v) 0 10 20 30 40 50 0,16 0,20 0,24 0,28 0,32 0,36 (B) T2 ( s) Porcentagem de soro (v/v) 0 10 20 30 40 50 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 (C) T2 ( s)
Porcentagem de leite sintético (v/v)
0 10 20 30 40 50 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 (D) T2 ( s)
Porcentagem de urina sintética (v/v)
0 10 20 30 40 50 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 (E) T2 ( s)
Nestes gráficos (Figura 3.7) é possível observar uma variação linear entre os valores de T2 e a porcentagem de adulteração. A partir de um teste t pareado, com 95% de confiança, verificou-se que os valores de T2 das amostras de leite não adulterada e adulterada são estatisticamente diferentes e, desta forma, o procedimento univariado pode ser utilizado para verificar a autenticidade do leite bovino.
Modelos de quantificação foram desenvolvidos para verificar a habilidade do método univariado em quantificar a porcentagem de adulteração nas amostras de leite. Inicialmente, foram obtidos modelos individuais e os valores de SEP foram ≤ 3,61 (para água), 15,5 (para urina sintética), 2,9 (para soro), 3,7 (para leite sintético) e 9,5% v/v (para peróxido de hidrogênio). Em seguida, um novo modelo foi construído utilizando as amostras de leite adulteradas com água, urina sintética, soro e leite sintético. As amostras adulteradas com peróxido de hidrogênio não foram incluídas no modelo devido às variações nos valores de T2, como mostrado na Tabela 3.4. O valor de SEP obtido com este modelo foi ≤ 3,9 % v/v. Ao comparar o desempenho estatístico dos modelos univariados e multivariados, verificou-se um menor valor de SEP para os modelos multivariados.
3.5. Conclusão parcial
A partir destes resultados, conclui-se que a RMN-DT pode ser utilizada para verificar a autenticidade do leite bovino. Modelos de classificação SIMCA e KNN apresentaram uma alta porcentagem de acerto, permitindo a classificação das amostras quanto à porcentagem de adulteração e à presença de adulterante. Os baixos valores de SEP e SECV obtido com o modelo de quantificação PLS evidenciou a habilidade da RMN-DT em aplicações quantitativas.
Os valores de T2, obtidos a partir de um ajuste monoexponencial nas curvas de T2, apresentaram uma alta correlação com as porcentagens de adulteração, permitindo o desenvolvimento de modelos univariados. A partir de um teste t pareado verificou-se que o valor de T2 das amostras de leite não adulteradas é estatisticamente diferente dos T2 das amostras de leite adulteradas.
Ao comparar o desempenho estatístico dos modelos de quantificação, verificou-se que o método multivariado apresentou um melhor desempenho estatístico, com menos valores de SEP.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Devido à necessidade do desenvolvimento de procedimentos analíticos rápidos, precisos e robustos, as estratégias apresentadas neste trabalho de doutorado se mostraram viáveis para determinação e quantificação de adulteração em amostras de leite bovino. Além disso, uma das principais vantagens dos procedimentos propostos está relacionada com a possibilidade de aplicações in-situ e online.
Uma correlação entre o desempenho estatístico dos modelos de classificação e quantificação, obtidos com os três procedimentos analíticos, pode ser visualizada no gráfico a seguir:
Modelos de classificação obtidos a partir do uso de imagens digitais apresentaram resultados similares aos obtidos com os espectros de MIR e com as curvas de T2, permitindo a discriminação das amostras de leite não adulterada e adulterada. No entanto, modelos de classificação obtidos com o espectrômetro portátil de MIR e RMN-DT também possibilitaram a classificação das amostras de acordo com a porcentagem de adulteração. Ainda com os espectrômetros de MIR, foi possível o desenvolvimento de um procedimento capaz de classificar as amostras de acordo com o tipo de adulterante utilizado no processo de adulteração.
Ao comparar o desempenho estatístico dos modelos de quantificação, verificou-se uma melhor habilidade de predição para o modelo obtido com o método de MIR (espectrômetro modelo Cary 630), com valores de
Calibração Cl ass ifi caçã o RMN MIR Imagens
SEP ≤ 1% v/v. O modelo obtido com o uso de imagens digitais foi o que apresentou o pior desempenho estatístico com valores de SEP ≤ 5,85% v/v. Estes resultados podem ser visualizados na tabela abaixo.
Número
de fatores SEC SECV SEP rcal rval Imagem digital 4 5,84 5,84 5,85 0,94 0,94 NIR MicroPHAZIR* (1600 - 2400 nm) 5 4,63 4,69 4,74 0,92 0,92 MIR Cary 630* (1300-900 cm-1) 4 0,74 0,76 0,83 0,98 0,98 MIR FlexScan* (1800-900 cm-1) 5 4,05 4,12 4,18 0,94 0,92 RMN-DT 2 1,34 1,71 1,73 0,99 0,98
Quanto ao custo e praticidade apresentada pelos procedimentos desenvolvidos, o uso da análise por imagem digital permitiu a utilização de acessórios de baixo custo para aquisição dos dados, no entanto, o procedimento apresenta uma menor praticidade quando comparado com os métodos de MIR e RMN-DT. Os espectrômetros portáteis de MIR apresentam uma maior praticidade devido à facilidade de implementação em análises in-situ e por permitiram a análise direta, sem a aplicação da etapa de preparo da amostra. Já a RMN-DT, apesar de ser considerado um método de bancada, a sua utilização em análises in-situ ainda é limitada devido à dificuldade de transporte do equipamento. A correlação entre o custo e praticidade dos procedimentos desenvolvidos pode ser visualizada, de forma resumida, no gráfico a seguir:
Parte dos resultados apresentados nesta tese foi publicado na Food Analytical Method (DOI: 10.1007/s12161-011-9216-2), Food Chemistry (DOI: 10.1016/j.foodchem.2012.10.024) e no Journal of Agricultural and Food Chemistry (DOI: 10.1021/jf303814g). Custo Praticidade RMN MIR Imagens
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