Kapittel 2 – Anselm
2.5 Anselm som brevskriver – og om han samlet brevene selv
A obtenção dos espectros de massas altas não foi possível para as cepas Cyclotella sp. e 326 (H. reticulata). O agrupamento representado na Figura 11 foi realizado, portanto, com os espectros das réplicas de cultivo de 16 cepas. A matriz de similaridade
25 ao lado do cluster evidencia a alta reprodutibilidade dos espectros das réplicas. Assim houve o agrupamento das réplicas das cepas analisadas, exceto no caso da cepa 065 (N.
lunatum) em que uma das réplicas (R3) ficou em um ramo separado das outras. Essa
separação pode ser explicada por uma diferença na porção inicial dos espectros (Figura 13). Essa parte do espectro, com vários picos sucessivos, é característica de polímeros (Hillenkamp et al., 1991). Características das células deste cultivo ou erros metodológicos, como problemas na homogeneização da mistura ou cristalização inadequada, podem ter provocado essa baixa intensidade dos picos.
Quatro cepas do gênero Monoraphidium ficaram agrupadas, sendo que as cepas 306 e 329 (M. contortum) ficaram agrupadas em um mesmo clado, enquanto outra cepa dessa mesma espécie (CB2012/33) ficou agrupada com a cepa 325 (M. pseudobraunii). A cepa 549 (M. indicum), apesar de pertencer ao mesmo gênero, não agrupou com as demais. Estudos recentes (Garcia et al., 2017) indicam que esse gênero não seria monofilético e, portanto, a classificação atual destes organismos pode estar incorreta.
As cepas da espécie S. bibraianum (334, 602 e CB2009/36) ficaram agrupadas em um mesmo clado, mantendo a mesma separação observada no cluster obtido com massas baixas, em que a cepa CB2009/36 fica isolada das outras duas. Novamente refletindo um possível isolamento geográfico dessas cepas.
Assim como com os espectros de massas baixas as cepas 137 e 455 (C. braunii) também foram agrupadas. No entanto, e as cepas 333 e CB2009/30 (A. fusiformis) que foram agrupadas com as do gênero Monoraphidium na análise anterior, ficaram agora agrupadas em um clado distinto.
Apesar do agrupamento em clados distintos a matriz de similaridade (Figura 11) mostra que entre os espectros das cepas 333 (A. fusiformis) e CB2009/33 (M. contortum) há uma similaridade considerável. Além disso a cepa CB2009/33 também apresentou uma similaridade com as cepas 602 e 334 (S. bibraianum). A cepa 549 (M. indicum) também apresenta similaridade com a cepa 329 (M. contortum), que pertence ao mesmo gênero.
Essas similaridades podem ser um indício de que algumas regiões do espectro podem ser mais significativas para o agrupamento dessas cepas em um mesmo clado, uma vez que todas pertencem à família Selenastraceae.
26
27 Dessa forma a utilização de diferentes extensões de massas pode contribuir para a resolução de problemas taxonômicos distintos. Enquanto em massas baixas os gêneros
Monoraphidium e Ankistrodesmus não são distinguíveis, em massas altas a separação é
evidente. Porém essa distinção coloca o gênero Ankistrodesmus distante do clado que agrupa os gêneros Selenastrum e Monoraphidium em um cluster elaborado com os espectros médios das cepas (Figura 12).
Figura 12. Dendrograma baseado nos espectros médios de massas altas (2 – 20 kDa) das cepas.
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4.5. MATÉRIA ORGÂNICA DISSOLVIDA (MOD)
4.5.1.MASSAS BAIXAS (400–2000DA)
Os espectros de massas baixas adquiridos para a MOD foram praticamente todos iguais, incluindo espectros obtidos com uma mistura de matriz com acetona (solvente utilizado na eluição da matéria orgânica das colunas). Isso indica que provavelmente os picos dos espectros obtidos não são das amostras, mas sim resultantes de íons da própria matriz e/ou de algum solvente. A Figura 14 mostra uma comparação de alguns espectros obtidos. Devido à grande semelhança dos espectros não foi possível a realização de uma análise de cluster para a MOD nessa extensão de massas.
Figura 14. Exemplos de espectros de massas baixas obtidos com a MOD de diferentes cepas.
4.5.2.MASSAS ALTAS (2000–20000DA)
A obtenção de espectros de massas altas da MOD foi satisfatória para nove cepas, ou seja, em nove das 18 cepas não foi possível obter picos com uma intensidade superior aos ruídos. A ausência de picos nos espectros dessas cepas pode ser resultado da pequena quantidade de material analisado associado a uma baixa produção de matéria orgânica que é excretada. A Figura 15 representa a análise de cluster realizada com base nos espectros obtidos.
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Figura 15. Cluster baseado nos espectros de massas altas (2 - 20 kDa) da MOD das réplicas de cultivo.
As diferenças entre os espectros da MOD das cepas permitiram discriminação dessas. No entanto, somente foram obtidos espectros de cepas diferentes de uma mesma espécie para M. contortum (329, 306 e CB2012/33). Assim não é possível avaliar a capacidade da distinção de espécies através de espectros da MOD, uma vez que mesmo a utilização das células não permitiu o agrupamento de todas as cepas dessa espécie em um único clado.
Esses testes foram de grande valia para futuros experimentos de estudos de associações algas/bactérias altamente específicas (populações bacterianas associadas a excretados de algumas espécies de microalgas de um mesmo gênero), pois permite decidir qual dos excretados devem ser usados.
4.6. IDADE DO CULTIVO E VARIAÇÃO DA MOD
A análise de massas baixas não apresentou intensidade suficiente para a obtenção de espectros para nenhuma das cepas em nenhum dos dias estudados. No entanto com a análise de massas altas foi possível obter espectros (Figura 16). A qualidade dos espectros variou conforme os dias de cultivo. Todas as cepas apresentaram espectros sem
30 intensidade de sinais com quatro dias de cultivo. Para a cepa 333 (A. fusiformis) esse quadro manteve-se até a análise com 25 dias de cultivo, apresentando intensidade de picos superior aos ruídos somente com 32 dias.
A cepa CB2009/33 (M. contortum) começou a apresentar intensidade de sinais após 11 dias de cultivo. Estes picos possuem características de compostos poliméricos e há um aumento da intensidade dos picos com maior relação massa carga com o passar do tempo. A cepa 047 (S. bibraianum) também começa a apresentar picos após 11 dias de cultivo. Contudo os picos não são compostos poliméricos e com maior tempo de cultivo ocorre um aumento da intensidade dos picos de compostos com menor relação massa carga.
A intensidade de sinais, presentes em todas as cepas, no período de 32 dias pode ser explicada pelo fato de a quantidade de células ser maior, havendo assim uma maior produção de MOD. Além disso após este tempo os cultivos atingem a fase estacionária; fase em que a produção de MOD é maior quando comparada à fase exponencial de crescimento (Giroldo & Vieira, 2005). Esses resultados corroboram o estudo de Nicolau
et al. (2014), em que verificaram mudanças na MOD de espécies de diatomáceas de
acordo com a idade do cultivo.
Figura 16. (Continua)
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Figura 16. Variação da Matéria Orgânica Dissolvida (MOD) ao longo do crescimento. Espectros de massas
altas com subtração da linha de base. As massas acima de 6 kDa foram omitidas por não haver picos. - Monoraphidium contortum
32
5.C
ONCLUSÕESOs espectros obtidos das células possibilitaram, através das análises de cluster, a distinção de todas as cepas. A distinção das espécies também foi possível, com exceção das espécies do gênero Monoraphidium, que é provavelmente um grupo polifilético. Os espectros tanto de massas altas quanto de massas baixas permitiram o agrupamento das cepas de C. braunii (455 e 137) e de S. bibraianum (334, 602 e CB2009/36), sendo que para esta última os espectros evidenciaram uma diferença entre cepas isoladas de continentes diferentes.
As cepas de A. fusiformis (333 e CB2009/30) ficaram agrupadas com as análises baseadas em massas altas. Contudo as análises baseadas em massas baixas agruparam essas cepas com as cepas do gênero Monoraphidium (306, 325, 329, 549 e CB2012/33), havendo grande similaridade entre os espectros dessas cepas.
Os experimentos com a MOD foram realizados como testes preliminares para estudos futuros. Nesses estudos poderão ser investigados os compostos que são produzidos, analisando possíveis aplicações econômicas. Também serão analisadas as relações de diferentes comunidades bacterianas que vivem associadas aos compostos excretados por comunidades de microalgas de água doce. Essas informações podem ser de grande valia, como parte de estudos de taxonomia polifásica, auxiliando no entendimento das relações taxonômicas das microalgas.
Os dados obtidos com a MOD evidenciaram a possibilidade de seu uso para a obtenção de espectros por MALDI-TOF. No entanto novos protocolos de preparação das amostras ainda devem ser testados, com diferentes matrizes e quantidades de material. Os resultados mostram que a quantidade da MOD produzida em diferentes fases do cultivo também deve ser levada em consideração.
Assim o grande número de amostras que podem ser colocadas no aparelho de uma única vez associado ao processo automático de obtenção de espectros também favorece a praticidade da técnica, o que possibilita a obtenção de um grande conjunto de dados capazes de caracterizar cepas e espécies de microalgas em pouco tempo.
33
6.R
EFERÊNCIASAmiri-Eliasi, B., & Fenselau, C. (2001). Characterization of Protein Biomarkers Desorbed by MALDI from Whole Fungal Cells. Anal Chem, 73(21), 5228-5231. doi: 10.1021/ac010651t
Andrade, L. M., Mendes, M. A., Kowalski, P., & Nascimento, C. A. (2015). Comparative study of different matrix/solvent systems for the analysis of crude lyophilized microalgal preparations using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom, 29(3), 295-303. doi: 10.1002/rcm.7110
Barbano, D., Diaz, R., Zhang, L., Sandrin, T., Gerken, H., & Dempster, T. (2015). Rapid Characterization of Microalgae and Microalgae Mixtures Using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). PLoS ONE, 10(8), e0135337. doi: 10.1371/journal.pone.0135337
Beavis, R. C., & Chait, B. T. (1989). Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins. Rapid Commun Mass Spectrom,
3(12), 432-435. doi: 10.1002/rcm.1290031207
Begon, M., Townsend, C. R., & Harper, J. L. (2006). Ecology : from individuals to
ecosystems (4th ed.). Malden, MA: Blackwell Pub.
Bux, F., & Chisti, Y. (2016). Algae Biotechnology: Products and Processes: Springer. Calderaro, A., Arcangeletti, M. C., Rodighiero, I., Buttrini, M., Gorrini, C., Motta, F., . .
. De Conto, F. (2014). Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry applied to virus identification. Sci Rep, 4, 6803. doi: 10.1038/srep06803
Calderaro, A., Gorrini, C., Piccolo, G., Montecchini, S., Buttrini, M., Rossi, S., . . . Medici, M. C. (2014). Identification of Borrelia species after creation of an in- house MALDI-TOF MS database. PLoS ONE, 9(2), e88895. doi: 10.1371/journal.pone.0088895
Calderaro, A., Piergianni, M., Buttrini, M., Montecchini, S., Piccolo, G., Gorrini, C., . . . De Conto, F. (2015). MALDI-TOF mass spectrometry for the detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar. PLoS ONE, 10(4), e0122448. doi: 10.1371/journal.pone.0122448
34 Dai, Y., Whittal, R. M., & Li, L. (1999). Two-layer sample preparation: a method for
MALDI-MS analysis of complex peptide and protein mixtures. Anal Chem, 71(5), 1087-1091.
Emami, K., Hack, E., Nelson, A., Brain, C. M., Lyne, F. M., Mesbahi, E., . . . Caldwell, G. S. (2015). Proteomic-based biotyping reveals hidden diversity within a microalgae culture collection: An example using Dunaliella. Sci Rep, 5, 10036. doi: 10.1038/srep10036
Garcia, T. S., Bock, C., Sant’Anna, C. L., Bagatini, I. L., Wodniok, S., & Vieira, A. A. H. (2017). Selenastraceae (Sphaeropleales, Chlorophyceae): rbcL, 18S rDNA and ITS-2 secondary structure enlightens traditional taxonomy, with description of two new genera, Messastrum gen. nov. and Curvastrum gen. nov. Fottea.
Georgescu-Roegen, N. (1975). Energy and Economic Myths. Southern Economic
Journal, 41(3), 347-381. doi: 10.2307/1056148
Ghasemi, Y., Rasoul-Amini, S., Naseri, A. T., Montazeri-Najafabady, N., Mobasher, M. A., & Dabbagh, F. (2012). Microalgae biofuel potentials (Review). Applied
Biochemistry and Microbiology, 48(2), 126-144. doi:
10.1134/s0003683812020068
Giroldo, D. & Vieira, A. A. H. (2005). Polymeric and free sugars released by three phytoplanktonic species from a freshwater tropical eutrophic reservoir. Journal of Plankton Research. 27: 695-705.
Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., & Harrison, S. T. (2011). Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density.
J Microbiol Methods, 85(2), 119-123. doi: 10.1016/j.mimet.2011.02.005
Gross, J. H. (2011). Mass Spectrometry: A Textbook (2 ed.): Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Guillard, R. R. L., & Lorenzen, C. J. (1972). Yellow-green algae with chlorophyllide C1,2.
Journal of Phycology, 8(1), 10-14. doi: 10.1111/j.1529-8817.1972.tb03995.x
Guschina, I. A., & Harwood, J. L. (2006). Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Prog Lipid Res, 45(2), 160-186. doi: 10.1016/j.plipres.2006.01.001
Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., & Chait, B. T. (1991). Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Anal Chem, 63(24), 1193A-1203A.
Hoek, C. v. d., Mann, D. G., & Jahns, H. M. (1995). Algae : an introduction to phycology. Cambridge ; New York: Cambridge University Press.
35 Hoffmann, E. (1996). Mass spectrometry: Wiley Online Library.
Krienitz, L., & Bock, C. (2012). Present state of the systematics of planktonic coccoid green algae of inland waters. Hydrobiologia, 698(1), 295-326. doi: 10.1007/s10750-012-1079-z
Krienitz, L., Ustinova, I., Friedl, T., & Huss, V. A. R. (2001). Traditional generic concepts versus 18S rRNA gene phylogeny in the green algal family Selenastraceae (Chlorophyceae, Chlorophyta). Journal of Phycology, 37(5), 852-865. doi: 10.1046/j.1529-8817.2001.01004.x
Lee, F. W.-F., Ho, K. C., & Lo, S. C.-L. (2008). Rapid identification of dinoflagellates using protein profiling with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Harmful Algae, 7(4), 551-559. doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.hal.2007.12.001
Lee, H. W., Roh, S. W., Cho, K., Kim, K. N., Cha, I. T., Yim, K. J., . . . Kim, D. (2015). Phylogenetic analysis of microalgae based on highly abundant proteins using mass spectrometry. Talanta, 132, 630-634. doi: 10.1016/j.talanta.2014.08.078 Lewis, J. K., Wei, J., & Siuzdak, G. (2006). Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Mass Spectrometry in Peptide and Protein Analysis Encyclopedia of Analytical
Chemistry: John Wiley & Sons, Ltd.
Likens, G. E. (1975). Primary Production of Inland Aquatic Ecosystems. In H. Lieth & R. H. Whittaker (Eds.), Primary Productivity of the Biosphere (pp. 185-202). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg.
Murugaiyan, J., Ahrholdt, J., Kowbel, V., & Roesler, U. (2012). Establishment of a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry database for rapid identification of infectious achlorophyllous green micro-algae of the genus Prototheca. Clin Microbiol Infect, 18(5), 461-467. doi: 10.1111/j.1469-0691.2011.03593.x
Nicolau, A., Sequeira, L., Santos, C., & Mota, M. (2014). Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) applied to diatom identification: influence of culturing age. Aquatic Biology,
20(2), 139-144.
Paz, B., Riobo, P., & Franco, J. M. (2011). Preliminary study for rapid determination of phycotoxins in microalgae whole cells using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass
36 Phillipson, J. (1966). Ecological Energetics. London: Edward Arnold.
Pulz, O., & Gross, W. (2004). Valuable products from biotechnology of microalgae. Appl
Microbiol Biotechnol, 65(6), 635-648. doi: 10.1007/s00253-004-1647-x
Reynolds, C. S. (2006). Ecology of phytoplankton. Cambridge: Cambridge University Press.
Rodhe, H. (1990). A comparison of the contribution of various gases to the greenhouse effect. Science, 248(4960), 1217-1219. doi: 10.1126/science.248.4960.1217 Ryan, C., Green, T. B., Hartley, A., Browning, B., & Garvin, C. (2009). Cultivation Clean
Energy: The Promise of Algae Biofuels.
Rysanek, D., Hrckova, K., & Skaloud, P. (2015). Global ubiquity and local endemism of free-living terrestrial protists: phylogeographic assessment of the streptophyte alga Klebsormidium. Environ Microbiol, 17(3), 689-698. doi: 10.1111/1462- 2920.12501
Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., & Schumaker, S. (2013). MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev, 32(3), 188-217. doi: 10.1002/mas.21359
Shih, C. J., Chen, S. C., Weng, C. Y., Lai, M. C., & Yang, Y. L. (2015). Rapid identification of haloarchaea and methanoarchaea using the matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Sci Rep, 5, 16326. doi: 10.1038/srep16326
Smith, V. H., Tilman, G. D., & Nekola, J. C. (1999). Eutrophication: impacts of excess nutrient inputs on freshwater, marine, and terrestrial ecosystems. Environ Pollut,
100(1-3), 179-196.
Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E., & Isambert, A. (2006). Commercial applications of microalgae. J Biosci Bioeng, 101(2), 87-96. doi: 10.1263/jbb.101.87
Starostin, K. V., Demidov, E. A., Bryanskaya, A. V., Efimov, V. M., Rozanov, A. S., & Peltek, S. E. (2015). Identification of Bacillus strains by MALDI TOF MS using geometric approach. Sci Rep, 5, 16989. doi: 10.1038/srep16989
Treviño, I. F. (2008). Estudios taxonómicos en algas verdes cocales del sur de España. (Tesis Doctoral), Universidad de Granada, Granada. Retrieved from http://hdl.handle.net/10481/1945
37 Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., de Vos, P., Kersters, K., & Swings, J. (1996).
Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol
Rev, 60(2), 407-438.
Williams, P. J. l. B., & Laurens, L. M. L. (2010). Microalgae as biodiesel & biomass feedstocks: Review & analysis of the biochemistry, energetics & economics.
Energy & Environmental Science, 3(5), 554-590. doi: 10.1039/B924978H
Zhang, L., Smart, S., & Sandrin, T. R. (2015). Biomarker- and similarity coefficient- based approaches to bacterial mixture characterization using matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). Sci