Competence aims after Year 2

Para avaliar o efeito do EvCI na migração leucocitária em camundongos sépticos utilizou-se o modelo de ligadura e perfuração cecal (LPC). Observa- se na figura 27 que o EvCI inibiu em cerca de 84 e 87 % a migração leucocitária utilizando 0,5 e 1,0 µg por peritônio, respectivamente. O gráfico representa a comparação entre as médias do número de leucócitos por mm3 _de líquido peritoneal, 6 horas após a indução da sepse, exceto para o controle negativo onde não houve a indução de sepse.

0 20 40 60 80 100 120 0 1 2 3 4 5 6 7 T e m p o (s e gu n d o s) EvCI (µg) ApTT TP 0 50 100 150 200 250 300 0 2 4 6 T e m p o (s e gu n d o s) Heparina (µg) ApTT TP A B * * * * * * *

Figura 27. Efeito do EvCI sobre a migração leucocitária em camundongos sépticos. *p<0,001 em relação ao controle positivo (ANOVA; teste de Tukey).

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Controle + Controle - 0,5 1 C é lu la s/m m 3 EvCI (µg) *

5. DISCUSSÃO

Em plantas, os inibidores de proteases atuam como proteínas de reserva (Mosolov, 1995; Valueva; Mosolov, 1999) ou podem estar envolvidos no mecanismo de defesa vegetal contra pragas e doenças causadas por patógenos (Ryan, 1990; Macêdo et al., 2003; Haq et al., 2004; Tamhane et al., 2005). Os inibidores podem ser também utilizados como ferramentas alternativas no tratamento de patologias tais como hemorragias, inflamação e câncer. Inibidores tipo Kunitz e Bowman-Birk estão envolvidos em muitos processos fisiológicos e, por isso, são os mais estudados como candidatos para possíveis fármacos (Oliva et al., Chen; Shaw, 2003; Fook et al., 2005; Mello et al., 2006). Extratos proteicos de várias leguminosas, como feijão lima (Phaseolus limensis), feijão comum (Phaseolus vulgaris), feijão azuki (Phaseolus angularis), lentilha (Lens culinares), ervilha (Pisum sativum) e, mais recentemente o tamarindo (Tamarindus indica) apresentaram-se como ricas fontes de inibidores de ENH (Fook et al., 2005; Hojima, Pisano, Cochrane, 1983; Siedle et al., 2003). Os inibidores do tipo Bowman-Birk parecem ter uma característica intrínseca de inibir tanto a elastase neutrofílica como quimotripsina, porém a maioria dos seus estudos estão voltados para propriedades anti-carcinogênicas (Kennedy, 1998; Rui-Feng, Song, Chi, 2005). Sua aplicação terapêutica em doenças antiinflamatórias tem perdido a cena para inibidores do tipo Kunitz, serpinas e Kazal, o que tem tornado a busca por inibidores exógenos, não só de elastase neutrofílica, mas também de outras enzimas relacionadas com o processo inflamatório, com intuito de minimizar tais moléstias relacionadas à destruição tecidual por proteases.

De acordo com a literatura, vários inibidores de leguminosas do gênero Erythrina já foram purificados. Dentre eles, quatro inibidores de Erythrina caffra, sendo um específico para tripsina, outro específico para quimotripsina e dois inibidores bifuncionais, que inibem tanto tripsina como quimotripsina (Joubert, 1982a). Nas espécies Erythrina acanthocarpa e Erythrina latissima foram purificados dois inibidores de cada uma, um específico para tripsina e outro específico para quimotripsina (Joubert, 1982b; Joubert; Carlsson; Haylett, 1981) e dois inibidores de tripsina (ETIa e ETIb) e um de quimotripsina (ECI)

foram isolados das sementes de Erythrina variegata (Kouzuma et al., 1992). Entretanto não há relatos na literatura demonstrando a ação inibitória de inibidores purificados de sementes desse gênero sob a elastase neutrófilica humana (ENH).

Em 2010, Varela isolou, purificou e caracterizou um inibidor de quimotripsina das sementes de Erythrina veluntina (EvCI) no qual foi observado o efeito antiproliferativo desse inibidor sob linhagens de células tumorais.

Nesse estudo o EvCI foi purificado de acordo com a metodologia seguida por Varela (2010) com modificações, no qual no último passo de purificação do inibidor foi utilizado uma cromatografia de troca iônica Resource Q em substituição a cromatografia de fase reversa C18. A recuperação no último passo foi de 1,1 % de rendimento (tabela 4), resultado superior aos encontrados para outros inibidores tipo Kunitz (Bhattacharyya, et al., 2006; Bhattacharyya; Rai; Babu, 2007; Gomes, et al., 2005; Macedo et al., 2007; Mello et al., 2001). A purificação foi de 104,3 vezes, valor inferior ao encontrado por Gomes e colaboradores (2005) para o inibidor de tripsina de sementes de C. pallida, o qual foi purificado 180 vezes e superior ao inibidor de tripsina das sementes de T. indica, purificado 80,57 vezes (Fook et al., 2005). Sendo assim, o EvCI possui um alto rendimento e pureza com relação a outros inibidores na literatrura.

Em relação à especificidade, EvCI inibe a elastase neutrofílica e a calicreína pancreática suína com uma IC50 de 3,12 nM e 9,6 nM respectivamente, como também inibe o fator X (ativado) e a plasmina com uma taxa de inibição de 83% e 73% respectivamente, porém não afetando a atividade da tripsina, trombina bovina e Catepsina G, além de inibir apenas moderadamente a atividade da Proteinase 3. Especificidades de inibição diferentes foram encontrados para inibidor tipo Kunitz isolado de tubérculos de batata, como PSPI-21, com massa molecular de aproximadamente 21 kDa, que se comportou como um potente inibidor de ENH, tripsina e quimotripsina (Valueva, Revina, Mosolov, 1997). Para o inibidor purificado de tamarindo foi observado especificidade para ENH e tripsina pancreática bovina (Fook et al., 2005). O inibidor de tripsina urinário (UTI) que possui inibição para tripsina,

quimotripsina, plasmina, catepsina G, HNE e proteinases da cascata de coagulação (Inoue et al., 2005).

A IC50 do EvCI para a HNE foi de 3,12 nM (0,053 µg/mL). Esse valor se encontra bem abaixo daqueles encontrados por Johansson e colaboradores (2002), quando analisaram extratos protéicos ricos em inibidores de serinoproteases de mais de 96 espécies de plantas com propriedades fitoterápicas assim como a Anemone canadensis, Trifolium pratense, Alluandia humbertii e Commiphora guidottii, nos quais a IC50 está em torno de 100 µg/mL. A IC50 do EvCI foi bastante inferior quando comparada aos inibidores de elastase de Tamarindus indica purificado por Fook et al. (2005) e ao SKTI (Ribeiro et al., 2010) que foram de aproximadamente 55 e 8 µg/mL, respectivamente. Porém, foi superior ao do inibidor de tripsina urinária com a IC50 de 0,64 nM (Ogawa et al., 1987). Esses resultados indicam uma forte eficácia do EvCI em inibir a HNE em relação a outros inibidores na literatura.

Os experimentos de cinética indicam que EvCI inibe a HNE de modo competitivo. Resultados semelhantes foram encontrados para o inibidor isolado de plaquetas, Trombospondina (Hogg et al., 1993) e para o inibidor de HNE sintético Silvelestat (Hoshi et al., 2005).

O valor da constante de inibição (Ki) calculado para o EvCI foi de 2,4 nM que é superior ao inibidor isolado da larva Boophilus microplus (Tanaka et al., 1999) e a Elafina humana com Ki de 0,17 nM. Porém é inferior ao inibidor sintético Silvelestat (Sigma S7198) que apresenta um Ki de 200 nM, assim como o Elastatinal de origem bacteriana com Ki de 240 nM, demostrando uma alta afinidade do EvCI pela HNE em comparação com inibidores vendidos comercialmente, sendo o mesmo um forte candidado à produção de recombinantes.

A busca por compostos com atividade anti-elastásica desperta interesse devido à importância da ENH em uma série de doenças de caráter inflamatório. Doenças importantes como artrite reumatóide, SARS, fibrose cística, glomerulonefrite e sepse têm como grande pivô da lesão tecidual a enzima, liberada no meio extracelular sem uma correta regulação (Lackson et al., 2010; Okada et al, 1988; Siedle et al, 2003; Schrijver et al, 1989; Nakamura et al, 1992; Lee; Downey, 2001; Kawabata et al, 2002; Moraes et al, 2003; Hoshi et

al., 2005). Uma vez no meio extracelular, a elastase não vitima apenas o tecido adjacente a sua liberação, mas interage com uma gama de proteínas solúveis e aderidas a células locais ativas em várias vias fisiológicas (Steadman et al, 1993; Owen et al, 1997; Rao et al, 1991; Pipoly; Crouch, 1987; Starkey; Barret, 1976; Allen; Tracy, 1995; Turkington et al, 1991; Taylor et al, 1977; Orr et al, 1979). Um agravante nesse sentido está no fato do neutrófilo ser uma das primeiras células a serem recrutadas ao local da lesão e a elastase, sua enzima majoritária, liberada a grandes quantidades. Portanto, a inibição da HNE pode ser considerada um tratamento efetivo contra doenças relacionadas à disfunção da HNE (Hoshi et al., 2005). Tendo em vista que o EvCI possui uma grande afinidade e especificidade pela HNE (pois não inibiu catepsina G e inibiu brandamente a proteinase 3), esse inibidor é um candidato em potencial como agente antiinflamatório.

Com o intuito de averiguar o efeito do EvCI sobre a liberação de HNE, seguindo a metodologia descrita por Jonhansson e colaboradores (2001), neutrófilos humanos foram incubados, in vitro, com dois indutores bem conhecidos: o Fator indutor de Plaquetas (PAF), composto proveniente de vias endógenas, e N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), componente da parede celular bacteriana, e portanto indutor exógeno. O ensaio continha ainda um facilitador da exocitose de vesículas citoplasmáticas neutrofílicas, a citocalasina B.

O EvCI, numa concentração de 29,41 nM (0,5 µg/mL), inibiu em 70,5 % a via endógena (PAF) e em 59,2 % a via exógena (fMLP) após estimulação de neutrófilos pelos respectivos compostos. Esses resultados, bastante semelhantes em grau de inibição por fMLP e PAF, demonstraram que ambas as vias são afetadas. Estes resultados de inibição são superiores aos demonstrados por Fook et al. (2005), no qual o inibidor denominado ITT inibiu em 44.6% e 28,4% as vias de PAF e fMLP, respectivamente, utilizando cerca de 56 µg/mL do ITT. Já a fração rica em ApTI apresenetou 41,3 % de inibição para PAF e 68,5 % para fMLP (Araújo, R. R. O., 2010). O inibidor de tripsina de soja (SKTI) de demonstrou inibir ambas a vias com 83,1% e 70% de inibição para PAF e fMLP, respectivamente, com uma concentração de inibidor de 8 µg/mL (Ribeiro, 2010). A inibição das duas vias é comum para os inibidores de

ENH. Essa inibição pode ser devido à inibição direta da elastase, efeitos tóxicos do inibidor ao neutrófilo ou sua afinidade pelos receptores de PAF e fMLP ou outros receptores (Johansson et al, 2001) (figura 28).

Figura 28: Esquema ilustrativo do bioensaio com os indutos PAF e fMLP. Vários modos de ação do inibidor que pode ter efeitos estimulatórios e/ou inibitórios sobre a HNE. Fonte: Johansson et al, 2001.

Atualmente, a pesquisa por compostos sintéticos ou naturais que possuem ação inibitória para esses indutores, são uma ferramenta promissora no desenvolvimento de novos compostos antiinflamatórios representando uma das áreas de maior investimento da indústria farmacêutica a nível mundial.

Nos ensaios in vivo para indução da sepse, o modelo de cirurgia de ligadura e perfuração cecal (LPC) em camundongos (Benjamim et al. 2000) foi utilizado. Os animais submetidos ao modelo experimental de peritonite séptica induzida apresentaram sinais característicos de sepse nas primeiras horas após cirurgia, incluindo piloereção, letargia, exsudato ao longo dos olhos e do nariz, dilatação abdominal e leucocitose (acima de 12000/mm3). Esses resultados são compatíveis com os vários relatos da literatura (Júnior et al., 1998; Salkowski, Detore et al., 1998; Benjamim, Ferreira et al., 2000; Westphal, Freise et al., 2004).

A sepse está diretamente associada à morbidade e mortalidade. A taxa de complicações da síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) e

coagulação intravascular disseminada (CIVD) aumentam gradualmente em proporção à progressão da sepse (Rangel et al., 1995). Inflamação sistêmica induz à injúria endotelial vascular e resulta na disfunção de órgãos na sepse (McGill S. N., 1998; Rusell J. A., 2006), que está associada com a migração de leucócitos ativados da corrente sanguínea para os locais de inflamação (Geissmann et al., 2003). A interação entre leucócitos e células endoteliais resultante da inflamação sistêmica desempenha um importante papel na patogênese da injúria endotelial vascular (McGill S. N., 1998; Rusell J. A., 2006). A elastase neutrofílica humana (HNE), que possui ação em vários substratos (elastina, colágeno, fibronectina, laminina e proteoglicanos), pode assim contribuir para a injúria tecidual, levando a um aumento na permeabilidade vascular, vasodilatação e ativação da cascata de coagulação (Travis, 1988; Rusell, 2006). A elastase neutrofílica desempenha um papel importante na patogênese da CIVD (Slofstra et al., 2003). Na sepse, os níveis de antitrombina (AT) estão diminuídos como resultado do consumo secundário à geração contínua de trombina, diminuição da sua síntese juntamente com a degradação pela elastase liberada pelos leucócitos ativados (Levi; Van Der Poll, 2005). A HNE também pode clivar a trombomodulina resultando numa forma menos ativa dessa proteína (Takano et al, 1990; Liaw et al., 2004).

Neste trabalho, o EvCI demonstrou possuir características antiinflamatórias, por diminuir o número de células recrutadas para o local de inflamação em cerca de 87% utilizando 1,0 µg por cavidade peritoneal, provavelmente por inibir, de forma específica, a proteólise causada pela elastase leucocitária e/ou suprimir os níveis de citocinas pró-inflamatórias (Cao et al., 2010). Em adição o EvCI prolongou o tempo de coagulação através de ensaios in vitro especificamente pelo tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e inibiu o fator X ativado em 83%. Dessa forma, esse inibidor poderia atuar como um potencial fármaco com ação anticoagulante, agindo especificamente nos fatores de coagulação, diferentemente da heparina que age de modo inspecífico, assim como atuando na inibição da elastase neutrofílica, diminuindo seus efeitos pró-coagulantes. Inibidores de protease são amplamente utilizados no tratamento da sepse e CIVD como os inibidores

de elastase neutrofílica Ulinastatin (UTI) e o Sivelestat (Cao et al.; Hayakawa et al., 2010).

Contrariamente o EvCI não apresentou propriedades hemaglutinantes para eritrócitos humanos com ou sem tratamento enzimático. Troncoso e colaboradores (2002) isolaram um inibidor de tripsina da família Kunitz das sementes de Peltophorum dubium (PDTI) com propriedades tipo-lectina. Nesse mesmo estudo, o inibidor de tripsina de soja (SBTI) também apresentou atividade hemaglutinante. Por não apresentar esse tipo de atividade, o EvCI pode ser utilizado como ferramenta terapêutica.

Com relação ao efeito antiproliferativo sob células tumorais, o EvCI foi analisado contra linhagens de células HepG2. O EvCI inibiu a proliferação de células HepG2 com uma IC50 de 0,5 μg/mL. Essa inibição pode ser devido ao impedimento da adesão celular dependente da sequencia RGD ou inibição de proteases envolvidas na degradação de proteínas regulatórias de protooncogenes.

O EvCI não apresentou efeitos tóxicos e hemolíticos sobre populações celulares sanguíneas in vitro, mesmo com altas doses do inibidor, demonstrando que o mesmo pode atuar como um potencial agente bioativo contra doenças inflamatórias relacionadas a disfunção corporal, no controle da proteólise exacerbada pela elastase neutrofílica, assim como possível agente terapêutico alternativo ou complementar aos tratamentos convencionais como radioterapia e quimioterapia, as quais apresentam eficiência moderada e feitos colaterais. Estudos adicionais são necessários para confirmar a segurança deste inibidor como um agente farmacológico.

6. CONCLUSÃO

O inibidor de quimotripsina purificado de semente de E. velutina, denominado EvCI, com massa molecular de 17 kDa, apresentou elevado percentual de inibição para elastase neutrofilica (ENH). O EvCI foi capaz de inibir as vias de liberação de ENH endógena (PAF) e exógena (fMLP), em 75,6% e 65 %, respectivamente. A migração leucocitária em camundongos sépticos sofreu inibição de cerca de 87 % na presença do EvCI. Este inibidor também foi capaz de promover o prolongamento do tempo de coagulação com inibição do fator Xa. A análise do efeito citotóxico do EvCI sobre populações celulares do sangue total de indivíduos sadios mostrou a não toxicidade deste inibidor. EvCI apresentou um efeito antiproliferativo para linhagens de células HepG2 com IC50 de 0,5 µg /mL. Esses conjuntos de resultados tornam o EvCI um forte candidato para o estudo e desenvolvimento de drogas empregadas no tratamento de diversas condições fisiopatológicas, como por exemplo para a inibição de enzimas da coagulação, na inibição de HNE, diminuindo assim a mortalidade ocasionada pela sua ativação difusa devido à oclusão de vasos, que é uma consequência da deposição de fibrina na sepsemia, bem como também pode ser um composto promissor para o estudo de seu potencial como agente anticarcinogênico.