A β-glucuronidase mostrada neste trabalho foi purificada por métodos não cromatográfico e cromatográfico. O primeiro método, o fracionamento com concentrações crescentes de sulfato de amônio (50 - 80%), purificou 37,5 vezes a enzima com o rendimento de 87,7% de sua atividade. O segundo, a cromatografia em gel filtração (Bio-Gel A 1.5m) levou a um grau de purificação de 6.362,5 vezes, com uma atividade específica de 254,5 U e um rendimento de 35,6%. Estudos iniciais das frações F1 e F2, obtidos a partir do fracionamento com concentrações crescentes de sulfato de amônio, mostraram que ambas possuem endo- e exoglicosidases que atuam sobre glicosaminoglicanos sulfatados, essas atividades enzimáticas foram detectadas pelo desaparecimento metacromático em eletroforese em gel de agarose cujo produto foi também analisado por cromatografia em papel que comprovou a degradação total condroitim sulfato até seus respectivos monossacarídeos (dados não mostrados).
Visando fracionar as diferentes atividades glicosidásicas presente na fração F2, realizou-se uma cromatografia em gel filtração (Bio-Gel A 1.5m). As frações obtidas a partir desta, foram submetidas a ensaios com p-nitrofenis derivados de açúcar. A informação extraída destes experimentos foi de uma atividade β-glucuronidásica isolada das demais atividades testadas. Tal atividade foi vista nas primeiras frações da cromatografia, indicando ser uma glicosidase de alto peso molecular.
Tais frações permaneceram com atividade isolada após serem reunidas em um “pool” denominado de F3 e testadas com p-nitrofenis derivados. Esta foi então submetida a uma eletroforese em gel de poliacrilamida em SDS 12%, a fim de verificar
o grau de purificação, e ficou evidenciado o aparecimento de uma única banda protéica, com a massa molecular em cerca de 100 kDa, quando revelado em nitrato de prata. Um achado relevante, uma vez que é relatada na literatura, a freqüente presença de subunidades neste tipo de glicosidase (PEREIRA, 2001). No estágio embrionário do molusco Pomacea sp, duas formas enzimáticas de β-glucuronidase com pesos moleculares de 190 kDa e 240 kDa (PEREIRA, 2001). Em bactérias, as glicosidases possuem a massa molecular acima de 150 kDa (SCIGELOVA; CROUT, 1999). A mobilidade eletroforética de α-glucuronidase purificadas de Aspergillus niger,
Aureobasidium tubigensis e Trichoderma reesei tiveram peso molecular de 130 kDa,
107 kDa e 91 kDa, respectivamente (SIIKA-AHO et al., 1994; DE VRIES et al., 1998; UCHIDA et al., 1992). Em fungos, varia entre 11 a 150 kDa (SCIGELOVA; CROUT, 1999); em invertebrados, como Andara notabilis (LIRA FILHO et al, 2004), Srombus
goliath (ARAÚJO, 2002), Arthemia franciscana (AQUINO, 2004), glicosidases com
atividade N-acetil-hexosaminidásica possuem pesos moleculares de respectivamente 105 kDa, 80 kDa e 199 kDa. Possivelmente, as diferenças na medida das massas moleculares são resultantes de diferentes vias de glicosilação nos variados organismos. (WET; ZYL; PRIOR, 2005)
A pureza da β-glucuronidase foi corroborada quando a fração F3 foi submetida a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de fase reversa, onde foi visto o aparecimento de um único e simétrico pico protéico majoritário, eluído com 29 minutos de aplicação, em um percentual de 94,5% de acetonitrila.
A enzima foi purificada 6.362,5 vezes mostrando que os procedimentos utilizados para a purificação, tais como o fracionamento com sulfato de amônio e a cromatografia de gel filtração, foram de uma eficácia bastante acentuada quando comparado com as formas encontradas no estágio embrionário do molusco cujos índices de purificação são de 86,88 e 309,2 vezes para as glucuronidases do tipo I e II, respectivamente. O rendimento foi de 35,6%, tal resultado faz valer a eficácia da metodologia utilizada para a obtenção dessa proteína purificada, uma vez que os rendimentos obtidos das glucuronidases do tipo I e II extraídas da forma embrionária do molusco Pomacea sp foram respectivamente 9,8% e 8,8%.
Os testes cinéticos realizados com a β-glucuronidase permitiram que características consistentes fossem adquiridas desta enzima. O pH ótimo em que a enzima atua é 5,0, tendo sua atividade decaída bruscamente a partir do pH 6,0. Estes resultados sugerem que a β-glucuronidase do molusco Pomacea sp está presente nos lisossomos participando no catabolismo de oligossacarídeos. Tais enzimas possuem atividade ótima em pH levemente ácido, como por exemplo, a β- glucuronidases de Thermogota maritima, cuja faixa de pH na qual a enzima atua é de 4,5 – 7,5 (SALLEH et al., 2005). Têm-se ainda relatado atividade máxima medida em pH 5,0 e 6,0 para a α-glucuronidase de Aureobasilium pullulans (WET; ZYL; PRIOR, 2005) e entre 4,5 e 6,0 em fungos (SIIKA-AHO et al., 1994; DE VRIES et al., 1998; UCHIDA et al., 1992).
A temperatura ideal para a hidrólise do p-N-β-glucoronideo foi 65ºC, sendo então decaída a partir de 70ºC, mostrando-se uma enzima bastante termoestável. Esta característica tem sido comumente relatada nesta classe enzimas, como por exemplo,
65ºC em Aureobasidium pullulans, 60ºC em Aspergillus niger e 70ºC em
Aureobasidium tubigensis (WET; ZYL; PRIOR, 2005).
No estudo do tempo necessário para que a β-glucuronidase hidrolise o substrato p-N-β-glucuronídeo, foi visto que a partir de 2 horas de incubação, a atividade torna-se crescente, atingindo um platô a partir das 6 horas de incubação. Este resultado sugere uma baixa velocidade de reação, porém uma boa estabilidade da enzima.
A quantidade de β-glucuronidase ideal para a degradação total de 3mM de p-N- β-glucoronideo foi 1,2µg, com o Km aparente de valor 72 x 10-2
mM. As β- glucuronidases encontradas na embriogênese do molusco Pomacea sp, possuem um Km aparente de 84 x 10-2 mM na glucuronidase I e 27 x 10-2 mM na glucuronidase II. Valores de Km 22 x 10-2 mM e 16 x 10-2 mM foram encontrados para algumas formas de β-glucuronidases presente em fungos Kobayasia nipponica (TSUCHIHASHI et al., 1984)
Dentre os compostos testados para verificar-se suas influências sobre a atividade da β-glucuronidase, o único que aumentou a atividade foi o BaCl2 , e os que apresentaram interferência de modo negativo foram: HgCl2, Na2HPO4, CuSO4, NaCl, KCl, Na2SO4, sendo a atividade completamente nula na presença de SDS e NaH2PO4
Os estudos futuros sobre a estrutura tridimensional e a seqüência aminoacídica da proteína fornecerá mais subsídios para uma discussão mais aprimorada sobre a inibição e estímulo de tais compostos na atividade β-glucuronidásica.