5.2 REVISÃO DE LITERATURA... 205 5.3 MATERIAL E MÉTODO... 207 5.3.1 Animais... 207
5.3.2 Amostras de tecido tumoral... 208
5.3.3 Exame histopatológico e gradação tumoral... 209
5.3.4 Marcação imunoistoquímica... 209
5.3.5 Aquisição imunoistoquímica... de imagem e contagem da marcação 210 5.3.6 Obtenção dos escores e índices de marcação tumoral... 211 5.3.7 Avaliação da sobrevida... 213 5.3.8 Análise estatística 212 5.4 RESULTADOS... 214 5.5 DISCUSSÃO... 228 5.6 CONCLUSÃO... 230 REFERÊNCIAS... 232 6 CONCLUSÕES GERAIS... 234 REFERÊNCIAS... 235
Capítulo 1
Introdução:
Neoplasias mamárias caninas
e biomarcadores
1 INTRODUÇÃO – NEOPLASIAS MAMÁRIAS CANINAS E BIOMARCADORES
Nas últimas décadas, considerável investimento foi feito na detecção precoce do câncer. O aumento do número de casos de cânceres assintomáticos ou ainda em estágios pré-malignos pode ser atribuído aos programas de triagem mais eficientes e na mudança de práticas clínicas. O diagnóstico definitivo do câncer, no entanto, ainda se baseia no estudo histopatológico dos tumores (CHATTERJEE; ZETTER, 2005).
As neoplasias mamárias, como a maioria dos cânceres, são consideradas doenças genéticas em que mutações nas células somáticas ou nas linhagens germinativas estão envolvidas tanto na iniciação quanto na promoção e progressão.
O maior desafio para a compreensão da doença repousa, contudo, em sua complexidade, na medida em que as neoplasias se comportam como um conjunto de sistemas orgânicos determinados por aberrações gênicas, interações intercelulares, características individuais da paciente e influências ambientais.
Assim, ganham especial importância os estudos que propiciem a compreensão das alterações moleculares determinadas pelas modificações no genoma das células normais e que lhe conferem o fenótipo neoplásico. Estas alterações do material genético, que tanto podem envolver modificações diretas na sequência de bases do DNA, caracterizando as mutações como nos mecanismos epigenéticos de controle gênico, caracterizando as alterações epigenéticas, propiciam a formação de moléculas ou antígenos, os biomarcadores, produzidos pelo organismo ou pelo próprio tumor e que são passíveis de serem detectados por meio de técnicas como imunoistoquímica e PCR em tempo real, entre outras.
O uso mais comum dos biomarcadores está no diagnóstico precoce da doença, na detecção precoce de recidivas, na previsão da evolução clínica, bem como na seleção de terapias individualizadas, como por exemplo, a utilização de herceptina, um anticorpo monoclonal, em pacientes HER2 positivos (CHATTERJEE; ZETTER, 2005; HARRIS et al., 2007).
Também em Medicina Veterinária a busca por novos biomarcadores se justifica, na medida em que a participação dos cães na vida dos seres humanos têm se tornado marcante devido a urbanização das cidades e os desafios da vida moderna, tornando os cães verdadeiros membros das famílias. Esta proximidade, no
entanto, expõe esta espécie aos mesmos problemas e riscos a que são submetidos os seres humanos, como o contato com pesticidas e defensivos agrícolas, poluição ambiental e aos desreguladores endócrinos (PAOLONI; KHANNA, 2007; ANDRADE et al., 2010).
Tendo em vista o crescente interesse nos animais como sentinelas em relação ao câncer e no estudo das neoplasias mamárias caninas em busca de modelos translacionais, este trabalho buscou avaliar por meio da técnica de imunoistoquímica, a expressão de biomarcadores consagrados como de receptor de estrógeno alfa, receptor de progesterona, do proto-oncogene HER2 e do marcador de proliferação celular Ki67, na expectativa do estabelecimento de classificação em subtipos moleculares que possa melhor explicar o comportamento biológico heterogêneo observado em tumores comumente agrupados no mesmo tipo histológico.
Também o estudo de marcadores ainda incipientes em Medicina Veterinária, como os supressores de tumor BRCA1 e BRCA2, a busca por candidatos a novos marcadores como GATA3 e FGFR2, cuja utilização no diagnóstico das neoplasias mamárias é inédito em Medicina Veterinária, foram objetos deste estudo por meio da técnica de imunoistoquímica e de Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real, ou simplesmente qPCR. Neste estudo, buscou-se a correlação destes candidatos a marcadores ao tipo e grau histológico tumoral, à comparação de seu comportamento com biomarcadores conhecidos e sua capacidade prognóstica de sobrevida.
Finalmente, interessava conhecer o padrão de metilação global das neoplasias mamárias caninas, uma vez que as alterações do epigenoma são apontadas como uma das capacidades adquiridas que permitiriam à célula normal adquirir fenótipo neoplásico e que independem das alterações que afetam diretamente a sequência de bases do DNA. Assim, procedeu-se ao estudo imunoistoquímico da 5 metilcitidina, uma citosina metilada presente em regiões ricas deste nucleotídeo e que tem a importante função de permitir ou reprimir a expressão dos genes aos quais pertencem. Também este biomarcador foi confrontado com características clínicas dos tumores como estadiamento clínico, diagnóstico histopatológico e sua capacidade preditiva de evolução clínica da doença.
Restava saber, no entanto, se a população estudada, pertencente à região Metropolitana de Santos, sede do maior porto brasileiro e incriminado pelos índices elevados de poluentes ambientais presentes no solo e nos mananciais de água
desta região (ZAGO et al., 2005) apresentava comportamento diferenciado em relação à doença e a outras regiões brasileiras, o que a colocaria em destaque para estudos translacionais. Com este propósito, procedeu-se a estudo clínico- epidemiológico das fêmeas caninas atendidas pelo Hospital Veterinário da Universidade Metropolitana de Santos.
Este trabalho teve, portanto, o objetivo geral de estudar algumas das alterações genéticas e epigenéticas presentes nas neoplasias mamárias de fêmeas caninas, correlacionando o comportamento de marcadores tumorais associados a estas alterações e seu valor prognóstico de sobrevida. Para cumprir com estes objetivos realizamos quatro estudos organizados em capítulos, os quais serão apresentados a seguir.