Vekst, metabolisme og ølbrygging med melkesyrebakterier og gjær

Masteroppgave 2017 60 stp

Fakultet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap

Vekst, metabolisme og ølbrygging med melkesyrebakterier og gjær

Growth, metabolism and beer brewing with lactic acid bacteria and yeast

Guro Kvam

Matvitenskap – produksjon og utvikling

I

II

Forord.

Denne oppgaven er skrevet som en avsluttende del av mastergradsstudiet Matvitenskap ved Fakultetet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap på Norges miljø- og biovitenskapelige universitet (NMBU). Oppgaven utgjør 60 studiepoeng og er gjennomført høst 2016 og vår 2017. Arbeidet med oppgaven har vært tidkrevende med mye laboratoriearbeid og lange dager, men også veldig interessant og givende.

Jeg vil gjerne benytte anledningen til å takke alle som har bidratt til å gjøre denne oppgaven mulig. I første omgang vil jeg rette en stor takk til min hovedveileder førsteamanuensis Hilde Marit Østlie for god veiledning og tilbakemelding underveis. I tillegg vil jeg takke biveileder professor Trude Wicklund og stipendiat Anna Dysvik for veiledning vedrørende ølbrygging og pilotbryggeriet ved KBM.

I tillegg vil jeg takke professor Anne Kjersti Uhlen ved IPV for samarbeidet med Graminor ved innhenting av kornprøver. Jeg vil også rette en stor takk til overingeniør Kari Olsen og postdoktor Davide Porcellato for bearbeiding av prøver og resultater. Jeg ønsker også å takke overingeniør Zhian Salehian for mye hjelp med molekylærbiologiske teknikker.

Jeg vil også rette en oppmerksomhet til May, Ahmed og Kari på laboratoriet for all praktisk hjelp og ikke minst kaffe, kake og hyggelige samtaler i en stressende hverdag. Til slutt vil jeg takke min samboer, Anders for all din støtte og tålmodighet.

Tusen takk til dere alle!

Norges miljø- og biovitenskapelige universitet Fakultet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap

Ås, 12 mai 2017

Guro Kvam

III

Sammendrag.

Ølbrygging er et håndverk forbundet med lange tradisjoner, med røtter tilbake til det 12.

århundrets Europa. Før dagens mikrobiologiske teknikker ble oppfunnet var all øl spontangjæret med en kompleks sammensetning av ulike gjær- og bakteriestammer. I dag produseres fremdeles enkelte av disse ølsortene under navn som lambic, geuze eller Berliner weisse, og interessen for slike ølsorter har økt betraktelig de siste årene. Mange bryggerier benytter i dag kjente kulturer av gjær og melkesyrebakterier (MSB) i fermenteringen av moderne surøl.

I denne oppgaven ble det mikrobiologiske mangfoldet på kornprøver undersøkt før og etter støping og germinering. Det ble undersøkt for likheter og forskjeller mellom tre byggsorter etter innhøsting fra fire ulike dyrkingssteder i Norge. Fra spiret korn ble MSB isolert og identifisert før enkelte stammer ble undersøkt nærmere i vekst- og metabolismeforsøk både som renkulturer og i blandingskulturer med gjærstammene Saccharomyces cervisiae og Brettanomyces bruxellensis.Det ble benyttet tradisjonelle fenotype metoder og molekylære teknikker som 16S rRNA sekvensering og Illumina MiSeq totalsekvensering for å undersøke og kartlegge mikrobiell diversitet på kornet.Videre ble det brygget en surøl-variant fermentert med nevnte gjær- og melkesyrebakteriestammer.

Den mikrobiologiske analysen av kornet viste at klimatiske forhold kan ha påvirket mikrofloraen i noen grad mens kornsort ikke hadde innvirkning på mikrofloraen. Før germinering ble det påvist en stor andel Enterobacteriaceae, mens andelen MSB økte som følge av germineringen. Lagerassosiert sopp ble ikke registrert på kornet, mens feltsopp i tillegg til Tremellales var dominerende både før og etter spiring. Kornprøvene ble spiret i 46- 72 timer og et klart overtall av Leuconostoc ssp. ble isolert. Til vekstforsøk ble en stamme av Carnobacterium maltaromaticum og en stamme av Lactococcus lactis ssp. lactis valgt ut. I tillegg ble en stamme av Lactobacillus plantaum og en stamme av Lactobacillus brevis valgt ut fra KBMs stammekolleksjon.

I vekstforsøk produserte C. maltaromaticum noe melkesyre (500 ppm) og etanol (56 ppm) i tillegg til store mengder acetoin (81 ppm), diacetyl (0,51 ppm) og enkelte aldehyder. Stammen ble ikke inkludert i surøl-poduksjon på grunn av diacetylproduksjon. De resterende MSB dannet mye melkesyre (1874-3970 ppm) og eddiksyre (16-290 ppm) men bidro i mindre grad til produksjon av flyktige komponenter. Melkesyrebakteriene påvirket ølet i hovedsak med et syrlig og friskt preg. Gjærstammene omformet acetoin og diacetyl produsert av MSB til 2,3- butandiol som påvirker smaken på øl i mindre grad. Gjærstammen B. bruxellensis vokste saktere enn S. cerevisiae men produserte tilsvarende mengder av flyktige komponenter i pilotbrygget surøl.

IV

Abstract.

Beer brewing is a traditional craft dating back to the 12. century in Europe. Prior to the microbiological techniques we have today, all beer was spontaneously fermented with a complex diversity of yeast and bacteria strains. Some of these beer varieties are still being produced today, under names like lambic, geuze or Berliner weisse, and the popularity of sour beer have escalated in recent years. Many breweries use known strains of yeast and lactic acid bacteria (LAB) in the fermentation process of modern sour beer.

In this thesis, the microbiological diversity on barley grains were studied before and after germination of the grains. Similarities and differences between three barley cultivars harvested at four places in Norway were investigated. LAB was isolated and identified from germinated grains before some strains were studied further in growth and metabolism studies either as pure cultures or as mixed cultures with the yeast strains Saccharomyces cervisiae and Brettanomyces bruxellensis. Traditional microbiological and molecular biological methods like 16S rRNA sequencing and Illumina MiSeq massive parallel sequencing were used to study the microbial diversity on the grains. Further on, a variant of sour beer was fermented using the mentioned strains of yeast and LAB.

The microbial analysis showed that the microflora on the grains may have been influenced by climate to some degree, while the microflora did not wary between the barley cultivars. Before germination, there were detected a large share of Enterobacteriaceae on the grains, while the share of LAB increased during germination. Storage associated fungi were not detected on the grains while field fungi in addition to Tremellales dominated the microflora before and after germination. After 46-72 hours of germination Leuconostoc ssp. was the most abundant LAB isolated. One strain of Carnobacterium maltaromaticum and one strain of Lactococcus lactis ssp. lactis were selected for the study of growth and metabolism, in addition to one strain of Lactobacillus plantaum and one strain of Lactobacillus brevis selected from KBMs strain collection.

The C. maltaromaticum strain produced some lactic acid (500 ppm), some ethanol (56 ppm) and large amounts of acetoin (81 ppm), diacetyl (0,51 ppm) and certain aldehydes in the growth and metabolism studies. The strain was not included in the production of sour beer due to diacetyl production. The remaining LAB produced large amounts of lactic acid (1874-3970 ppm) and acetic acid (16-290 ppm) but they did not produce notable amounts of volatile compounds. The LAB strains contribution to the beer were mainly an acetic and fresh taste.

The yeast strains metabolised acetoin and diacetyl produced by LAB to 2,3-butanediol, which does not affect beer taste to the same extent. The yeast strain B. bruxellensis grew slower than S. cerevisiae but produced equivalent amounts of volatile compounds in sour beer.

V

Innhold

1. Innledning. ... 1

2. Teori. ... 2

2.1. Melkesyrebakterier. ... 2

2.1.1. Funksjonelle egenskaper hos melkesyrebakterier. ... 2

2.2. Fenotypisk identifisering av mikroorganismer. ... 7

2.3. Genotypisk identifisering ... 8

2.3.1. 16S-rRNA-sekvensering. ... 9

2.3.2. Totalsekvensering av mikrober. ... 12

2.4. Ølbrygging. ... 12

2.4.1. Malting. ... 13

2.4.2. Mesking. ... 15

2.4.3. Vørterkoking. ... 16

2.4.4. Fermentering. ... 17

2.4.5. Bi-produkter av fermenteringen. ... 18

2.5. Mikrober og metabolitter i kommersielt surøl. ... 21

2.6. Hensikt med oppgaven. ... 22

3. Materialer og metoder. ... 23

3.1. Innhenting av kornprøver. ... 23

3.2. Malting ... 23

3.3. Mikribiologisk analyse av kornprøver. ... 23

3.4. Isolering av melkesyrebakterier. ... 25

3.4.1. Katalase-test og Gram-farging. ... 25

3.5. Genotyping. ... 25

3.5.1. 16S-rRNA-sekvensering. ... 26

3.5.2. Polymerasekjedereaksjon (PCR). ... 26

3.5.3. Agarosegelelektroforese og rensing av PCR-produkt. ... 28

3.5.4. Sanger-sekvensering. ... 28

3.5.5. Totalsekvensering av mikrober på kornprøver. ... 28

3.6. Vekst- og metabolismeforsøk. ... 29

3.6.1. Innledende vekstforsøk. ... 30

3.6.2. Stock-løsning. ... 31

3.6.3. Vørtertillaging. ... 31

3.6.4. Vekstforsøk i vørter. ... 32

3.6.5. Måling av CO2. ... 33

3.6.6. Celletall. ... 33

VI

3.6.7. HSGC. ... 33

3.6.8. HPLC. ... 35

3.7. Ølbrygging. ... 36

4. Resultater. ... 38

4.1. Mikrobiologisk analyse av kornprøver. ... 38

4.1.1. Spiregrad i kornprøver etter germinering. ... 40

4.2. Rendyrking og identifisering av melkesyrebakterier. ... 40

4.3. Totalsekvenseing av mikrober. ... 42

4.3.1. Sopp. ... 44

4.3.2. Bakterier. ... 45

4.4. Vekst- og metabolismeforsøk. ... 47

4.4.1. Innledende vekstforsøk. ... 47

4.4.2. pH i vekstforsøk. ... 47

4.4.3. Cellevekst i vekstforsøk. ... 48

4.4.4. CO2-produksjon i vekstforsøk. ... 50

4.4.5. Karbohydrater og organiske syrer i vekstforsøk. ... 50

4.4.6. Flyktige komponenter i vekstforsøk... 54

4.5. Analyse av ferdig øl. ... 57

5. Diskusjon. ... 61

5.1. Mikrobiologisk analyse av kornprøver. ... 61

5.2. Vekstforsøk. ... 63

5.2.1. Renkulturer av MSB ... 63

5.2.2. Renkulturer av gjær og blandingskulturer av gjær og MSB. ... 65

5.3. Analyse av ferdig pilotbrygget øl. ... 68

6. Oppsummering og konklusjon. ... 70

6.1. Videre arbeid. ... 71

7. Referanser... 72

I. Omregningstabell for innhold av løselig sukker (Brix), °Plato og “Spesific gravity” (SG). ... 75

II. Konsentrasjon og podevolum i vekstforsøk. ... 76

III. Omregning av α-syreinnhold i humle til bitterhet i øl. ... 77

IV. Konsentrasjon og podevolum i ølbrygging. ... 78

V. Kalibreringskurve for beregning av CO2-innhold. ... 80

VI. Resultater fra 16S-rRNA-sekvensering... 81

VII. Rådata fra vekstforsøk. ... 82

VIII.Analyse av ferdig øl. ... 95

IX. Rådata totalsekvensering. ... 97

1

1. Innledning.

Det antas at mennesker har brygget øl siden de begynte å dyrke og lagre korn. Gjennom tidene har øl vært ansett som trygt å drikke og en god måte å konservere kornet på. Det første beviset man har på kommersiell ølbrygging er en tegning av et bryggeri som ble funnet i klosteret Saint Gall i Sveits og datert til år 820. Frem til 1100-tallet var det kun klostre som brygget øl i kommersiell skala, men senere vokste bryggerinæringen i takt med den urbane utviklingen og oppblomstring av puber og vertshus. I 1487 ble den originale renhetsloven “Reinheitsgebot”

utviklet i Tyskland for å unngå at hvete eller rug ble brukt i øl og på den måten opprettholde lave brødpriser. Loven sa at øl kun skulle bestå av bygg, vann og humle. I 1516 ble også gjær inkludert (Pires & Brányik 2015). I Norge ble loven opphevet i 1994 fordi den kunne ansees som en handelshindring i strid med EUs vedtekter. Dette førte til en endring i både bryggerinæringen og import av øl og råfrukt-øl. De større bryggeriene i Norge følger fremdeles renhetsloven på frivillig basis (Renhetloven 2012).

De første øl-sortene som ble brygget ble hverken tilsatt humle eller rendyrkede gjærkulturer, og syrnet derfor etter få dager eller uker. Senere ble ølet lagret på eikefat og gjæringen ble kontrollert ved å blande ferdig gjæret og modnet øl i ferskt øl (Tonsmeire 2014). Dette gav en variert mikroflora av ulike gjærstammer, melkesyrebakterier og eddiksyrebakterier (Spitaels et al. 2015b). I dag produseres fremdeles denne typen øl i Tyskland og Belgia under navn som lambic, geuze og Berliner weisse. Disse sortene og denne teknikken har overlevd til tross for at rendyrking av gjærstammer ble vanlig. De fleste bryggeriene dyrket også opp egne stammer av “husgjær”. Gjennom de senere årene har interessen for ølbrygging generelt og for unike ølsorter spesielt økt betraktelig. Stadig flere mikrobryggerier brygger både spontangjæret øl og ølsorter der ulike gjær- og bakteriekulturer blandes. En fellesbetegnelse for disse sortene kalles

“surøl”. I tillegg til tradisjonell spontangjæring er det utviklet ulike teknikker for å produsere surøl; gjær og melkesyrebakterier kan tilsettes vørteren samtidig, vørteren kan syrnes en tid før gjær tilsettes slik at bakterier og gjær vokser parallelt, ellers kan vørteren syrnes før den pasteuriseres og tilsettes gjær. Fermentering med gjær og bakterier parallelt krever en fermenteringsprosess på et til tre år før tapping på flasker (Tonsmeire 2014).

2

2. Teori.

2.1. Melkesyrebakterier.

Melkesyrebakterier (MSB) defineres gjerne som Gram-positive, katalase-negative, ikke- sporedannende kokker eller staver med melkesyre som hovedfermenteringsprodukt fra karbohydrater. De er også ubevegelige og mikroaerofile. Bakteriene assosieres ofte med næringsrike habitater som for eksempel melk, planter og kjøtt, men enkelte slekter og arter er også viktige for fordøyelsessystemet hos pattedyr. Det er altså stor variasjon mellom MSB.

Inndelingen av bakteriene i slekter baseres på ulikheter i morfologi, glukosefermenteringsmønster, vekst ved ulike temperaturer og saltkonsentrasjoner, konfigurasjon av melkesyre og syre- og base-toleranse (Salminen et al. 2004). Grunnlaget for den systematiske klassifiseringen av melkesyrebakterier ble først utarbeidet av Orla-Jensen og publisert i 1919. Av de 16 MSB-slektene assosieres 12 slekter med mat (Narvhus & Axelsson 2003). Disse slektene og deres generelle egenskaper er presentert i Tabell 1.

2.1.1. Funksjonelle egenskaper hos melkesyrebakterier.

Taksanomisk klassifisering av MSB viser at de hører til rekken Firmicutes, klassen Bacilli og ordenen Lactobacillales. De deles inn i familiene Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lacobacillaceae, Leuconostocaceae og Streptococcaceae (Von Wright &

Axelsson 2012). Som vist i Tabell 1 er slektene i familien Leuconostocaecae (Weissella og Leuconostoc) og enkelte arter av Lactobacillus (Lactobacillus brevis, Lb. buchneri, Lb.

fermentum og Lb. reuteri) obligat heterofermentative og kan omdanne glukose til CO2, etanol og acetat i tillegg til melkesyre gjennom reaksjonsveien pentose fosfoketolase-sporet. De resterende slektene i tabellen, unntatt Lactobacillus er obligat homofermentative og produserer kun melkesyre fra glukose gjennom glykolysen. Tabellen viser også hvorvidt de ulike slektene kan vokse ved ulike temperaturer (10°C og 45°C) og i sure (pH 4,4) eller basiske (pH 9,6) miljøer. Vørter holder gjerne en pH på omtrent 5,5 etter mesking og vekst i sure miljøer er derfor mest relevant (Bokulich & Bamforth 2013). Mange av slektene inkluderer både syretolerante og mindre syretolerante arter. Ifølge Zhang og Cai (2014) har alle slektene et vekstoptimum ved pH 5,5-6,2 og vil derfor kunne produsere melkesyre i vørter.

3

Tabell 1: Generelle egenskaper for de ulike slektene av melkesyrebakterier (Von Wright & Axelsson 2012).

Familie Slekt Form CO2 fra

glucose

Vekst ved 10°C

Vekst ved 45°C

Vekst i 6,5% NaCl

Vekst i 18%

NaCl

Vekst ved pH 4,4

Vekst ved pH

9,6

Melkesyre konfigurasjon Aerococcaceae Aerococcus Kokk

(tetrad)

- + - + - - + L

Carnobacteriaceae Carnobacterium Stav - + - Nd^b - Nd^b - L

Enterococcaceae Enterococcus Kokk - + + + - + + L

Tetragenococcus Kokk (tetrad)

+ - + + Variabel +

Vagococcus Kokk - + - - - Variabel - L

Lactobacillaceae Lactobacillus Stav Variabel Variabel Variabel Variabel - Variabel - D, L, DL Pediococcus Kokk

(tetrad)

- Variabel Variabel Variabel - + - L, DL

Leuconostocaecae Leuconostoc Kokk^c + + - Variabel - Variabel - D

Weissella Kokk^ac + + - Variabel - Variabel - D, LD

Oenococcus Kokk^c + + - Variabel - Variabel - D

Streptococcaceae Lactococcus^b Kokk - + - - - Variabel - L

Streptococcus Kokk - - Variabel - - - - L

a Enkelte Weissella er stavformet.

b Nd; ikke bestemt.

c Kan også være ovale.

4 Tabellen viser også at det er varierende vekst ved 10°C og 45°C blant Lactobacillus, Pediococcus og Streptococcus. Enterococcus vokser ved både 10°C og 45°C, mens Aerococcus, Carnobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus og Lactococcus vokser ved 10°C.

Øl fermenteres ved enten 12°C eller 18-20°C (Palmer 2006) og syrning parallelt med primærfermentering er derfor mulig med de fleste stammene. Dersom vørteren syrnes før gjæring kan temperaturen kontrolleres i større grad i forhold til bakteriearten. Ifølge Tonsmeire (2014) kan det være nyttig å lage en vørter med mye dekstriner i surølproduksjon. De halvlange sukkerkjedene er for lange til at bryggegjær kan nyttiggjøre seg av dem, samtidig som de er korte nok for andre mikrober. Mesking ved lav temperatur (≤ 60°C) gir høyere enzymaktivitet av α-amylase og dermed mer dekstriner.

Alternative reaksjonsveier for metabolisme av pyruvat for MSB er illustrert i Figur 1.

Melkesyrebakteriene kan konvertere glukose til pyruvat og videre til metabolittene som er ringet rundt i figuren. Diacetyl og acetoin er aromastoffer som ofte dannes av Leuconostoc og meierirelaterte laktokokker ved omsetning av sitrat i melk via pyruvat (Von Wright & Axelsson 2012). Kieronczyk et al. (2004) undersøkte aminosyreomsetning i Lactobacillus og konkluderte med at diacetyl også kan dannes fra aspartat. Diacetyl gir en smøraktig aroma og er derfor ofte uønsket i ølproduksjon. Ved aerobe forhold eller begrenset næringstilgang kan MSB danne maursyre og acetyl-Coenzym A. Acetyl-CoA kan videre fungere som elektronakseptor og gi etanol eller fosforiseres og gi acetat i tillegg til syntese av ATP (Von Wright & Axelsson 2012).

5

Figur 1: Reaksjonsveier for metabolisme av pyruvat. Stiplet linje indikerer ikke-enzymatisk reaksjon.

Enzymatiske reaksjoner er nummerert: 1. diacetylsyntase, 2. acetolaktat syntase, 3. pyruvat-format lyase, 4. pyruvat dehydrogenase, 5. pyruvat oksydase, 6. acetat kinase (Von Wright & Axelsson 2012).

Slekten Lactobasillus inkluderer mange arter (>60) med stor variasjon og inndeles derfor i 3 hovedgrupper: Gruppe I obligat homofermentative, gruppe II fakultativt heterofermentative og gruppe III obligat heterofermentative (Lahtinen et al. 2012). Laktobasillene Lb. plantarum (gruppe II) og Lb. brevis (gruppe III) er viktige i fermentering av planteprodukter og spesielt i produksjonen av surfôr. De er meget syretolerante sammenlignet med andre melkesyrebakterier, og vokser gjerne sent i fermenteringsprosessen (Adams & Moss 2008).

Paucean et al. (2013) undersøkte karbohydratmetabolismen til Lb. plantarum i surdeig med og uten tilsetting av Saccharomyces cerevisiae. De konkluderte med at Lb. plantarum omdannet maltose til melkesyre, CO2, etanol og acetat gjennom fosfoketolase-sporet. I tillegg ble flyktige komponenter kartlagt ved hjelp av gass-kromatografi (GC-MS) hvor det ble dannet alkoholer (etanol, 2-methyl-1-propanol, 3-methyl-1-butanol, 2-metyl-1-butanol og 1-hexanol) og karbonylderivater (2-metylpropanal, 2,3-butandion, 3-metylbutanal, 2-metylbutanal, hexanal og benzenacetaldehyd) i forholdet 14:1. I surdeigen med S. cerevisiae ble det dannet omtrent 100 ganger mer 3-metylacetat, 20 ganger mer 2,3-butandion og fem ganger mer etanol enn i surdeigen med Lb. plantarum.

6 Arter av Leuconostoc er viktige tidlig i fermenteringsprosessen av grønnsaker som kimchi eller sauerkraut. De tar over for den første, i hovedsak Gram-negative mikrofloraen og er med på å utvikle den karakteristiske smakssammensetningen i ferdige produkter. Mange av artene produserer ekstracellulære polysakkarider (EPS) som kan være ønskelig i enkelte produkter der de brukes som fortykningsmidler, men ansees som et problem i andre produkter. De produserer diacetyl og acetat fra sitrat og kan redusere acetaldehyd til etanol (Narvhus &

Axelsson 2003).

Pediokokker er mye brukt i fermentert mat, ofte som en starterkultur men også på grunn av probiotiske egenskaper. Samtidig kan de også opptre som ødeleggende i enkelte matvarer.

Ifølge Martino et al. (2013) er pediokokkene uønsket i vin og øl fordi de ofte produserer EPS, eddiksyre, aminer og diacetyl.

Arter av Lactococcus er ekstremt viktige i meieriindustrien, og inngår i flere kommersielle starterkulturer for produksjon av fermentert melk, rømme og ost. Lactococcus lactis ansees som den kommersielt viktigste. Lc. lacits har to underarter; cremoris og lactis der lactis oftest isoleres fra miljøer utenfor meieriet (Narvhus & Axelsson 2003).

Bakterier tilhørende slekten Weissella kan isoleres fra mange ulike fermenterte matvarer, som kimchi, fermentert fisk og surdeig, men opphavet til bakterien er fremdeles usikkert. Derimot er det kjent at Weissella confusa metaboliserer karbohydrater gjennom fosfoketolasesporet, og danner syre fra maltose, ribose og sukrose men ikke fra trehalose (Zhang & Cai 2014).

Slekten Carnobacterium ble tidligere beskrevet som en atypisk laktobasill som ikke kunne vokse på acetat agar. Den ble først isolert fra vakuumpakket kjøtt. Slekten består av arter med varierende egenskaper der Carnobacterium maltaromaticum oftest isoleres fra mat (Zhang &

Cai 2014). Afzal et al. (2010) utførte en omfattende studie av C. maltaromaticum der det ble konkludert med at arten er høyst interessant i forhold til meieriteknologi fordi den kan vokse i ost under modning uten å påvirke starterkulturen hvor den syntetiserer ulike

7

smakskomponenter inkludert 3-metylbutanal. Videre hemmer den humanpatogene bakterier som Listeria monocytogenes ved produksjon av bakteriosiner og den har aldri vært assosiert med sykdom hos mennesker.

2.2. Fenotypisk identifisering av mikroorganismer.

Identifikasjon ved hjelp av fenotyping er en billig og enkel metode med lav brukerterskel.

Derimot kan den gi dårlig reproduserbarhet og krever god logistikk i forhold til større forsøk, samt at fenotype metoder har lav taksonomisk oppløselighet. Oppdyrking og rendyrking tar ofte tid og krever en del vedlikehold av kulturen.

En fenotypisk identifiseringsmetode for å skille mellom bakteriestammer er katalase-test.

Oksygen er giftig for anaerobe organismer, men grunnen til dette er ikke at oksygen i seg selv er reaktivt og påvirker strukturer og funksjoner i cellen. Derimot reagerer oksygen med svært reduserte stoffer som dannes i løpet av metabolismen hos organismene. Det dannes også kationer av kopper eller jern som fungerer som katalysatorer i reaksjonen som danner hydrogenperoksid (H2O2). Aerobe og fakultativt aerobe organismer kvitter seg med oksygenforbindelsene ved å produsere blant annet enzymet katalase, som spalter H2O2 til vann og oksygen. MSB er aerotolerante anaerobe og mangler enzymet (Holland et al. 2013). Derfor kan det utføres en katalase-test for å bestemme om en renkultur av bakterier kan produsere katalase eller ikke. Testen utføres ved at kulturmateriale løses i H2O2. Dersom bakterien er katalase-positiv kan gassdannelse observeres når O2 frigjøres.

Gramfarging er en utbredt metode som brukes for å skille mellom bakterier basert på oppbygning av celleveggen. Metoden, som ble beskrevet av Christian Gram og først publisert i 1884 gjør at man enkelt og raskt kan skille mellom Gram+ og Gram- bakterier. Celleveggen til Gram+ celler inneholder omtrent 90 % peptidoglykan fordelt på opptil 25 peptidoglykon- lag. Den Gram- celleveggen inneholder derimot 10 % peptidoglykan, i tillegg til et tykkere lag av lipopolysakkarid, som vist i Figur 2 (Madigan et al. 1997).

8 Figur 2: Skjematisk fremstilling av celleveggens oppbygning hos (a) gram-positive og (b) gram- negative bakterieceller (Madigan et al. 1997).

Gramfargingsmetoden går ut på at fikserte preparater av bakteriekulturer farges med krystallfiolett og jod-løsning før de skylles med etanol. Cellene farges blå med krystallfiolett og det dannes store vannuløselige fargekomplekser etter behandling med jod-løsningen.

Skylling med etanol gir en dehydrering av celleveggen hos Gram+ på grunn av lite lipider tilstede. Fargekompleksene kommer dermed ikke ut av cellene og de forblir blå. Hos Gram- medfører skylling med etanol at lipidene og fargekompleksene i celleveggen og -membranen løses opp. Deretter kontrastfarges preparatene med safranin, slik at Gram- bakterier fremstår som rosa mens Gram+ forblir blå (Madigan et al. 1997). Melkesyrebakterier er Gram+ og katalase-negative, og en katalasetest og en Gramfarging vil derfor gi en god indikasjon på om renkulturen består av melkesyrebakterier.

2.3. Genotypisk identifisering

Til forskjell fra fenotypiske metoder er genotyping basert på DNA og hovedsakelig bruk av polymerase kjedereaksjon (PCR) for identifisering på slekts-, arts- og stammenivå. Metodene har god reproduserbarhet, er raske og gir pålitelige resultater, men er arbeids- og utstyrskrevende. Mange av metodene sammenligner nukleotidsekvenser med kjente sekvenser i en database.

9

2.3.1. 16S-rRNA-sekvensering.

2.3.1.1. Polymerase-kjedereaksjon (PCR).

PCR er en effektiv metode for å amplifisere spesifikke segmenter av et genom. Metoden har vært banebrytende innen genforskning og benyttes mye i dag. DNA-syntesen utføres ved at isolert DNA tilsettes enzymet DNA polymerase, deoksynukleotider, en buffer og to primere der én går fremover (F) og den andre i revers (R). Ved å heve og senke temperaturen åpner DNA-tråden seg slik at primerne kan feste seg og polymerasen syntetiserer DNA ved å binde deoksynukleotider til hver DNA-tråd (Watson et al. 2014). Trinnene i prosessen er vist i Figur 3.

Figur 3: Skjematisk fremstilling av polymerase kjedereaksjonen; dobbelttrådet DNA denaturerer, primere fester seg og DNA polymerase syntetiserer DNA i 5’-3’-retning (Watson et al. 2014).

Figuren viser hvordan dobbelttrådet DNA denaturerer ved oppvarming slik at primerne kan feste seg på enkelttrådene. Temperaturen senkes og de to primerne fester seg på 5’-enden av

10 hver sin templattråd og initierer DNA-kopiering i retning mot 3’-enden. Primer-sekvensen er spesifikk og fester seg på et bestemt sted i genomet slik at en gitt sekvens kopieres. DNA polymerase fester nukleotider (dGTP, dATP, dTTP og dCTP) til DNA-trådene. Etter polymeriseringen står man igjen med to dobbelttråder som er identiske med den opprinnelige DNA-tråden (Watson et al. 2014). Syklusen med denaturering, festing av primere («annealing») og polymerisering gjentas mellom 20 og 30 ganger for å sikre høy konsentrasjon av den ønskede gensekvensen.

2.3.1.2. Agarosegelelektroforese.

For å undersøke om PCRen har fungert kan det utføres en agarosegelelektroforese, der DNA- fragmentene i PCR-produktet separeres etter størrelse og synliggjøres på en gel. DNA er negativt ladet og vandrer mot den positive polen i et elektrisk felt. Vandringen i gelen påvirkes av størrelsen på PCR produktet, hvor store PCR-produkt vandrer kortest og små PCR-produkt vandrer lengst. Størrelsen på DNAet sammenlignes med en molekylvektstandard, også kalt

“ladder” som inneholder fragmenter med kjent størrelse, som vist i Figur 4.

Figur 4: 1kb DNA molekylvektstandard (“ladder”) farget med etidiumbromid og satt på en 0,8%

agarosegel (New England Biolabs).

Figuren viser at styrken på båndene korrelerer med mengde (ng) DNA i fragmentet. Båndet på 3,0 kb er sterkere enn de andre og fungerer som en referanse når PCR-produktet sammenlignes med standarden. Dersom PCR-reaksjonen har gått som den skal vil løsningen inneholde store

11

mengder fragmenter i en gitt størrelse og små mengder av fragmenter i andre størrelser (New England Biolabs). En vellykket PCR gir derfor et sterkt bånd med “kjent” størrelse.

Amplifisering av 16S-rRNA-genet gir fragmenter på 1,5kb.

2.3.1.3. Sangersekvensering.

Sekvensanalyse baserer seg på amplifisering av DNA med samme prinsipp som PCR, men med bruk av kjede-terminerende nukleotider. DNA kopieres da fra en templattråd med en fiksert primer som startsted. DNA polymerase bruker 2’-deonukleotid trifosfat (dNTP) som byggesteiner for syntese i 5’→3’-retning. De kjede-terminerende nukleotidene 2’,3’- dioksynukleotid trifosfat (ddNTP) mangler 3’-hydroxygruppen, som vist av strukturformelen i Figur 5. Den manglende OH-gruppen hindrer nye nukleotider fra å feste seg i 3’-enden av tråden, og syntesen avbrytes (Watson et al. 2014).

Figur 5: Til venstre; 2’-deoxy ATP kan inkorporeres i en DNA-tråd slik at nye nukleotider kan feste seg videre i tråden. Til høyre: 2’-,3’-dideoxy ATP kan inkorporeres i en DNA-tråd og blokkerer videre vekst av tråden (Watson et al. 2014).

I en reaksjonsblanding som brukes til amplifisering av DNA for sekvensering tilsettes både dNTPer og ddNTPer i forholdet 100:1. På grunn av de terminerende nukleotidene inneholder PCR-produktet fragmenter av ulike lengder. Når ende-ddNTPene merkes med ulike fluoriserende farger kan posisjonene til nukleotidene bestemmes ut fra lengden på fragmentene.

Sekvensene med ulike lengder blir separert i en kapillærgelelektroforesekolonne med polyakrylamid gel, laserdetektert og satt sammen til en sekvens, som vist i Figur 6 (Watson et al. 2014).

12 Figur 6: Utsnitt av en DNA-sekvens fremstilt ved Sangersekvensering; eksempel på en god sekvens (venstre) og en dårlig sekvens (høyre) (Hall 1999).

Figuren viser to utsnitt fra samme sekvens. Basepar 650 til 680 er en god sekvens mens basepar 1350 til omtrent 1380 er en dårlig lesbar sekvens. Dårlige deler av sekvensen ligger oftest i begynnelsen og slutten av sekvensen og kan enkelt fjernes ved hjelp av dataprogrammer som BioEdit Sequence Aligment Editor^® (Hall 1999). Deretter konverteres sekvensen til et tekst- basert format (FASTA-format) og søkes opp i databaser med kjente sekvenser, for eksempel BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI 2016) der en mengde DNA-, RNA- eller aminosyresekvenser er samlet.

2.3.2. Totalsekvensering av mikrober.

En nyere metode for å undersøke den totale mikrobiologisk sammensetningen i en matvare kalles massiv parallell sekvensering (MSP), eller totalsekvensering. Dette er en dyrkningsuavhengig metode som gir raske resultater og kan benyttes på mange prøver samtidig. Metoden baserer seg også på 16S-rRNA-sekvensering, men av all mikrobiota DNA tilstede i prøven. Dette gir en kvantitativ oversikt over det mikrobiologiske samfunnet i prøven, hvor både levende og døde organismer analyseres (Porcellato & Skeie 2016). Illumina MiSeq er en vanlig totalsekvenseringsmetode å bruke.

2.4. Ølbrygging.

Byggkornet er sammensatt som vist i Figur 7, med embryo i proximal-enden, scutellum som skiller embryo fra endospermen og aleuronlag rundt endospermen. Kornet er omsluttet av kli, og har langt snerp som vender ut fra akset. Endospermen er kornets opplagsnæring og består i hovedsak av stivelse organisert i stivelseskorn (Lewis & Young 2001b). Stivelseskornene er omsluttet av cellevegger bestående av omtrent 75% β-glukan, 20% arabinoxylan (pentosan) og 5% proteiner i tillegg til noe celluloce og ferulsyre (Kanauchi & Bamforth 2001).

13

Figur 7: Skjematisk fremstilling av byggkornet (Lewis & Young 2001a).

2.4.1. Malting.

Malting er prosessen som omformer kornet til malt før det kan brukes til ølbrygging eller destillering. Maltingsteknikken baserer seg på evnen kornet har til å omforme de lagrede næringsstoffene slik at kornets embryo kan vokse. Bryggeren benytter denne mekanismen til å fremstille malt uten at næringsstoffene går tapt. Når kornet brukes til ølbrygging er det i hovedsak stivelsen man er ute etter, men kornet inneholder også en del proteiner. Modifisering av kornet er et uttrykk som omfatter alle endringer som skjer under fremstillingen av malt (Lewis & Young 2001b).

Maltingen deles inn i støping (bløtlegging), germinering (spiring) og kjølling (tørking). Under støpingen sveller kornet opp og respirasjonen øker. Fuktigheten i kornet øker fra 10-12% til 42-46% noe som er avgjørende for modifiseringen av kornet. Skallet tar opp vann raskt, og holder på fuktigheten gjennom hele støpingen. Embryoet tar opp mer vann (55-60%) enn endospermen (30-40%) der opptaket også går tregere. Vann tas opp i endospermen gjennom skutellum og vandrer først langs “dorsal” ytterkant, før “ventral” kant og til slutt trenger inn i kjernen. Støpevannet holder gjerne en temperatur på 10-15°C og støpingen tar mellom 40 og 50 timer. I løpet av prosessen byttes vannet ut minimum en, men gjerne tre eller fire ganger for å kontrollere temperaturen og fjerne urenheter og mikroorganismer. I tillegg får kornet en “air rest” eller “dry stand” når vannet byttes for å unngå overoppheting samtidig som det ikke tørker ut. I tillegg kan også luft bobles gjennom kornet i løpet av støpingen for å fjerne akkumulert CO2 (Lewis & Young 2001b).

14 Støpingen er ferdig når roten kan skimtes som en hvit prikk på skallet. Da dreneres vannet av og kornet legges til spiring enten i egne spirekammer eller i kombinerte støpe- og spirekammer.

Kornet ligger til spiring i 3-5 dager mens det snues jevnlig for å sikre jevn spiring og å hindre at røttene floker seg sammen. I enkelte kammer vendes kornet kontinuerlig, mens i andre snues det to til tre ganger daglig. Fuktig og kjølig luft blåses igjennom for å regulere temperaturen og tilføre O2 samtidig som akkumulert CO2 fjernes. Temperaturen på kornet øker typisk fra 10- 15°C til 20-22°C i løpet av germineringen. Den viktigste årsaken til at korn maltes er for å stimulere produksjonen av gibberelliner og andre plantehormoner i kornets embryo. Det skjer i løpet av de første dagene mens embryo vokser, altså i støpingen, slik at vannet frakter gibberillinene fra embryo og gjennom skilleveggen mellom scutellum og aleuronlaget. Denne veggen er bedre utviklet på dorsal-siden av kornet, og modifiseringen skjer derfor raskere her.

Når aleuronlaget kommer i kontakt med gibberillinene blir det produsert enzymer som igjen bryter ned næringsstoffene i endospermen slik at embryo kan nyttiggjøre seg av disse.

Utskillelsen av enzymer skjer under germineringsfasen av maltingen. Enzymene som produseres er i hovedsak α-amylase, β-amylase, limit dekstrinase, β-glukanase og proteaser.

Når kornet ligger til spiring bryter β-glukanase og proteasene ned celleveggene rundt stivelseskornene for å gjøre stivelsen tilgjengelig. For bryggeren er det avgjørende at celleveggene brytes ned, men at spiringen avbrytes før amylasene bryter ned mye stivelse (Lewis & Young 2001b). Spiringen avbrytes når bladspiren har grodd til 75-85 % av kornets lengde (Briggs et al. 2004).

Etter germineringen blir enzymene deaktivert gjennom tørking, eller kjølling. Vanninnholdet i kornet senkes raskt til 3-5% slik at enzymene blir mer varmestabile og ikke ødelegges av varmen. Tørkingen skjer i tre steg; “free drying” der vann fra overflaten av kornet fjernes ved relativt lav temperatur (50-65°C), “forced drying” der vann fra kjernen av kornet vandrer til overflaten (70-75°C) og til slutt “curing” der vann bundet til mikromolekylene i kjernen fjernes. Siste steg gjøres ved 80-110°C avhengig av hvilken type basemalt som produseres, hvilke aromastoffer og hvilken grad av ikke-enzymatisk bruning (Maillard-reaksjoner) som ønskes. Basemalt er de malttypene det brukes mest av i et brygg, og som tilfører fermenterbart sukker og enzymer. Spesialmalt bidrar i hovedsak med farge og aroma og i liten grad enzymer og sukker. Mange av disse sortene kjølles ved høyere temperaturer (≤ 225°C) eller produseres

15

ved å bløtlegge og varmebehandle basemalt på nytt (Lewis & Young 2001b). Tørkingen gjør kornet lagringsstabilt og bevarer enzymene og stivelsen.

Booysen et al. (2002) undersøkte hvordan sammensetningen av melkesyrebakterier endret seg gjennom maltingsprosessen av de to byggsortene Clipper og Prisma. Det ble tatt ut prøver av kornet før støping og etter siste “dry stand” i tillegg til etter en, to og tre dager med germinering og etter kjølling. Celletallene økte gjennom støpingen, fra 1,2*10³ og 7,6*10⁴ kde/mL til 2,4*10⁷ og 8,4*10⁷ kde/mL, men endret seg lite gjennom de tre dagene med germinering (fra 3,1*10⁸ og 2,5*10⁷ kde/mL til 3.7*10⁷ og 3.2*10⁷ kde/mL). Etter kjølling sank celletallet til 1.5*10⁴ og 6.9*10⁴. Det ble isolert bakterier fra nevnte uttak i tillegg til to vannprøver og to kornprøver under støping; til sammen ti prøveuttak. Totalt ble 67 gram-positive og katalase- negative bakterier isolert. Ulike fenotypiske og genotypiske tester bekreftet at 38 av disse var Leuconostoc sp., 17 var Weissella sp., 7 var homofermentative laktobasiller og 5 var Lactococcus sp. Før spiring og i spirekammeret inneholdt sorten Clipper Leuconostoc lactis, Leuconostoc argentinum, W. confusa, Lactobacillus casei og Lactobacillus rhamnosus, men ikke Weissella paramesenteroides eller Lc. lactis. Prisma inneholdt Le. lactis, Le. argentinum, W. confusa, W. paramesenteroides og Lc. Lactis, men ikke Lb. rhamnosus eller Lb. casei. Etter kjølling var Leu. argentinum og Lc. lactis dominerende.

2.4.2. Mesking.

Før bryggingen kvernes malten for å øke kontaktflaten mellom malt og vann. På den måten optimaliseres nedbrytingen av stivelse og absorberbare nitrogenkomponenter. Meskingen kan utføres på ulike måter; enten ved å varme vann før tilførsel av malt eller ved å blande malt og vann for så å koke opp en del av blandingen og deretter tilbakeføre den for å oppnå riktig mesketemperatur. Uavhengig av metode er målet med meskingen å produsere en vørter ved å aktivere enzymene fra kornet slik at de bryter ned stivelsen til fermenterbare sukkerarter (Pires

& Brányik 2015). Figur 8 viser en oversikt over enzymenes optimale temperaturer og pH- verdier. Mesken har oftest en pH som ligger innenfor dette området (5,1 til 5,5), men pH kan også justeres om nødvendig. Derimot er det viktig å regulere mesketemperaturen. Figuren viser at β-amylasens optimumtemperatur ligger på ca. 55-66°C, mens α-amylase ligger noe høyere, på ca. 68-72°C. β-Glukanase og proteaser har lavere optimumstemperatur.

16 Figur 8: Optimal temperatur og pH for enzymene forbundet med mesking (Palmer 2006).

Figuren viser også at meskingen bør utføres innenfor temperaturområdet som omfatter optimal temperatur for både α- og β-amylase. Stivelse i løsningen består av områder med lineære glukosekjeder bundet sammen av α-(1→4)-bindinger (amylase) og områder med forgreninger av α-(1→6)-bindinger (amylopektin). α-Amylase og β-amylase spalter α-(1→4)-bindinger mens limit dextrinase kan spalte α-(1→6)-bindinger (Damodaran et al. 2007). β-amylase spalter kun glukosekjeden i ikke-reduserende ende, og en høy aktivitet av α-amylase lager derfor flere bindingsseter for β-amylase (Pires & Brányik 2015). Etter meskingen inneholder vørteren i hovedsak de fermenterbare sukkerne glukose, maltose og maltotriose i tillegg til ikke-fermenterbare dextriner (Pires & Brányik 2015). Når stivelsen er brutt ned utmeskes vørteren ved >77°C i et par minutter for å stoppe alle enzymatiske reaksjoner i (Palmer 2006).

2.4.3. Vørterkoking.

Etter meskingen siles vørteren for å fjerne kornrester (mask) og masken skylles enten med vann eller ved å sirkulere vørteren (Palmer 2006). Deretter varmes løsningen opp, og kokes i 60-120 minutter. Vørterkoking er et viktig trinn i prosessen av flere grunner; sterilisering, koagulering av proteiner slik at disse synker, fordamping av vann og flyktige komponenter som dimetylsulfid (DMS), isomerisering av α-syrer og Maillard-reaksjoner (Pires & Brányik 2015).

17

Underveis i kokeprosessen tilsettes humle for å gi en konserverende effekt og samtidig bitterhet og aroma i det ferdige ølet. Humle inneholder α-syrene humulon, cohumulon og adhumulon og β-syrene lupulon og colupulon i tillegg til spor av en rekke andre analoger av disse. Under vørterkokingen isomeriseres α-syrene til iso-α-syrer, som er tre ganger mer løselig i vann og ni ganger mer bitre enn α-syrene (Briggs et al. 2004).

2.4.4. Fermentering.

Bryggegjær er encellede, fakultativt anaerobe eukaryoter som formerer seg gjennom knoppskyting. Hovedsakelig er det to arter av Saccharomyces som brukes i ølbrygging, men også Brettanomyces og andre gjærstammer blir benyttet. Saccharomyces cerevicise kalles også over-gjær fordi den akkumuleres i skummet på ølet under gjæringen, mens S. pastorianus legger seg på bunnen av gjæringstanken og kalles under-gjær. Artene brukes henholdsvis i ale- og lager-øl (Lewis & Young 2001a).

Begge artene av Saccharomyces kan metabolisere små sukkerenheter som sukrose, glukose, fruktose, maltose og maltotriose. Enzymet invertase hydrolyserer sukrose til glukose og fruktose utenfor cellen, mens de andre sukkerartene fraktes inn i cytoplasmaen for metabolisering. Maltose og maltotriose hydrolyseres til glukose av α-glukosidase. Opptaket av sukker skjer i en bestemt rekkefølge; glukose og fruktose tas opp gjennom samme permease, men glukose har høyere affinitet og tas derfor opp først. Etter fruktose tas maltose og maltotrisoe opp (Figur 9). Gjæren metaboliserer glukose gjennom to reaksjonsveier; den katabolitt-undertrykkende reaksjonsveien og Ras/cAMP/protein kinase reaksjonveien.

Førstnevnte undertrykker gener som er involvert i transporten av maltose og maltotriose dersom glukose eller sukrose er til stede, i tillegg til gener koblet til glukonegenese og respirasjon. Sistnevnte regulerer gener koblet til metabolisme, formering og stresstoleranse. I begynnelsen av gjæringsprosessen vil begge reaksjonsveiene være aktive og biomassen vokser raskt (Pires & Brányik 2015).

18 Figur 9: Karbohydratsammensetning i en 10°Plato ale vørter gjennom fermentering med en overgjær- art ved 18°C (Briggs et al. 2004).

Nedbrytningen av glukose starter med glykolyse som foregår i cytoplasma og gir to molekyler pyruvat. Deretter dekarboksyleres pyruvat til acetaldehyd og CO2 før acetaldehyd reduseres til etanol. Selv om bryggegjæren kan utføre aerob respirasjon, vil den oftest velge å produsere etanol gjennom fermentering både ved anaerobe og aerobe betingelser, så lenge konsentrasjonen av sukker er høy. Dette fenomenet kalles “crabtree effect” og skyldes både at gjærens etanoltoleranse gir den et overtak over konkurrenter, og at den senere kan bruke etanolen som en kilde til energi og karbon (Pires & Brányik 2015).

2.4.5. Bi-produkter av fermenteringen.

Under fermenteringen dannes det en rekke bi-produkter som påvirker smak og aroma i det ferdige produktet. Mange stoffer gir ølet karakteristikk og velsmak i visse konsentrasjoner, mens andre er uønsket selv i små konsentrasjoner. En forenklet oversikt over bi-produktene som påvirker ølet og metabolismen av disse i en gjærcelle er presentert

i

.

Høyere alkoholer er ønskelig i øl og tilstede i høye konsentrasjoner (≥5 ppm). De dannes ved at gjæren absorberer α-amino-syrer og fjerner aminogruppen før de nydannede α-keto-syrene dekarboksyleres og reduseres til høyere alkoholer. Til forskjell fra høyere alkoholer blir det kun dannet små mengder, eller spor av flyktige estere. Likevel er esterne viktige aromakomponenter fordi terskelverdien for å detektere aromaen er svært lav. Esterne blir

19

dannet fra organiske syrer og alkohol i starten av primærgjæringen og kan deles inn i to grupper; acetat estere, som dannes fra acetat og etanol, og etylestere dannet fra mellomlange fettsyrer og etanol. Estersammensetningen kan endre seg drastisk under lagring, enten i sekundærfermenteringen eller ved spontane kjemiske reaksjoner mellom organiske syrer og etanol. Dette gjør at ølets friske, fruktige aroma gjerne erstattes med en søtere aroma etter modning. Esterne kan være ønskelige i øl, og er spesielt fremtredende i spontangjærede ølsorter, men dersom konsentrasjonen blir for høy kan de likevel gi uønsket aroma (Pires &

Brányik 2015).

Figur 10: De viktigste reaksjonsveiene og metabolittene dannet av Saccharomyces i fermentering av vørter. βG, β-glukosidase; DMS, dimetylsulfid; DMSO, dimetylsulfoksid (Bokulich & Bamforth 2013).

Det samme gjelder for diacetyl (2,3-butandion), som er et biprodukt av aminosyresyntese under primærfermenteringen når biomassen øker. Diacetyl har lav terskelverdi og gir en smøraroma som er ønskelig i mange meieriprodukter men oftest uønsket i øl. Når ølet modnes blir diacetyl reabsorbert av gjæren og redusert til 2,3-butandiol. Dioler har vesentlig høyere terskelverdi og vil derfor ikke påvirke ølets smak (Pires & Brányik 2015). En oversikt over de flyktige stoffene som forbindes med øl er gitt i Tabell 2. Tabellen inkluderer terskelverdiene for stoffene i tillegg til sensoriske karakteristikker og forventede konsentrasjoner i ale-øl. De forventede konsentrasjonene varierer mye mellom ølsorter, og tilstedeværelse av ulike flyktige stoffer kan påvirke oppfattelsen av andre stoffer i ølet. Derfor er det vanskelig å vurdere en enkelt komponent uten det helhetlige sensoriske bildet av en ale.

20 Tabell 2: Flyktige forbindelser i øl, samt forventede konsentrasjoner, terskelverdier og sensorisk karakteristikk av hver enkelt komponent.

Flyktig komponent Konsentrasjon i ale (ppm)

Terskelverdi (ppm)

Sensorisk karakteristikk Alkoholer / høyere alkoholer

Etanol - 14000¹ Alkohol¹

1-propanol 4-17² 800¹ Alkohol, søtt²

2-butanol - 16¹ Søt, vinaktig⁵

2-metyl-1-propanol (isobutanol)

14-19¹ 200¹ Fruktig, whiskey, vin³ 3-metyl-1-butanol

(isoamyl alkohol)

47-61¹ 65¹ Alkohol, vinaktig⁴

2-metyl-1-butanol 84¹ 70¹ Alkohol, vinaktig⁴

Phenylethyl alcohol 1,8¹, 5-102² 125¹, 40² Roser²

1-hexanol 0.33¹ 4¹ Urter, treaktig, søt³

Aldehyder

Acetaldehyd 2-7¹ 10¹ Kaffe, eter, vinaktig³

2-metyl-propanal - 1¹ Banan³

3-metyl-butanal 7¹ 0.6¹ Fruktig, fersken, syrlig³

2-metyl-butanal 1.25¹ Sjokolade, kaffe³

trans-2-hexen-1-al 0,55⁵ 0,365⁵ Mandel, eple, grønnsaker, plomme, søtt³

Ketoner

Diacetyl 0.058¹ 0.15 (lager)¹ Smør¹

2.3-pentandion 0.01-0.2¹ 0.9¹ Smør, toffee²

2-butanon 0.018¹ 80¹ Eterisk³

Aceton 8-42⁵ Eple, eterisk³

Acetoin 0.42¹ 50¹ Smør, kremete³

Svovelforbindelser

Dimethylsulfid 0,010-0,10¹ 0,030¹ Mais¹

Estere

Etylacetat 14-23¹ 33¹ Fruktig, løsemiddel²

Isoamyl acetat 1.4-3.3¹ 1,2-2² Banan¹

Isobutyl acetat 0,01-0,25¹ 1,6¹ Banan, søt, fruktig¹

Etyl hexanoat 0,1-0,5¹ 0,21¹ Fruktig, søt¹

Eple, banan, ananas³

1 (Briggs et al. 2004) ² (Pires & Brányik 2015) ³ (Sigma-Aldrich 2014)

4 (Jackson & Linskens 2002) ⁵ (Barnes 2013) ⁶ (Spitaels et al. 2015a)

21

2.5. Mikrober og metabolitter i kommersielt surøl.

Ifølge Tonsmeire (2014) er Berliner weisse den eneste surølsorten der kun Lactobasillus bidrar til melkesyreproduksjon. Bryggeriene tilsetter enten bakterier og gjær samtidig, eller deler opp vørteren og fermenterer de hver for seg. Spitaels et al. (2015b) undersøkte sammensetningen av mikroorganismer og metabolitter i gueuze-øl etter lagring i to måneder til 17 år. Gueuze ølsorter produseres ved å blande eldre og nyere, vanligvis 3 år og 1 år gamle spontangjærede lambic øl for å oppnå en variert mikroflora som kan bryte ned alle sukkerartene i vørteren.

Oppdyrking på agar gav vekst av gjær fra alle årganger, mens bakterier ikke vokste i øl eldre enn fem år. Fermenteringsprosessen kunne deles i tre faser; en måned med Enterobacteriaceae- dominert vekst, to måneder med primærfermentering dominert av S. cerevisiae og S.

pastorianus, og modning dominert av Pediococcus damnosus og Dekkera bruxellensis der sistnevnte er det seksuelle stadiet av B. bruxellensis. Modningen gav ølet det karakteristiske syrlige og tørre preget. Det ble konkludert med at konsentrasjonen av melkesyre og etyl laktat steg under lagringen (fra 4800 til 11700 ppm melkesyre og fra 102,3 til 620,0 ppm etyl laktat) mens etanolkonsentrasjonen forble konstant (mellom 3,7 og 5,2 ppm). Konsentrasjonen av isoamyl acetat og etyl decanoat avtok i løpet av lagringen (fra 0,27 til 0,05 ppm isoamyl acetat og fra 9,2 til 2,7 ppm etyl decanoat). Det ble observert store forskjeller fra flaske til flaske innenfor samme årgang i forhold til melkesyre- og eddiksyreinnhold. Etylacetat var fettsyre- etylesteren med høyest konsentrasjon (89-319 ppm) og konsentrasjonen var uavhengig av lagring. Små mengder isobutanol og isoamyl acetat ble observert i alle prøvene og konsentrasjonen avtok under lagring. Den lave konsentrasjonen av isoamyl acetat skyldes at D. bruxellensis produserer en esterase som bryter ned esteren. Derfor er innholdet av isoamyl acetat vesentlig lavere i gueuze-øl sammenlignet med andre ølsorter.

Figur 11 viser utviklingen av mikroflora og metabolitter fra en studie av Van Oevelen et al.

(1977) der en spontangjæret lambic-øl ble analysert over 24 måneder. Figuren viser de tre fasene i gjæringsprosessen og hvordan de ulike mikroorganismene påvirker sammensetningen av vørteren. Den første fasen er også her dominert av Enterobacteriaceae i tillegg til Kloeckera som senker pH noe ved å produsere eddiksyre. Under primærfermenteringen tar Saccharomyces over sammen med Pediococcus og det dannes etanol, melkesyre og etylacetat.

Etter omtrent åtte måneder tar Brettanomyces over sammen med Pediococcus.

22 Figur 11: Utvikling av enkelte viktige parametere i spontangjæring av en lambic ølsort. 1-etanol, 2- melkesyre, 3-etylacetat, 4-pH, 5-restsukker (SG), 6-eddiksyre (Van Oevelen et al. 1977).

2.6. Hensikt med oppgaven.

I denne oppgaven ble den mikrobiologiske sammensetningen på kornprøver av norsk bygg undersøkt ved hjelp av dyrkingsavhengige og dyrkingsuavhengige metoder. I tillegg til å se på forskjeller før og etter germinering ble det undersøkt om kornsort og dyrkingssted påvirket det mikrobiologiske mangfoldet på kornet. Deretter ble melkesyrebakterier isolert fra spiret korn og identifisert ved hjelp av klassiske mikrobiologiske og molekylærbiologiske metoder. Det ble utført vekst- og metabolismeforsøk med melkesyrebakteriene i vørter og i blandingskulturer med ulike gjærstammer. Til slutt ble det produsert en surøl-variant der isolerte melkesyrebakterier syrnet vørteren før fermentering med ulike gjærstammer.

23

3. Materialer og metoder.

3.1. Innhenting av kornprøver.

Kornprøver av sortene Fairytrale, Helium og Brage ble hentet fra fire gårder som Graminor og NMBU samarbeider med. Hagen ligger på Hamar og er nabogården til Graminors forsøksgård Bjørke. Apelsvoll ligger på Kapp, på Toten, Rød ligger i Råde og de resterende prøvene ble dyrket på Ås. Sortene Fairytale og Helium er toradsbygg, mens Brage er seksradsbygg. Alle kornprøvene ble høstet i 2016 og sendt til NMBU direkte etter innveiing og registrering.

3.2. Malting

Kornprøvene ble støpet og spiret i kombinerte støpe- og spirekammer fra Custom Laboratory Products (Milton Keynes, England). Kamrene ble skylt i vann ved 60-70°C for å unngå kontaminasjon utenfra eller fra tidligere behandlede korn før 30-40 g av hver kornprøve ble støpt og spiret i separate spirekamre. Under støpingen ble kornet bløtlagt og luftet periodevis, som vist i Tabell 3.Kamrene holdt 16°C gjennom maltingen, og kornet ble snudd jevnlig. Etter 24, 48 og 72 timer ble spiregraden estimert ut fra 10 tilfeldige korn. Spiringen ble avsluttet når gjennomsnittet av kornene hadde utviklet en bladspire på 60-80% av kornets lengde.

Tabell 3 Program for støping og spiring av korn i kombinert støpe- og spirekammer (Custom Laboratory Products). Alle trinnene utføres ved 16°C.

Program Tid (t)

Bløtlegging 8

Lufting 16

Bløtlegging 8

Lufting 16

Bløtlegging 2

Spiring 46-72^a

a Variasjon i spiretreghet mellom kornprøvene.

3.3. Mikrobiologisk analyse av kornprøver.

For å undersøke den mikrobiologiske sammensetningen i de uspirede kornprøvene ble 10,0 g korn veid ut, tilsatt 90 mL Ringers løsning (Oxoid LTD, Hampshire, England) og homogenisert

24 i Waring-blender (Waring Commercial, Stamford, USA). Prøvene av sorten Helium ble kjørt i seks minutter ved høyeste hastighet fordi kornene var hardere å knuse mens Fairytale og Brage ble kjørt i tre minutter ved høyeste hastighet. Prøvene ble deretter fortynnet i Ringers løsning og støpt inn i ulike agarer. Utfyllende informasjon om agarene (produsent, forventet vekst og inkuberingsbetingelser) er gitt i Tabell 4. Agarene ble tilberedt i henhold til produsentens anbefalinger og oppbevart ved 4°C frem til innstøping. De spirede prøvene ble behandlet på tilsvarende måte. Alle kornprøvene ble kjørt i Warring-blenderen i tre minutter med unntak av Helium fra Apelsvoll som ble kjørt i seks minutter, alle ved høyeste hastighet. Alle innstøpinger ble gjort i to paralleller ved de ulike fortynningene.

Tabell 4 Oversikt over produsenter, forventet vekst og inkuberingsbetingelser for agarene benyttet i kartleggingen av mikrober på spirede og uspirede kornprøver.

Agar Produsent Vekst Inkubasjons-

temp. (°C)

Inkubasjons- tid (døgn) Plate Count agar

(PCA)

Oxoid LTD Totalt antall mesofile aerobe

30 2-4

de Man, Rogosa, Sharp-agar (MRS) ^a

Oxoid LTD Melkesyrebakterier 30 2-4

Lactobacillus ssp.-selektiv agar (LBS)

Becton, Dickinson and Conpany, Frankrike

Lactobacillus ssp. 30 CO2-rik (10%)

atmosfære

3-4

Rose-Bengal agar (RB)

Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland

Mugg og gjær 25 4-5

a MRS-buljong ble tilsatt 12g/l Agar (Merck KGaA) eller Bacto agar (Saween Werner AB, Limhamn, Sverige).

Prøvene ble inkubert i henhold til produsentenes anbefalte inkuberingstid og avsluttet når tellbare kolonier ble synlig på skålene. Dersom skålene ikke viste tegn til vekst fikk de stå ut den anbefalte tiden. Antallet kolonidannende enheter (kde) per mL ble beregnet og kolonienes morfologi, størrelser og farger ble registrert. I hovedsak ble kun skåler med mellom 30 og 300 kde registrert, men for enkelte prøver lå antallet utenfor dette.

25

3.4. Isolering av melkesyrebakterier.

Det ble isolert kolonier for rendyrking fra de spirede kornpeøvene. I utgangspunktet skulle det isoleres 10 kolonier fra LBS-agaren og 10 kolonier fra MRS-agaren, men på grunn av varierende vekst på LBS-agaren ble det for mange prøver kun isolert kolonier fra MRS.

Antallet isolerte kolonier varierte også mellom prøvene, men minimum ti kolonier ble isolert fra hver. Koloniene ble overført til 5 mL MRS-buljong ved hjelp av en steril podeøse og inkubert ved 30°C i 24-48 timer til vekst ble synlig. Deretter ble kulturen strøket ut på MRS- agarskåler ved hjelp av en steril podeøse og inkubert ved 30°C i 2-4 døgn, til vekst ble registrert. Dersom det ble observert kolonier med ulik morfologi (størrelse, farge, form etc.) på skålen ble disse rendyrket ved ny poding i MRS-buljong og utstrykning på MRS-agar.

De rendyrkede bakteriekulturene ble frosset ned til -80°C for oppbevaring inntil videre analyse.

Før nedfrysing ble MRS-buljongkulturene tilsatt 15 % (v/v) glycerol. Forut for analyse ble kulturene oppdyrket ved at en podeskje av den frosne kulturen ble overført til 5 mL MRS- buljong ved hjelp av en steril podeskje og inkubert ved 30°C over natt.

3.4.1. Katalase-test og Gram-farging.

For å undersøke om de isolerte renkulturene kunne produsere enzymet katalase ble en dråpe 3

% H2O2 lagt på et objektglass og renkultur fra agarskålen rørt ut i denne ved hjelp av en steril engangspodenål i plast. Gassdannelse som følge av reaksjon mellom katalase og H2O2 ble registrert. Fordi melkesyrebakterier ikke produserer katalase ble kun katalase-negative kulturer vurdert videre.

Det ble laget preparater for Gram-farging ved å røre renkultur fra agarskålen ut i en dråpe Ringers løsning på et objektglass og lufttørke dette før preparatet ble varmefiksert ved å føre det gjennom flammen på en gassbrenner 3-4 ganger. Deretter ble preparatene farget etter Grams metode og mikroskopert med lysfelt ved 1000x forstørring med et Leica DM750 mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Gram-positive kulturer ble observert som blå-fiolette og Gram-negative som rød-rosa.

3.5. Genotyping.

Renkulturene ble bearbeidet og sekvensert fortløpende etter rendyrking. I utgangspunktet var 70 kolonier Gram-positive og katalase-negative, men fordi mange kolonier isolert fra samme