Estudi de la difusió passiva d’esquaramides bioactives

Facultat de Ciències

Memòria del Treball de Fi de Grau

Estudi de la difusió passiva d’esquaramides bioactives

Marta Ximenis Campins Grau de Química

Any acadèmic 2012-13

DNI de l’alumne: 43178336E

Treball tutelat per Dr. Antoni Costa Torres Departament de Química Orgànica

S'autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació

X

Contingut  del  treball  

1.  Introducció  ...  6  

1.1.  Difusió  passiva  i  ADME  (Absorció,  Distribució,  Metabolisme  i  Excreció)  ...  6  

1.1.1.  Assajos  de  permeabilitat  in  vitro  ...  7  

1.2.  PAMPA:  detalls  tècnics  ...  8  

1.2.1.  Instrumentació  de  l’assaig  ...  8  

1.2.2.  Composició  dels  pous  donadors  i  acceptors  ...  8  

1.2.3.  Mètodes  de  detecció  ...  8  

1.2.4.  Càlcul  del  log  Pe  ...  9  

1.2.5.  Altres  aplicacions  de  la  tècnica  PAMPA:  afinitat  per  proteïnes  “protein  binding”  ...  9  

1.3.  Esquaramides  ...  10  

1.4.    Assajos  estadístics:  proves  de  significança  ...  11  

1.4.1.  Test  F  per  a  la  comparació  de  dues  variàncies  ...  11  

1.4.2.  Test  t  per  a  la  comparació  de  dues  mitjanes  ...  11  

2.  Objectius  ...  12  

3.  Secció  experimental:  Materials  i  mètodes  ...  13  

3.1.  Reactius  ...  13  

3.2.  Equips  ...  13  

3.3.  Mètode  ...  14  

3.3.1.  Muntatge  del  sistema  d’incubació  ...  14  

3.3.2.  Solucions  tampó  5%  DMSO  ...  14  

3.3.3.  Solució  de  lecitina  en  dodecà  1%  ...  15  

3.3.4.  Solucions  500  mM  donadores  5%DMSO  ...  15  

3.3.5.  Muntatge  PAMPA  ...  15  

3.3.6.  Anàlisi  de  l’absorbància  dels  pous  acceptors  ...  15  

3.3.7.  Construcció  de  les  corbes  de  calibrat  ...  15  

4.  Resultats  i  discussió  ...  16  

4.1.  Optimització  de  les  condicions  de  l’assaig  ...  16  

4.1.1.  Selecció  dels  patrons  ...  16  

4.1.2.  Temps  d’incubació  ...  17  

4.1.3.  Agitació  ...  17  

4.1.4.  Control  d’humitat  ...  18  

4.1.5.  Control  de  temperatura  ...  18  

4.1.6.  Discussió  de  resultats  sobre  les  condicions  de  realització  dels  assajos  ...  18  

4.2.  Estudi  de  la  difusió  passiva  dels  patrons  seleccionats  ...  19  

4.2.1.  Obtenció  de  les  corbes  de  calibrat  ...  19  

4.2.2.  Estudi  de  la  difusió  passiva  de  patrons  coneguts:  variació  del  medi  ...  20  

4.2.3.  Estudi  de  la  difusió  passiva  de  patrons  coneguts:  variació  de  la  composició  de  la   membrana  ...  22  

4.3.  Estudi  de  la  difusió  passiva  d’esquaramides  bioactives  ...  25  

4.3.1.  Esquaramides  bioactives  analitzades  ...  25  

4.3.2.  Obtenció  de  les  corbes  de  calibrat  ...  26  

4.3.3.  Estudi  de  la  difusió  passiva  d’esquaramides  bioactives:  variació  del  medi  ...  27  

4.3.4.  Estudi  de  la  difusió  passiva  d’esquaramides  bioactives:  variació  de  la  composició  de  la   membrana  ...  30  

5.  Conclusions  ...  31  

6.  Bibliografia  ...  32    

Estudi de la difusió passiva d’esquaramides bioactives

Les esquaramides són composts derivats de l’àcid esquàric (3,4-dihdroxi-3-ciclobuten-1,2- diona). El nucli central d'una esquaramida és un ciclobutè dicarbonílic i dos substituents variables a les posicions 3 i 4. La seva disposició estructural característica fa que siguin d’interès biològic i tinguin nombroses aplicacions.

Qualsevol molècula bioactiva ha de travessar la membrana que recobreix totes les cèl·lules per tal d'exercir la seva funció terapèutica. Aquest transport pot ser actiu o passiu, denominacions que fan referència a la necessitat de consumir energia, en el primer cas, o no en el segon.

El mètode més senzill i sense cost energètic de travessar la bicapa lipídica cel·lular és mitjançant el mecanisme de difusió passiva, a favor de gradient. Els darrers anys s’han desenvolupat diferents mètodes per a l’estudi i predicció in vitro de la capacitat de penetració cel·lular de molts composts. La tècnica PAMPA (“Paralel Artificial Membrane Permeability Assay”) permet dur a terme aquests anàlisis de forma ràpida, versàtil i econòmica.

Aquest treball s’ha centrat en l’estudi de la difusió passiva d’esquaramides bioactives fent servir la tècnica PAMPA. Per això, la primera part del treball ha consistit en optimitzar les condicions de treball i paràmetres de la tècnica, parant especial atenció al temps d’incubació, influència de l’agitació del sistema i temperatura i humitat de la incubació.

Un cop optimitzat el mètode, la segona part del treball s’ha centrat en el càlcul de la permeabilitat de fàrmacs comercials i composts de recerca, estudiant la influència de l’entorn sobre aquests i com a la vegada, es condiciona la permeabilitat. S’han realitzat assajos per avaluar la influència del pH del medi i la interferència del tipus de tampó emprat, així com assajos en gradient de pH. També s’ha variat la composició de la membrana i s’ha estudiat com afecta la presència del fosfolípid a la capacitat de penetració dels diferents composts estudiats.

1 2

4 3

1. Introducció  

1.  Introducció  

1.1.  Difusió  passiva  i  ADME  (Absorció,  Distribució,  Metabolisme  i  Excreció)  

És un dels principals paràmetres de permeabilitat a estudiar dins del procés de descobriment de fàrmacs (drug discovery). El compost difon en moviment brownià des de la fase aquosa a través de la bicapa lipídica cel·lular fins al medi aquós del seu interior. La difusió passiva es regeix per un gradient de concentració, amb el moviment net de partícules des de l’àrea de major concentració fins a la de menor.¹

Durant la absorció intestinal, els fàrmacs es mouen des del lumen gàstric a través de la membrana intestinal cap als capil·lars i vasos sanguinis, amb concentració relativa menor.

S’estima que un 95% dels fàrmacs comercials s’absorbeixen al tracte gastrointestinal per medi d’aquest mecanisme.

És important tenir en compte que la permeabilitat és major per molècules més lipofílíques que per molècules polars degut sobretot a la composició no polar de la bicapa lipídica. És per això que el pH del medi i el pKa dels analits juguen un paper molt important a la difusió passiva.

Figura 1.1.1. Efecte del pH a la difusió passiva d’àcids i bases a través de la membrana lipídica. En aquest exemple el pKa de l’àcid és 5 i de la base és 10

Els valors de pH i pKa també condicionen la difusió en ambdós sentits a través de la membrana si el pH cel·lular és diferent al del medi.

Figura 1.1.2. Efecte del gradient de pH a través de la membrana lipídica. El pKa de l’àcid és 5 i de la base és 10

1 E.H. Kerns; Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods From ADME to Toxicity Optimization; 2008

1. Introducció  

1.1.1.  Assajos  de  permeabilitat  in  vitro  

1.1.1.1.  IAM  HPLC  (Immobilized  Artificial  Membrane,  High-­‐Performance  Liquid   Cromatography)    

Aquesta tècnica ofereix l’avantatge de treballar amb el mètode cromatogràfic del HPLC. En lloc d’unir-se grups octadecil al suport sòlid, com a la fase reversa, la tècnica IAM empra fosfolípids units a la resina que contenen caps polars i cadenes laterals alifàtiques. Els analits introduïts es reparteixen entre la fase mòbil aquosa i els fosfolípids units a la resina. El factor cromatogràfic de capacitat (k) augmenta a mesura que s’incrementa l’afinitat pel fosfolípid i amb això la lipofília de l’analit. Aquest paràmetre d’afinitat es pot relacionar amb la difusió, els temps de retenció es calibren front patrons amb permeabilitat coneguda o determinada amb una altra tècnica.

1.1.1.2.  Mètode  de  la  capa  de  cèl·lules:  Caco-­‐2  

El primer mètode in vitro per a la determinació del coeficient de penetrabilitat fou el mètode de la capa de cèl·lules. S’utilitza la línia cel·lular Caco-2, que pertany a l’adenocarcinoma de colon i es troba disponible a la base American Type Culture Collection (ATCC). Aquesta línia resulta òptima per dur a terme estudis de permeabilitat ja que presenta una morfologia adequada i desenvolupa microvellositats a la superfície apical, el que fa que es sembli morfològicament a l’epiteli gastrointestinal. A més expressen transportadors de membrana a la seva superfície com ara la P-glicoproteïna (Pgp), la “breast càncer resistance protein”

(BCRP) i “multidrug resistance protein 2” (MRP2), que permeten investigar diferents mecanismes de permeabilitat.

En aquest procediment es cultiven les cèl·lules Caco-2 sobre un suport durant 21 dies aproximadament, de manera que el creixement cel·lular fa que conflueixin entre sí els cossos fins cobrir la superfície. És preferible obtenir una monocapa tot i així solen formar una mescla de mono i multicapes. És important que no existeixin gaps o buits ja que en fer l’assaig els analits passarien ràpidament a través del filtre porós. Es tracta d’una tècnica cara per assajos de més de 21 dies ja que el manteniment cel·lular es veu afectat pel medi. D’altra banda per assajos menors de 5 dies la tècnica és més assequible comercialment però s’ha de deixar passar temps suficient perquè s’expressin completament les proteïnes transportadores.

1.1.1.3.  PAMPA  (Parallel  Artificial  Membrane  Permeability  Assay)    

Aquest assaig de difusió passiva és una excel·lent alternativa als models cel·lulars per a dur a terme les primeres determinacions d’ADME de substàncies en estudis preliminars de la recerca, superant altres mètodes descrits en velocitat, versatilitat i especialment en costos. A més, les limitacions que presenten la resta de tècniques per analitzar productes amb baixa solubilitat aquí se soluciona fent servir un cosolvent.

Es va seleccionar aquesta tècnica per dur a terme l’estudi de la difusió passiva d’esquaramides bioactives, degut a la seva natura innovadora, la disponibilitat dels equips i els avantatges esmentats en el paràgraf anterior.

1. Introducció  

1.2.  PAMPA:  detalls  tècnics   1.2.1.  Instrumentació  de  l’assaig  

El sistema es compon de dues plaques de 96 pouets que es col·loquen una dins l’altra formant un “sandvitx”. Generalment la difusió es du a terme des de la placa superior fins a la inferior si bé es pot realitzar a la inversa. La placa superior o placa donadora és la que conté la solució amb l’analit i presenta un filtre porós constituït generalment per un polímer fluorat. D’altra banda, la placa inferior es coneix com la placa acceptora. És recomanable que estigui feta a base d’un material hidrofòbic, generalment s’utilitza tefló.² A continuació es mostra una representació esquemàtica del sistema de difusió:

  Figura 1.2.1.1. Sandvitx de les plaques PAMPA i direcció de la difusió

1.2.2.  Composició  dels  pous  donadors  i  acceptors  

Un dels problemes més recurrents dels assajos de permeabilitat és la baixa difusió de molts composts de recerca. La majoria de dades que es troben a la bibliografia corresponen a productes amb elevada solubilitat amb aigua de manera que la tècnica permet treballar a un rang de concentració d’uns 500 μM. Quan aquest protocol es trasllada a productes amb baixa solubilitat apareix un problema addicional, la sensibilitat del mètode de detecció i per tant, l’impediment de treballar amb aquestes concentracions.

Aquest impediment per altres tècniques s’ha solucionat fent servir cosolvents als dissolvents dels assajos. D’aquesta manera, es treballa amb solucions donadores d’aquests composts dissolts en el tampó aquós i una proporció determinada de cosolvent. És important que aquest cosolvent es trobi també al medi acceptor de manera que generalment es duen a terme el assajos amb el mateix solvent constituït per tampó i cosolvent tant als pous donadors com als acceptors.  ³

1.2.3.  Mètodes  de  detecció  

Als inicis de la tècnica es va fer l’espectrofotometria UV per a llegir les absorbàncies puntuals dels analits, a una sola longitud d’ona. Posteriorment es millorà la sensibilitat fent lectures a tot l’espectre permetent senyalar les interferències causades per la degradació dels composts o les seves impureses.

Als darrers anys, la tendència de la indústria farmacèutica és dirigir-se cap a tècniques més selectives i més sensibles, implicant generalment sistemes cromatogràfics com HPLC-UV i HPLC-MS.²

2  B. Faller, Current Drug Metabolism; 2008, 9, 886-892

3 J.A. Ruell, A. Adveef; Humana Press; 2004, 37-64

1. Introducció  

1.2.4.  Càlcul  del  log  Pe  

El logaritme de la permeabilitat efectiva proporciona informació del grau de difusió que experimenta cada analit en funció de la seva lipofília i afinitat per la membrana³. L’equació que permet calcular el log Pe es presenta a continuació, reportada per Faller:²

log!_!=log !·−ln 1− [!"#$]!""!"#$%

[!"#$]!"#$%$&'$#(      != !_!·!_!

!_!+!_! !"#$·!"#$  

log!!""=log !· [!"#$]!""#$%&'

[!"#$]!"!#!$%,!"#"$      != !_!

!"#$·!"#$  

Taula 1.2.4.1. Paràmetres de les equacions per al càlcul del log P_e

Paràmetre Definició Notes

VD Volum del pou donador En cm³, 150 L=0,15 cm³ VA Volum del pou acceptor En cm³, 300 L=0,30 cm³ Àrea Superfície activa de la membrana

Definit com àrea de membrana x porositat. Per a la membrana de “MultiScreen Permeability Filter Plate” àrea = 0.24 cm² x 100% o 0,24 cm² Temps Temps d’incubació de l’assaig En segons

[drug]aceptor Concentració del pou acceptor en completar-se l’assaig

Mesura de l’absorbància del pou acceptor (Gen5 Data Analysis Software)

[drug]equilibrium Concentració a l’equilibri teòric Mesura de l’absorbància a l’equilibri (Gen5 Data Analysis Software)

1.2.5.  Altres  aplicacions  de  la  tècnica  PAMPA:  afinitat  per  proteïnes  “protein  binding”  

La gran versatilitat de la tècnica permet dur a terme assajos d’afinitat in vitro de forma ràpida, econòmica i eficaç. La “human serum albumin” (HSA) és la proteïna més abundant del plasma, per tant la determinació de les constants d’associació de fàrmacs amb aquesta (Kd) és d’important rellevància per al desenvolupament i optimització de fàrmacs. L’assaig PAMPA permet estimar valors d’aquesta constant generant informació útil per a la millora de les propietats d’un determinat producte.⁴

Figura 1.2.5. Equilibri químic a l’assaig PAMPA-HSA

4  E. Lázaro, PJ. Lowe, X. Briand, B. Faller; J. Med. Chem. 2008, 51, 2009–2017

1. Introducció  

1.3.  Esquaramides  

Les esquaramides són un tipus de composts derivats de l’àcid esquàric (3,4-dihidroxi-3- ciclobuten-1,2-diona) que presenten un ciclobutè dicarbonílic amb dos substituents amínics variables. Les esquaramides són una classe de composts molt rellevants degut a les seves propietats selectives per al reconeixement molecular tant d’anions com cations⁵, així com a catalitzadors⁶. L’estabilitat de les esquaramides front atacs nucleòfils així com la seva capacitat direccional per a la formació d’enllaços d’hidrogen els fa candidats potencials per a nombroses aplicacions biològiques, especialment com a agents actius en biologia i química mèdica⁷. Així mateix, els derivats esquaramídics actuen com a agents de substitució de cianoguanidines⁸, inhibidors funcionals de HIV-1 en cèl·lules⁹, mimètics d’arginina o antagonistes de receptors CXCR1 i CXCR2 acoblats a proteïna G¹⁰. D’altra banda s’han apuntat com a grups isòsters del grup fosfat¹¹ i aminoàcids¹².

Figura 1.3.1. Esquaramides amb diferent grau de substitució

D’altra banda, la formació d’oligòmers per agregació d’esquaramides condueix a la formació de macrocicles:¹³

Figura 1.3.2. Macrocicle esquaramídic                                                                                                                            

5  a) S. Tomás, R. Prohens, M. Vega, C. Rotger, P. M. Deyá, P. Ballester, A. Costa; J. Org. Chem.,1996, 61,

9394; b) E. Sanna, L. Martínez, C. Rotger, S. Blasco, J. González, E. García-España, A. Costa; Org. Lett. 2010, 12, 3840.  

6  a) J. Alemán, A. Parra, H. Jiang, K. A. Jørgensen, Chem. Eur. J. 2011, 17, 6890; b) J. P. Malerich, K. Hagihara,

V. H. Rawal, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 14416; c) Y.-F. Wang, W. Zhang, S.-P. Luo, G.-C. Zhang, A.-B.

Xia, X.-S. Xu, D.-Q. Xu, Eur. J. Org. Chem. 2010, 4981.

7 R. I. Storer, C. Aciro, L. H. Jones, Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 2330.

8  J. A. Butera, M. M. Antane, S. A. Antane, T. M. Argentieri, C. Freeden, R. F. Graceffa, B. H. Hirth, D.

Jenkins, J. R. Lennox, E. Matelan, N. W. Norton, D. Quagliato, J. H. Sheldon, W. Spinelli, D. Warga, A.

Wojdan, M. Woods, J. Med. Chem. 2000, 43, 1187.

9C.-W. Lee, H. Cao, K. Ichiyama, T. M. Rana, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 4243.

10 W. Gonsiorek, X. Fan, D. Hesk, J. Fossetta, H. Qiu, J. Jakway, M. Billah, M. Dwyer, J. Chao, G. Deno, A.

Taveras, D. J. Lundell, R. W. Hipkin, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007, 322, 477

11 K. Seio, T. Miyashita, K. Sato, M. Sekine, Eur. J. Org. Chem. 2005, 5163.

12  E.G. Campbell, A.K. Park, W.A. Kinney, R.W. Fengl, L.S. Liebeskind, J. Org. Chem. 1995, 60, 1470.

13 M.C. Rotger, M.N. Piña, A. Frontera, G. Martorell, P. Ballester, P.M. Deyà, A. Costa; J. Org. Chem. 2004, 69, 2302-2308.  

1. Introducció  

1.4.    Assajos  estadístics:  proves  de  significança  

Per a dur a terme l’anàlisi dels resultats del treball és important tenir coneixement dels assajos estadístics més comuns i la seva manera d’aplicar-se.¹⁴ Per a realitzar els assajos es farà servir el software © Microsoft Excel 2010 (vegi’s apartat 4. Resultats).  

1.4.1.  Test  F  per  a  la  comparació  de  dues  variàncies  

Es defineixen les hipòtesi de l’assaig de manera que si la hipòtesi nul·la (Ho) es vertadera F ha de ser pròxim a 1, les petites diferències que puguin existir són degudes a errors aleatoris, però si F supera un cert valor (Fcrit) serà degut a altre tipus d’error y per tant es rebutjarà la Ho. L’estadístic F es defineix com:

! =!_!^!

!_!^!;      ! ≥ 1

El valor d’aquest estadístic determinarà si l’assaig t, es calcula per a mostres a variàncies iguals o diferents.

A la presentació de resultats, si Fexp < Fcrit es consideren variàncies iguals mentre que si Fexp >

Fcrit es consideraran diferents.

1.4.2.  Test  t  per  a  la  comparació  de  dues  mitjanes  

Mitjançant aquesta prova estadística es defineix la Ho que serà vertadera sempre que el valor de l’estadístic texp no superi el valor crític (tcrit), en cas contrari es rebutja Ho i s’assumeix H1. L’estadístic texp i s² es defineixen en funció de si les variàncies són iguals o no:

Variàncies iguals Variàncies diferents

!_!"# = !_!−!_!

!· 1

!_!+ 1

!_!    

!_!"# = (!_!−!_!)

!· !_!^!

!_! +!_!^!

!_!

!^! = !_!−1 !_!^!+ !_!−1 !_!^!

!_!+!_!−2    

!=

!_!^!

!_!+ !_!^!

!_!

!

!_!^!

!_!^! !_!−1 + !_!^!

!_!^! !_!−1

!=(!_! +!_!−2)

s: desviació estàndard de les mesures; v: graus de llibertat

14  D. McCormick, A. Roach; Measurement, Statistics and Computation, John Wiley, 1987

2. Objectius  

2.  Objectius  

1. En primer lloc, es realitzarà un estudi de la tècnica PAMPA, el seu fonament i les seves aplicacions per a l’estudi de la difusió passiva de molècules bioactives. Per això es durà a terme un estudi i optimització dels paràmetres i condicions de treball fent servir patrons dels quals es coneix la seva permeabilitat efectiva.

2. En segon lloc s’avaluarà la versatilitat del mètode, per això es calcularan els valors de log Pe de fàrmacs patrons, en mitjà neutre i en mitjà àcid. Paral·lelament, a fi d’avaluar interferències del propi tampó, s’obtindrà el coeficient de permeabilitat dels patrons al mateix pH amb tampons diferents. S’estudiarà a més la difusió passiva dels patrons en condicions de gradient de pH oscil·lant aquest entre àcid i neutre.

3. En tercer lloc, es variarà la composició de la membrana, amb la finalitat d’avaluar l’efecte produït en la interacció dels patrons amb aquesta i estimar-ne la seva afinitat. A més es realitzarà un estudi per microscòpia electrònica d’escombratge (SEM) del filtre porós així com un anàlisi elemental per visualitzar l’estructura interna del filtre.

4. Finalment, es calcularà el log Pe d’esquaramides bioactives, avaluant la influència del canvi de pH del medi, el gradient de pH i la composició de la membrana.

3. Materials i mètodes  

3.  Secció  experimental:  Materials  i  mètodes   3.1.  Reactius  

§ Lípid o mescla lipídica: L-α-fosfatidilcolina (lecitina) (P1263-100MG)

§ Dodecà (D221104-100ML, Sigma)

§ Tampó salí

• PBS (P3813, Sigma)

• TRIS (703117, Sigma)

• CACO (C4945, Sigma)

• Py (270970, Sigma)

§ DMSO (Su0153 Dimethyl sulfoxide, Scharlau)

§ Carbamazepina (PHR1067-1G, Sigma)

§ Propranolol (P0884-1G, Sigma)

§ Esquaramides bioactives 3.2.  Equips  

§ MultiScreen filter plate for PAMPA (#MAIPN45XX; Millipore Corporation, Billerica, MA)

§ PTFE Acceptor plate (# MSSACCEPTOR; Millipore)

§ Microscopi electrònic d’escombrat: (SEM): HITACHI S-3400N (Bruker)

§ PowerWave HT Microplate Spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc)

§ Gen5 Data Analysis Software (BioTek)

§ Corning® 96 Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate (Product #3635) (Corning Incorporated)

§ Pipeta automàtica Reference 4900 1000 µl (Eppendorf)

§ Pipeta automàtica Reference 4900 100 µl (Eppendorf)

§ Pipeta automàtica Reference 4900 20 µl (Eppendorf)

§ Puntes de pipeta epT.I.P.S.® Motion pipette tips, without filter Sterile (Eppendorf)

Figura 3.2.1. PowerWave HT Microplate Spectrophotometer (BioTek^®)

3. Materials i mètodes  

3.3.  Mètode  

3.3.1.  Muntatge  del  sistema  d’incubació  

Per tal de tenir tots els paràmetres i factors ambientals controlats es decidí muntar un sistema tancat. Es va fer servir una capsa de propilè on s’introduí un agitador de plaques, un termòmetre, una manta calefactora i un recipient amb aigua per assegurar una elevada humitat i minimitzar l’evaporació. Per treballar a una temperatura del voltant de 25ºC es va dosificar la potència de la manta amb un regulador de potència.

Figura 3.3.1.1. Ssistema d’incubació

3.3.2.  Solucions  tampó  5%  DMSO  

Es fa servir DMSO com a cosolvent, les dissolucions al 5% es prepararen afegint sobre el DMSO el tampó corresponent que s’indica a continuació.

3.3.2.1.  Tampó  PBS:  H2PO4-­‐/HPO42-­‐:   1L / pH = 7,4 / I = 0,01M / T = 25ºC

Es van dissoldre el contingut del sobre en 1L d’aigua desionitzada. El pH final mesurat va ser de 7,48.

3.3.2.2.  Tampó  TRIS:  

1L / pH = 7,4 / I = 0,1M / T = 25ºC

Es van dissoldre 1,211 g de tris dins 900 ml d’aigua desionitzada. S’hi afegiren 5,354 g de NaCl. Es portà a pH 7,4 addicionant gotes d’HCl 3N i s’enrasà a 1L. El pH final va ser de 7,41.

3.3.2.3.  Tampó  Cacodilat:  Na(CH3)2AsO2·3H2O   1L / pH = 5,5 / I = 0,2M / T = 25ºC

Es dissolgueren 4,28 g de cacodilat sòdic en 100 mL d’aigua desionitzada. S’afegí HCl 0,2M fins arribar al pH desitjat. S’enrasà amb aigua desionitzada fins un litre. El pH final va ser de 5,48

3.3.2.4.  Tampó  Piridina  (Py):    

100 mL / pH = 5,5 / T = 25ºC

Es van dissoldre 0,395 g de piridina en 90 mL d’aigua i es va ajustar el pH amb àcid clorhídric fins un valor de 5,5. Finalment es va completar l’enrasada a 100 mL. El pH final va ser de 5,48.

3. Materials i mètodes  

3.3.3.  Solució  de  lecitina  en  dodecà  1%  

Es preparà una solució de l’1,6% (w/v) de lecitina en dodecà per pesada de 1,56 mg de fosfolípid en 100 mL de dodecà. Es portà la mescla als ultrasons 1 min per assegurar una completa dissolució.

3.3.4.  Solucions  500  mM  donadores  5%DMSO  

Es prepararen dissolucions de concentració coneguda al voltant de 500 μM dels composts a estudiar en diferents tampons salins per pesada de la quantitat necessària i posterior dissolució en 500 µL de DMSO. En certs casos és necessari aplicar ultrasons i/o escalfar per assegurar la completa dissolució. Finalment es completà el volum fins a 10 mL amb el tampó aquós (PBS, TRIS, cacodilat i piridina).

3.3.5.  Muntatge  PAMPA  

Es pipetejaren (amb compte) 5 µL de solució de lecitina dins cada pou de la placa donadora, evitant fer contacte amb la punta sobre la membrana. És recomanable afegir la solució a la placa donadora quan aquesta encara no s’ha acoblat a la placa acceptora, de manera que la membrana no fa contacte amb cap superfície. En expulsar la mescla de la pipeta, queda formant una gota suspesa a la punta; per impregnar la membrana s’ha d’apropar la distància suficient per fer contacte amb el líquid i tenir cura de no tocar el fons amb la punta. A continuació s’hi pipetejaren 150 μL de solució donadora per triplicat a cada pou.

S’afegiren 300 µL de tampó aquós a cada pou de la placa acceptora de PTFE.

Lentament i amb cura, s’introduí la placa donadora dins l’acceptora, assegurant el contacte entre la membrana i el tampó a tots els pous.

Es col·locà la tapadora sobre la placa acceptora (a dalt) i es portà a la cambra d’incubació durant un període de temps controlat.

3.3.6.  Anàlisi  de  l’absorbància  dels  pous  acceptors  

Un cop transcorregut el període d’incubació, es van separar les plaques acceptora i donadora.

Es transferiren 250 µL de solució acceptora dels pous de la placa de PTFE a una placa transparent a l’ultraviolat i es llegí la seva absorbància a 293 nm amb l’espectrofotòmetre lector de plaques PowerWave BioTek.

3.3.7.  Construcció  de  les  corbes  de  calibrat  

Es prepararen entre 6 i 8 patrons de concentració coneguda per dilució de la solució mare de concentració exactament coneguda d’uns 500 mM.. Es pipetejaren 250 μL de cada patró per triplicat dins una placa de 96 pous transparent a l’UV i s’enregistrà la seva absorbància amb l’espectrofotòmetre PowerWave. A partir de les concentracions conegudes i l’absorbància dels patrons s’obtingué i s’ajustà la recta de calibrat estàndard.

4. Resultats i discussió  

4.  Resultats  i  discussió

4.1.  Optimització  de  les  condicions  de  l’assaig  

La primera fase del treball es centrà en l’estudi i optimització de la tècnica PAMPA. Els assajos consisteixen en la incubació d’una solució d’un producte en un mitjà tamponat, el qual, mitjançant difusió passiva travessa una membrana lipòfila. Aquest procés necessita de condicions controlades de temperatura, humitat, temps d’incubació i agitació per poder calcular el paràmetre log Pe i poder-lo estudiar per diferents analits en assajos reproduïbles.

4.1.1.  Selecció  dels  patrons  

En base a aquesta necessitat, es procedí a optimitzar les condicions de treball mitjançant assajos amb patrons coneguts. Per això s’estudià a la bibliografia les dades de penetrabilitat de fàrmacs:

Taula 4.1.1.1. Log Pe mitjà de fàrmacs¹⁵ Log Pe mitjà

Testosterona Propranolol Carbamazepina Warfarina Furosemida Metotrexat -4,8 ± 0,1 -5,0 ± 0,1 -5,2 ± 0,1 -6,0 ± 0,0 -6,5 ± 0,1 -7,2 ± 0,1 En base al coeficient de penetrabilitat, es decidí emprar patrons del voltant de -5, un dels valors més elevats de la taula.

Figura 4.1.1.1. Corbes estàndard dels fàrmacs seleccionats¹⁵

La tria definitiva es complementà amb el perfil de la corba de calibrat i el seu interval de linealitat, cercant treballar d’1 a 100 μM. El propranolol i la carbamazepina responien a aquesta necessitat i permetien la construcció de corbes adequades al treball de laboratori.

15 D. Schmidt and J. Lynch; Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA), Millipore Corporation, app. Note.

4. Resultats i discussió  

Propranolol Carbamazepina

Figura 4.1.1.2. Estructura química dels patrons seleccionats¹⁶

Figura 4.1.1.3. Espectres d’absorció UV dels fàrmacs seleccionats¹⁷

Finalment, una de les característiques fonamentals era trobar patrons amb el màxim d’absorbància a l’UV a la zona del màxim de les esquaramides. D’aquesta manera, les lectures d’absorbància es podrien fer de forma més ràpida, llegint tota la placa a una sola longitud d’ona. Com s’ha comentat, es realitzen les lectures a 293 nm, els fàrmacs propranolol i carbamazepina presenten màxims a aquesta zona per tant, en llegir les absorbàncies tant de patrons com mostres, s’obtenen valors amb menor error.

4.1.2.  Temps  d’incubació  

Es van dur a terme experiments en diferents temps d’incubació. L’objectiu fou trobar el temps òptim de treball en el qual s’hagués completat la difusió de l’analit arribant a la situació d’equilibri.

4.1.3.  Agitació  

Es realitzaren diferents experiments en diferents condicions, fent repeticions amb agitació i sense. Consultant a la bibliografia³ la necessitat de dur a terme els experiments amb agitació es va fer un assaig per estudiar-ne la influència:

16  Sigma-Aldrich^®

17 Propranolol: Pharmacopoeia, Pharmaceuticals and Medical Devices Agency Carbamazepine: Product Information, Sigma Aldrich

Carbamazepine

4. Resultats i discussió  

Taula 4.1.3.1. Log Pe amb agitació i sense per als patrons

Producte tampó t (h) Agitació T (ºC) Membrana

log Pe (mitjana)

N=3

σ

Carbamazepina PBS 8 SI

25±1 5 µL

Lecitina 1,6%

-5,19 0,01

NO -5,15 0,05

Propranolol PBS 8 SI

25±1 5 µL

Lecitina 1,6%

-5,23 0,04

NO -5,07 0,01

σ: desviació estàndard de les mitjanes

Taula 4.1.3.2. Test F i test t per a la comparació de dues mitjanes. Influència de l’agitació Compost Agitació log Pe

(mitjana) Assaig F texp v tcrit, 2 coes

(α=0,05) H P (2 coes) Carbamazepina SI

NO

-5,19±0,01

diferents 1,62 3 3,18 0 10%

-5,15±0,04 Propranolol SI

NO

-5,23±0,04

diferents 3,44 3 3,18 1 2%

-5,01±0,10

v: graus de llibertat de l’assaig; α probabilitat de l’assaig 4.1.4.  Control  d’humitat  

Es treballà en condicions d’elevada humitat per evitar evaporació de les dissolucions del PAMPA mitjançant la col·locació d’un vas ple d’aigua dins el sistema d’incubació. Amb la mesura d’un higròmetre s’observà que la humitat es trobava sempre al voltant del 80%.

4.1.5.  Control  de  temperatura  

El control de la temperatura es dugué a terme mitjançant un termòmetre col·locat dins el sistema d’incubació i amb una manta calefactora com a font de calor, regulada externament fixant-la a 25±1ºC. Degut a la impossibilitat d’aïllar completament el sistema, s’observà que existia una oscil·lació durant el període d’incubació en el valor de temperatura. Es realitzà un seguiment de temperatura durant varis dies, comprovant-ne les oscil·lacions en els diferents períodes de treball per determinar la potència òptima de la manta calefactora i el grau de variació durant 24h.

4.1.6.  Discussió  de  resultats  sobre  les  condicions  de  realització  dels  assajos  

Després de realitzar els assajos inicials s’observà que a partir de les 8h el valor de log Pe no variava en funció del temps d’incubació de manera que es va decidir treballar durant 8h d’incubació ja que s’arribava a l’equilibri i a més resultava un temps òptim per comoditat a l’hora de realitzar els assajos. En aquest aspecte s’afegí la necessitat de controlar la temperatura on s’observà una major variació treballant overnight. Per això es decidí treballar durant el dia, amb variació de temperatura de 2ºC (24-26ºC).

Es decidí treballar amb agitació constant durant els assajos, encara que arran dels assajos de significança, només existeixen diferències significatives per al propranolol.

Les condicions d’elevada humitat permeteren dur a terme tots els experiments sense que es produís evaporació.  

4. Resultats i discussió  

4.2.  Estudi  de  la  difusió  passiva  dels  patrons  seleccionats   4.2.1.  Obtenció  de  les  corbes  de  calibrat    

S’obtingueren les corbes de calibrat amb patrons de concentració en els diferents medis tamponats:

Figura 4.2.1.1. Corbes de calibrat estàndard de la carbamazepina i el propraolol en diferents tampons

Per mitjà de l’anàlisi per regressió s’obtingueren els paràmetres de les rectes.

Taula 4.2.1.1. Paràmetres de les rectes de calibrat

Producte Tampó N R² Pendent σ

Carbamazepina

PBS 8 0,9950 7,34·10^-3 1,96·10^-4

TRIS 8 0,9978 8,67·10^-3 1,53·10^-4

CACO 8 0,9994 8,26·10^-3 7,72·10^-5

Py 6 0,9960 4,39·10^-3 1,25·10^-5

Propranolol PBS 8 0,9902 4,24·10^-3 1,59·10^-4

TRIS 8 0,9954 4,46·10^-3 1,14·10^-4

N: punts de la recta; R²: coeficient de correlació de la recta; σ: desviació estàndard del pendent

0,01 0,1 1 10

1 10 100 1000

Abs (239 nm)

Concentració (µM)

PBS TRIS CACO Py

0,01 0,1 1

1 10 100 1000

Abs (293 nm)

Concentració (µM)

PBS

TRIS

4. Resultats i discussió  

4.2.2.  Estudi  de  la  difusió  passiva  de  patrons  coneguts:  variació  del  medi  

La primera variable de l’assaig fou el mitjà de difusió. Es dugueren a terme una sèrie d’experiments per calcular el log Pe en mitjà neutre (PBS) i àcid (cacodilat). A més s’estudià la influència del tipus de tampó en la penetrabilitat de l’analit. La membrana utilitzada en tots els assajos fou una solució de lecitina en dodecà a l’1,6%.  

4.2.2.1.Difusió  passiva  en  diferent  medis.  Influència  del  pH   Taula 4.2.2.1.1. Log Pe en mitjà neutre i mitjà àcid

Producte Tampó t (h) Agitació T (ºC) Membrana log Pe (mitjana)

N=3

log P_e reportat¹⁵ Carbamazepina PBS

8 SI 25±1 5 µL

lecitina 1,6%

-5,19±0,01 -5,2±0,0

CACO -5,24±0,01 -

Propranolol PBS -5,23±0,04 -5,1±0,0

CACO - -

Taula 4.2.2.1.2. Test F i test t. Avaluació de la influència del pH Producte Tampó log Pe

(mitjana) Assaig F v t_exp tcrit, 2 coes

(α=0,05) H* P (2 coes) Carbamazepina PBS -5,19±0,01

Iguals 4 5,90 2,78 1 0,4%

CACO -5,24±0,01

Els valors obtinguts per als patrons amb PBS coincideixen amb les dades bibliogràfiques. El test t per a l’estudi de dues mostres amb variàncies iguals indica que es tracta de valors diferents. D’aquesta manera per al patró carbamazepina existeix una diferència significativa per al valor de permeabilitat. D’altra banda per al segon patró s’observa una diferència major.

Mentre s’obté un valor de log Pe en mitjà PBS (7,48) , en passar a condicions àcides (Cacodilat, pH 5,48) no s’observa difusió.

4.2.2.2  Difusió  passiva  en  diferents  tampons.  Interferència  del  tampó  

Per estudiar la possible influència del tipus de tampó en la penetrabilitat, s’estudià la difusió en dos tampons alternatius, TRIS i piridina, neutre i àcid respectivament:

Taula 4.2.2.2.1. Log Pe en diferents tampons neutres i àcids

Producte Tampó t (h) Agitació T (ºC) Membrana

log Pe (mitjana)

N=3

σ

Carbamazepina

PBS

8 SI 25±1 5 µL

lecitina 1,6%

-5,19 0,01

TRIS -5,26 0,05

CACO -5,24 0,01

Py -4,90 0,02

4. Resultats i discussió  

Taula 4.2.2.2.1. (continuació)

Propranolol

PBS

8 SI 25±1 5 µL

lecitina 1,6%

-5,23 0,04

TRIS -5,28 0,03

CACO - -

Py - -

Taula 4.2.2.2.2. Test F i test t. Avaluació de la influència del tipus de tampó Producte Tampó log Pe

(mitjana) Assaig F texp v tcrit, 2 coes

(α=0,05) H P (2 coes) Carbamazepina

PBS -5,19±0,01

Diferents 3,13 3 3,18 0 5,2%

TRIS -5,26±0,05 CACO -5,24±0,01

Diferents 23,28 2 4,30 1 0,2%

Py* -4,90±0,02 Propranolol PBS -5,23±0,04

Iguals 1,78 4 2,78 0 15%

TRIS -5,28±0,03

*La carbamazepina presenta baixa solubilitat en Py al 5% DMSO

Si es compara la influència del tampó en mitjà neutre, PBS i TRIS, tant per un patró com l’altre no s’obtenen diferències significatives. Cal destacar però que això no es pot concloure de forma inequívoca ja que les probabilitats d’equivocació són lleugerament elevades, especialment en el cas del propranolol.

D’altra banda, en el cas de la carbamazepina en mitjà àcid, s’observa que la difusió de l’analit, a més de veure’s influïda pel pH, hi està pel tipus de tampó, obtenint-se major penetrabilitat en el cas de la piridina.

4.2.2.3.  Difusió  passiva  en  gradient  de  pH  

Aprofitant la versatilitat de la tècnica es realitzà un estudi treballant en gradient de pH, això és, treballar amb solucions donadores en medi tamponat neutre i fer-les difondre cap a solucions acceptores àcides i viceversa

Taula 4.2.2.3.1. Log Pe en gradient de pH

Producte Gradient t (h) Agitació T (ºC) Membrana

log Pe (mitjana)

N=3

σ

Carbamazepina

PBS → CACO

8 SI 25±1

5 µL

lecitina 1,6% -5,21 0,05

CACO → PBS 5 µL

lecitina 1,6% -5,07 0,04

Propranolol

PBS → CACO

8 SI 25±1

5 µL

lecitina 1,6% -4,90 0,05

CACO → PBS 5 µL

lecitina 1,6% - -

4. Resultats i discussió  

Taula 4.2.2.3.2. Test F i test t. Avaluació de l’efecte de la direcció del gradient

Producte Tampó log Pe

(mitjana) Assaig F texp v tcrit, 2 coes

(α=0,05) H P (2 coes) Carbamazepina PBS → CACO -5,21±0,05

Diferents 4,35 4 2,78 1 0,6%

CACO → PBS -5,07±0,04

En sotmetre als patrons a difusió en gradient de pH s’observa que ambdós difonen de medi neutre a àcid. En canvi, com en el cas de medi àcid (Taula 4.2.2.1.1.) la carbamazepina difon cap a mitjà neutre però no ho fa el propranolol.

En aquest cas, per a la carbamazepina, els valors de penetrabilitat en gradient de pH són significativament diferents, de manera que el gradient influeix en el log Pe.

Taula 4.2.2.3.3. Test F i test t. Efecte de la presència de gradient Producte Gradient log Pe

(mitjana) Assaig F t_exp v tcrit, 2 coes

(α=0,05) H P (2 coes)

Carbamazepina

PBS -5,19±0,01

Diferents 1,15 3 3,18 0 16,6%

PBS → CACO -5,21±0,04 CACO -5,24±0,01

Iguals 1,43 4 2,78 0 11,4%

PBS → CACO -5,21±0,04 PBS -5,19±0,01

Diferents 4,38 2 4,30 1 2,4%

CACO → PBS -5,07±0,04 CACO -5,24±0,01

Iguals 6,82 4 2,78 1 0,1%

CACO → PBS -5,07±0,04 Propranolol PBS -5,23±0,04

Diferents 8,68 4 2,78 1 0,05%

PBS → CACO -4,90±0,05

En comparar els valors de difusió en gradient amb els corresponents sense gradient, s’observa variació significativa per a la carbamazepina passant de medi àcid a neutre. D’altra banda, la major diferència s’observa per al propranolol, on la difusió augmenta en tres dècimes logarítmiques respecte l’assaig sense gradient.  

4.2.3.   Estudi   de   la   difusió   passiva   de   patrons   coneguts:   variació   de   la   composició   de   la   membrana  

4.2.3.1.  Estudi  microscòpic  de  l’estructura  interna  de  la  membrana  dels  pous  donadors   Es va dur a terme un estudi microscòpic de l’estructura de la membrana artificial de la placa donadora fabricada per Millipore^® ja que, degut a patents, la corporació no proporciona informació detallada de la instrumentació que conforma el sistema PAMPA, només indica que es tracta d’un polímer. Per això es prengueren imatges amb el microscopi electrònic d’escombratge (SEM, Scanning Electron, Microscope) dels Serveis Cientificotècnics de la UIB, juntament amb un anàlisi elemental.

4. Resultats i discussió  

Com s’observa a la figura 4.2.3.1.1., la imatge a sembla tractar-se d’un polímer altament fluorat (vegi’s l’anàlisi elemental), s’observa un entramat irregular, el qual dóna lloc a diàmetres de porus i canals dins la xarxa de diferent mida. Suportat sobre el polímer pareix observar-s’hi una capa de sals, en base als pics més intensos podria tractar-se de NaCl conjuntament amb Na3PO4.

Figura 4.2.3.1.1. Fotografies SEM y anàlisi elemental de la membrana dels pous donadors a) Imatge SEM del polímer, amb diàmetre de porus irregular. L’anàlisi elemental indica alt contingut en F i C. b) Imatge SEM d’una secció de la membrana, s’observen restes d’agulles cristal·lines sobre la base polimèrica. L’anàlisi elemental mostra elevat contingut en O, P, Na i traces de Cl.

4.2.3.2.  Difusió  passiva  amb  variació  dels  components  de  membrana  

Es dugué a terme un estudi amb els patrons en PBS, i condicions estandarditzades de temps, agitació i temperatura. Es varià la composició de la solució que impregna la membrana, utilitzant la solució de lecitina en dodecà a l’1,6%, dodecà sol, MeOH sol i sense afegir-hi cap component, és a dir emprant la membrana intacta sense cap tractament d’impregnació.

a

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

keV 0

2 4 6 8 10

cps/eV

C O F Na P Cl

Cl

b

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

keV 0

1 2 3 4 5 6

cps/eV

C O F Na P Cl

Cl

4. Resultats i discussió  

Taula 4.2.3.2.1. Log P_e en diferents components de membrana

Producte tampó t (h) Agitació T (ºC) Membrana

log Pe (mitjana)

N=3

σ

Carbamazepina PBS 8 SI 25±1

5 µL lecitina 1,6% -5,19 0,01

Dodecà -5,16 0,02

MeOH -4,53 0,05

Sense - -

Propranolol PBS 8 SI 24-26

5 µL lecitina 1,6% -5,23 0,04

Dodecà -4,98 0,03

MeOH -4,76 0,04

Sense - -

Taula 4.2.3.2.2. Test F i test t. Efecte del tipus de membrana Producte Membrana log Pe

(mitjana) Assaig F t_exp v tcrit, 2 coes

(α=0,05) H P (2 coes) Carbamazepina

5 µL lecitina

1,6% -5,19±0,01

Desigual 2,04 4 2,78 0 11%

Dodecà -5,16±0,02 Propranolol

5 µL lecitina

1,6% -5,23±0,04

Igual 8,35 4 2,78 1 0,1%

Dodecà -4,98±0,03

En ambdós casos, l’aplicació de MeOH, dissolvent molt polar suposa un increment de fins a una unitat logarítmica en la capacitat de penetrabilitat dels analits. D’altra banda, sense aplicació de cap tipus de solució, els patrons no són capaços de travessar la barrera salina dipositada sobre el polímer.

Comparant les dades de lecitina a l’1,6% i dodecà, s’observa un increment de la penetrabilitat significatiu per al cas del propranolol i una variació no significativa per al cas de la carbamazepina. Aquest lleuger augment pot ser indicatiu d’una certa repulsió entre el propranolol i els fosfats de membrana incorporats a la solució de dodecà.

4. Resultats i discussió  

4.3.  Estudi  de  la  difusió  passiva  d’esquaramides  bioactives  

4.3.1.  Esquaramides  bioactives  analitzades  

Figura 4.3.1.1. Estructura de les esquaramides analitzades

Entre els productes analitzats hi trobem variació a les cadenes laterals, amb distint grau de lipofília i substitució de l’amida. Els macrocicles analitzats són el C2 i el C2 marcat amb un fluoròfor.

Es va procedir de forma anàloga als patrons. En primer lloc s’elaboraren les rectes de calibrat de les esquaramides analitzades per, a continuació, procedir amb l’estudi de la difusió passiva d’aquestes en les condicions esmentades anteriorment per als patrons.

Així mateix, per a comprovar que el mètode es duia a terme correctament cada assaig amb producte contenia a la vegada un assaig amb un patró conegut (carbamazepina o propranolol indistintament).

7  

C2BDP C2

A25 A47

A56

5  

A57

3  

A58 A59

4. Resultats i discussió  

4.3.2.  Obtenció  de  les  corbes  de  calibrat    

S’exposen a continuació únicament les rectes de calibrat per aquells productes que presentaren difusió passiva als assajos PAMPA.

Figura4.3.2.1. Corbes de calibrat estàndard de l’A57 i l’A58 en diferents tampons Taula 4.3.2.1. Paràmetres de les rectes de calibrat

Producte Tampó N R² Pendent σ

A57

PBS 8 0,9998 1,30·10^-2 7,35·10^-5

TRIS 8 0,9993 1,33·10^-2 1,29·10^-4

CACO 8 0,9990 1,73·10^-2 2,06·10^-4

Py 7 0,9997 1,41·10^-2 1,03·10^-4

A58 PBS 8 0,9993 1,48·10^-2 1,48·10^-4

TRIS 8 0,9990 1,64·10^-2 1,93·10^-4

0,01   0,1   1   10  

1   10   100   1000  

Abs  (293  nm)  

Concentració  (μM)  

PBS   TRIS   CACO   Py  

0,01   0,1   1   10  

1   10   100   1000  

Abs  (293  nm)  

Concentració  (μM)  

PBS   TRIS