Facultat de Ciències
Memòria del Treball de Fi de Grau
Estudi de l'efecte de les protein-fosfatases PP2C sobre el creixement d'Arabidopsi en
regadiu i sequera
Jaume Vives Roca Grau de Biologia
Any acadèmic 2015-16
DNI de l’alumne: 41538179H
Treball tutelat per Jaume Flexas Sans Departament de Biologia
L’autor no autoritza l’accés públic a aquest Treball de Fi de Grau.
Paraules clau del treball:
Sequera, dobles mutants, creixement, LMA, PP2C, fotosíntesis, ABA, conductància estomàtica,
ÍNDEX
AGRAÏMENTS I APROFITAMENT ... 1
RESUM ... 2
INTRODUCCIÓ ... 3
OBJECTIUS ... 5
MATERIAL I MÈTODES ... 6
4.1 Material vegetal ... 6
4.2 Disseny experimental. ... 7
4.3 Mesures de biomassa ... 8
4.3.1 Mesures no destructives de la biomassa ... 8
4.3.2 Mesures destructives de la biomassa ... 8
4.4 Estadística ... 9
RESULTATS ... 10
DISCUSIÓ ... 17
CONCLUSIONS ... 19
BIBLIOGRAFIA ... 20
1 AGRAÏMENTS I APROFITAMENT
La preparació i desenvolupament del present estudi i posterior redacció ha estat un dels treballs clau en el transcurs del grau en Biologia. Gràcies a aquest treball he pogut introduir-me dins una de les facetes més importants de la ciència, la investigació. Per una banda, experimentar la part amarga d’experiments fallits, però d’altra banda contrària veure la finalització d’un projecte tant gratificant. A més, el fet de realitzar aquest estudi tant innovador en l’àmbit de la fisiologia vegetal i dins un dels grups d’investigació pioners en aquest camp, m’ha suposat un gran repte i orgull.
Agraeixo, en primer lloc, el meu tutor el Dr. Jaume Flexas per el suport, supervisió i transmissió de coneixements durant tot el desenvolupament del treball. Voldria agrair també molt especialment als Dr. Cyril Douthe i Dr. Jorge Gago, per el suport, ajuda, col·laboració i participació durant tot l’estudi. Sense oblidar-me de l’ajuda i consells que m’han aportat tots i cada un dels integrants del Grup de Recerca en Biologia de les Plantes en Condicions Mediterrànies, fins al punt de fer-me sentir un investigador més en el grup.
2 RESUM
La sequera és l’estrès ambiental més important en agricultura a tot el món i millorar el rendiment de les plantes en condicions de dèficit d’aigua és un objectiu important per a la Fisiologia Vegetal. Per una banda, un dels objectius per millorar el rendiment de les plantes baix condicions de sequera són les Aquaporines (AQP) . Aquestes, juguen un paper important en el control de la permeabilitat de les membranes al CO2. Més concretament, els mutants que expressen NtAQP exhibeixen una major conductivitat hidràulica per les arrels (lpr) i un increment en la difusió de CO2 a través de les cèl·lules del mesòfil (gm), el resultat del qual es veu reflectit en l’increment de la fotosíntesis. Per altre banda, els mutants PYLA194T la mutació els quals permet estables complexos amb les proteïnes fosfatases 2C(PP2C) on aquestes exerceixen un paper fonamental en la sensibilitat a l’hormona ABA, que condueix a la regulació de l’obertura estomàtica, el que en termes fisiològics es el mateix a dir que aquesta mutació indueix baixa conductància estomàtica (gs), el qual permetria un important estalvi d’aigua. En el present estudi, s’obtingueren dues línies dobles mutants per promocionar l’acció conjunta d’aquestes dues mutacions. Es varen prendre mesures de creixement durant el desenvolupament de les plantes. No obstant, en els resultats en general no s’observaren importants diferències en els paràmetres estudiats dins dels diferents genotips. Amb la finalitat de poder explicar el baix efecte dels resultats d’aquest experiment, caldrà esperar a l’anàlisi de les dades moleculars, així com dels resultats d’intercanvi de gasos.
3 INTRODUCCIÓ
En els darrers anys , la població mundial ha crescut a un ritme continuat, fins a arribar als 7000 milions d’habitants, i continuarà augmentant segons les previsions fins a uns 9.000 milions en 2050, el que donarà lloc a un augment en la demanda d’aliments. A més, les prediccions sobre el canvi climàtic apunten cap a un augment de la duració i intensitat de les sequeres durant el segle XXI, associades a un règim més irregular de les precipitacions i amb temperatures mes extremes i en general més càlides (IPCC 2013).
Tot això implica la necessitat d’abastir amb aliments a tots els habitants per a combatre la fam. Les estimacions actuals de la FAO (2011) indiquen que caldrà incrementar la producció d’aliment un 70% durant el pròxim segle, per el que seran necessàries millores en la producció de cultius.
La sequera es l’estrès ambiental més important en agricultura, i s’han fet molts d’esforços per a millorar els cultius i la seva productivitat en condicions de limitació d’aigua. Però encara hi ha una gran bretxa entre els rendiments i l’optimització en condicions d’estrès (Cattivelli et.al. 2008). En els temps actuals, un dels temes de major interès en el camp de la Fisiologia Vegetal és la possibilitat d’incrementar la producció dels cultius a través de millores en el metabolisme de les plantes. Els avanços en el camp de la biotecnologia, així com el coneixement fisiològic i bioquímic de la fotosíntesis (Parry et al. 2013) juntament amb una major a comprensió de les respostes fisiològiques i moleculars de plantes en dèficit d’aigua (Cattivelli et.al. 2008) han de permetre superar aquesta problemàtica. És per això, que en aquests darrers anys els avanços biotecnològics han anat explorant nous camps d’investigació, que inclouen l’estudi d’organismes modificats genèticament (OMG) (Borlaug,2000). Avui en dia, Arabidopsis thaliana i altres plantes model són emprades per a l’estudi dels processos bàsics del metabolisme vegetal, la millora dels quals podria posteriorment ser traslladada a cultius i demés plantes d’interès humà. Minimitzar la bretxa i augmentar l’estabilitat i el rendiment en diferents condicions d’estrès és d’importància estratègica per a garantir aliments per el futur (Cattivelli et al. 2008).
L’àcid abscísic (ABA) és reconegut com a un regulador hormonal crític en la regulació de l’obertura estomàtica com a resposta de les plantes a l’estrès biòtic i abiòtic. Per tant, es considera que juga un paper fonamental en la resposta de les plantes a l’estrès hídric. (Cutler et.al. 2010) Tant la biosíntesi com les vies de senyalització de l’ABA poden ser considerats com a possibles objectius per millorar el rendiment de les plantes baix condicions de sequera. Alguns exemples són coneguts, com els mutants d’Arabidopsis thaliana: La mutació PYLA194T en un dels dos subtipus de receptors d’ABA, permet estables complexos amb les proteïnes fosfatases de tipus 2C (PP2C) fins i tot en absència d’ABA (Pizzio et al.2013). D’aquesta manera els receptors d’ABA interactuen amb alta afinitat inhibint la cascada d’activació de les PP2C en presència d’ABA (Rubio et.al. 2009) . Per tant, PP2C és un objectiu fisiològicament rellevant per dissenyar receptors PYL que mostrin una major interacció que afecti a la senyalització d’ABA i a la resposta a l’estrès de la planta. Aquests mutants podrien resultar en un grau permanent de semi-tancament estomàtic, el que en termes fisiològics es el mateix a dir que indueix baixa conductància estomàtica (gs), el qual permetria un important estalvi d’aigua (Pizzio et al.2013).
4 Mentre els mecanismes de tancament estomàtic en condicions de deficiència d’aigua són coneguts (Mori i Schoeder 2004), els mecanismes que condueixen canvis en la conductància hidràulica de les arrels en condicions de sequera són encara poc estudiats (Mahdieh, et al. 2008). Les aquaporines (AQPs) són proteïnes integrals de membrana que augmenten la permeabilitat de les membranes a l’aigua, així com altres molècules petites com ara el CO2, glicerol, silici i bor (Tyerman, et al. 2002; Kaldenhoff, et al .2007; Maurel, et al. 2008). L’evidència suggereix que PIP1 AQPs juguen un paper important en el control de la permeabilitat de les membranes a CO2, controlant d’aquesta manera la fotosíntesis neta (AN) (Flexas et.al. 2006), a més de l’equilibri hidràulic de tota la planta (Sade et al. 2010). Més concretament l’aquaporina NtAQP1 va demostrar controlar l’equilibri d’aigua i AN en plantes de tomàquet (Solanum lycopersicum) que sobreexpresaven NtAQP1 sota l’efecte del promotor constitutiu 35S (Sade et.al. 2010). Aquestes plantes exhibeixen major conductància estomàtica, una major taxa d’AN i una major conductivitat hidràulica per les arrels (Lpr) baix condicions de estrès salí. Estudis addicionals en que es localitzar NtAQP1 varen donar suport a la idea que actua com un canal d’aigua (Pantin,et al, 2013). A més, NtAQP1, es un gen induït sota el control de l’ABA (Siefritz et.al. 2001). Finalment van revelar la importància en la difusió de CO2 a través de les cèl·lules del mesòfil (gm), i la seva vinculació directe en l’increment de la AN (Flexas, et.al. 2006).
En el present treball, s’obtingueren dues línies dobles mutants per promocionar l’acció conjunta d’aquestes dues mutacions. Per una banda, disminuint la gs, augmenta l’estalvi d’aigua. I per altre banda, augmentant la gm ,augmenta la fotosíntesis. Així doncs, incrementar la fotosíntesis i a la vegada l’eficiència en l’ús d’aigua (AN/gs),que al mateix temps s’ha demostrat que depèn del quocient gm/gs (Flexas et.al. 2014). Aquest constitueix un nou enfocament per conferir resistència a la sequera, el qual s’espera que ajudi a millorar el creixement en aquestes condicions.
5 OBJECTIUS
A) Objectiu principal: Avaluar la potencialitat de millora en productivitat de plantes mitjançant la modificació d’aquaporines i estomes en condicions de sequera
B) Objectius específics:
1. Estudiar i comparar el creixement de mutants d’Arabidopsis thaliana alterades en el contingut de les proteïnes PP2C, de l’aquaporina NtAQP1 i ambdues.
2. Analitzar si l’acció conjunta de les dues mutacions produeix algun efecte positiu, negatiu o nul sobre el creixement de les plantes.
6 MATERIAL I MÈTODES
4.1 Material vegetal
Es varen utilitzar plantes de la espècie Arabidopsis thaliana genotip Columbia amb diferents mutacions obtingudes en experiències prèvies: les línies mutants simples correspongueren a les línies AQP i PYL. La primera d’elles conté la sobreexpressió de la proteïna NtAQP1 (es va emprar el mutant simple AQP utilitzat per, Sade et.al. 2013), mentre que la línia PYL, la mutació PYLA194T es caracteritza en mantenir complexes estables amb les proteïnes fosfatases 2C( PP2C) en absència d’ Àcid Abscísic (ABA) tal i com va descriure Pizzio et al. (2013) pels mutants simples PYL. A més també s’utilitzaren plantes de genotip wild type (Wt) com a línia control (Taula 1).
A partir del creuament entre les línies simples mutants descrites anteriorment, es varen obtenir diferents línies dobles mutants, de les quals es varen seleccionar 2 línies (T3 i T10) en base a les mutacions sobre les proteïnes NtAQP i PP2C, segons una avaluació preliminar feta en experiències prèvies (Flexas et.al., dades no publicades).
No mutant (control) Simples mutants Dobles mutants
Col.-Wt ×
AQP ×
PYL ×
T3 ×
T10 ×
Taula 1. Esquema de les línies d’estudi amb les mutacions característiques
Per totes les línies de l’estudi, es varen posar a germinar 24 llavors de cada línia en alvèols de sembra amb substrat hortícola i perlita en proporció 4:1 prèviament esterilitzat (autoclau a 120ºC durant una hora). Passats els 15 dies després de la germinació es varen seleccionar i posteriorment trasplantar les plantes mes homogènies intra-línea. El trasplant es va realitzar agafant la planta seleccionada amb una cullera intentant agafar el màxim superfície de sòl, evitant rompre arrels. Finalment es varen obtenir un total de 16 repliques per línia, diferenciant ser trasplantades o no.
Figura 2: Alvèols de sembra amb substrat hortícola i perlita (4:1) on es va dur a terme el creixement de les plantes.
7 Tant la germinació de les llavors com tot l’experiment en si es va dur a terme en una càmera de cultiu en condicions de temperatura, llum i reg controlat (25ºC, PAR 100-150 μmol m-2s-1, 12h llum/12h obscuritat)(Flexas et.al.2007). Totes les plantes es varen regar a capacitat de camp durant els primers quinze dies, deixant al voltant de 4cm d’aigua destil·lada durant dues o tres hores en la cubeta. A partir dels quinze dies es va regar en solució Hoagland’s al 50% (Hoagland & Snyder, 1933) dues vegades per setmana per assegurar que no hi havia limitació de creixement per falta de nutrients.
Figura 3: Camara de cultiu en condicions controlades
4.2 Disseny experimental.
L’experiment es va dur a terme amb un total de 5 línies: 2 mutants simples, dos dobles mutants i una línia control no mutant (Taula 1). El temps de creixement de les plantes va esser de 45 dies on totes les línies mutants varen créixer en igualtat de condicions. Durant el creixement es varen prendre fotografies de totes les plantes en interval de 7-10 dies. D’aquesta manera s’obtingué un recopilatori d’imatges que va permetre calcular l’àrea foliar a diferents dies (Figura 6).
Es varen separar el nombre total de plantes en dos tractaments diferenciats. Per una banda, el tractament control o regat amb un total de 8-12 rèpliques per línia mutant.
Per altre banda, el tractament de sequera amb 4-6 rèpliques per línia respectivament. Es seleccionaren les plantes en les que se l’havia d’aplicar sequera tres dies abans de les mesures experimentals, durant els quals cada dia es pesaren les plantes i es controlà la pèrdua del contingut hídric del substrat.
8
4.3 Mesures de biomassa
4.3.1 Mesures no destructives de la biomassa
Abans de començar amb les proves destructives, és a dir, aquelles que condueixen a la mort de la planta, es prengueren fotografies de la rosseta per determinar l’àrea foliar per a cada línia i tractament. A més, es va poder analitzar que, el fet de que la planta Arabidopsis tingui un creixement en rosseta implica que moltes de les fulles es solapin una amb les altres (Leister et.al. 1999). Per tal de solucionar aquest problema, es varen agafar 3 o 4 rèpliques per a cada línia i tractament i es va desarticular la rosseta, fulla per fulla. Després, es prengueren fotografies de cada una d’aquestes.
Finalment, es va procedir a realitzar el càlcul del quocient àrea de la rosseta/ àrea de la rosseta desarticulada. L’àrea foliar es determinà a partir de imatges amb el programa informàtic Image J (Wayne Rasband/NIH, Bethesda, MD, EE.UU.).
El paràmetre RGR (relative growth rate) és el que es fa servir més sovint per al seguiment del creixement, però és un paràmetre destructiu (Mohamed et.al. 2004). Per tal d'evitar fer mesures destructives, hem fet servir un seguiment fotogràfic que ens permet estimar l'increment de l'àrea foliar de la roseta en el temps, que equivaldria al leaf expansion rate (LER). Cal notar que, es va considerar l’equació: RGR = LER x LMA. Llavors, si LMA (leaf mass area) fos constant (LMA=1) i igual en tots els genotips i tractaments, les variacions relatives observades en el LER serien equivalents a variacions de RGR (RGR=LER). Però els valors de LMA no són constants (veure apartat de resultats). Per tant, els valors de RGR que es presenten a l’apartat de resultat s’han estimat a partir de l’equació:
( ) ( ) ( ) ( )
On LMA D es la massa d’una mostra per unitat d’àrea. Àrea 1 i àrea 2 fan referència a l’àrea foliar en el moment T1(temps 1) i T2 (temps 2) respectivament.
4.3.2 Mesures destructives de la biomassa
En primer lloc es va procedir a obtenir el pes fresc de la rosseta dins una balança de precisió. Seguidament, amb l’ajuda d’un traucador d’àrea coneguda es va obtenir i pesar una mostra de cada línia, després aquesta mostra es va introduir en aigua destil·lada durant 48h a 4ºC dins una nevera (Mayak et.at.2004). Passades les 24h es tornaren a pesar les mostres per a obtenir-ne el pes turgent. Finalment, les mostres es varen col·locar juntament amb la rosseta dins un forn d’assecat a 60ºC fins a assolir un pes constant, estimant-se la seva massa seca.
Amb les dades obtingudes es va calcular la biomassa total fresca i seca, el contingut relatiu d’aigua en les fulles ( RWC) i el pes sec foliar per àrea ( LMA):
9 ( ) ( ) ( )
( ) ( ) ( )
On FM, DM i TM són massa fresca, seca i turgent respectivament en el teixit foliar (Yamasaki et al. 1999). D’altre banda A= àrea foliar (m2) i LW= pes sec de la fulla (g) (Garkoti et al. 2013).
4.4 Estadística
L’anàlisi univariant de la variància (ANOVA) va ser realitzada per a revelar diferències entre les línies mutants i tractaments en les característiques estudiades. Les diferències entre les mitjanes foren elevades mitjançant anàlisis de Tukey (P<0.05).
Aquestes anàlisis van ser realitzades amb el paquet de software estadístic SPSS IBM 22.0 (IBM® SPSS® Statistics, Chicago, IL, EE.UU.)
10 RESULTATS
Analitzats els diferents caràcters fisiològics, tal i com es mostra a la taula 2, s’observà una diferència important entre els distints caràcters. Per començar, s’observen valors significativament superiors de RWC en el tractament control, amb una mitjana de 83.44% respecte al tractament en sequera, amb una mitjana de 77.72%. L’anàlisi estadístic ANOVA (P < 0.05) confirma que aquestes diferències foren significatives entre els tractaments, confirmant d’aquesta manera l’efecte de la sequera. No fou significatiu pel que fa referència a les línies mutants. També es donaren variacions significatives en la massa d’una mostra per unitat d’àrea (LMA D) entre els dos tractaments, essent major els valors en condicions de sequera (Taula 2). Pel contrari, si que es donaren diferències intra-línia, mostrant les línies Wt i PYL els valors mes baixos, i les línies dobles mutants (T3 i T10) els valors mes alts respecte a la mitjana del tractament control. Pel que fa al tractament en sequera, els valors més alts varen ser per la línia T3, AQP i PYL ordenats de major a menor, on aquests mostren variacions significatives en el test de Tukey (P < 0.05) entre totes les línies del tractament control, a més de la línia control Wt del tractament en sequera. També es va calcular el LMA de la Rosseta (LMA R), que com es pot observar a la taula 2, no resultaren diferències significatives entre les diferents línies d’estudi, tot i que si que es trobaren entre els diferents tractaments. No obstant, la fiabilitat de ambdós mètodes s’avaluà mitjançant la baixa correlació entre els valors mitjans obtinguts per a cada mesura, LMA D i LMA R, amb una r2 de 0.15, tal com es mostra a la figura 4.
Figura 4: Correlació de les estimes de la massa d’una mostra per unitat d’àrea (LMA D) i la massa de la rosseta per unitat d’àrea (LMA R) mesurades a totes les línies mutants. Els valors representen la mitjana de les rèpliques per cada línia d’estudi.
El fet que la correlació de ambdós mètodes resultés baixa, va donar peu a seguir investigant sobre aquestes diferències. Així doncs, es varen agafar 6 plantes de cada genotip, i es va procedir a desarticular la rosseta que caracteritza el creixement de la
11 planta Arabidopsis. El resultat fou l’obtenció de totes les fulles de la rosseta disposades individualment.
Figura 5: Rosseta de Arabidopsis thaliana desarticulada
Posteriorment es tornà a analitzar l’àrea que s’ha denominat com “àrea real”, on aquesta es el sumatori de l’àrea de cada una de les fulles individualitzades per planta. Finalment, es tornà a correlacionar els valors de ambdós mètodes descrits:
Figura 6: Correlació de les estimes de l’àrea real de la rosseta i l’àrea de la rosseta mesurades a totes les línies mutants. Els valors representen la mitjana de les rèpliques per cada línia d’estudi.
12 Tal i com s’observa al gràfic, es tornà a analitzar la baixa fiabilitat del mètode usat en l’anàlisi de l’àrea, en comparació a l’anàlisi de l’àrea real, amb una r2 de tan sols 0.20.
Aquests resultats ens indiquen que els canvis relatius dels valors de l’àrea, no segueixen un patró lineal als canvis relatius dels valors de l’àrea real. Aquesta es doncs, l’explicació de la baixa correlació entre el LMA D i LMA R. És a dir, que el fet de que usant el mateix mètode d’anàlisi per al mateix paràmetre, els resultats els quals siguin tant equidistants, es deu al solapament de les fulles de la rosseta en l’anàlisi de l’àrea.
13 Taula 2: Característiques fisiològiques mesurades a totes les línies mutants. Valors del contingut hídric de la fulla (RWC), massa de la rosseta seca per unitat d’àrea (LMA R), massa d’una mostra per unitat d’àrea (LMA D), taxa de creixement relatiu (RGR), Àrea foliar de la rosseta (Àrea), pes sec de la rosseta(DW) i el pes fresc de la rosseta (FW), Són valors mitjans del nombre de rèpliques (n)±SE.
Mutants n
RWC (%)
LMA D (g/m2)
LMA R (g/m2)
RGR (g/d)
Àrea (cm2)
DW (g)
FW (g)
Control
Wt 9 81.17 ± 4.04a 13.85 ± 0.56a 37.33 ± 2.01a 0.15 ± 0.01a 50.21 ± 3.19ab 0.20±0.02ab 2.29±0.14ab AQP 12 85.40 ± 3.02a 14.44 ± 0.79ab 42.65 ± 3.31a 0.15 ± 0.01a 52.16 ± 1.96a 0.23±0.02ab 2.73±0.24b PYL 11 86.33 ± 2.00a 13.23 ± 0.42a 42.18 ± 2.05a 0.13 ± 0.01a 42.41 ± 3.19ab 0.17±0.01a 2.24±0.15ab T3 13 77.41 ± 4.48a 15.39 ± 0.71ab 49.78 ± 3.68a 0.15 ± 0.02a 41.56 ± 2.38ab 0.20±0.02ab 2.30±0.18ab T10 6 86.90 ± 2.52a 16.46 ± 0.71abc 48.23 ± 4.42a 0.15 ± 0.01a 38.52 ± 2.06b 0.18±0.02ab 2.23±0.19ab Mitjana 83.44 ± 3.21a 14.68 ± 0.64a 44.03 ± 3.09a 0.15 ± 0.01a 44.97 ± 2.56a 0.196±0.02a 2.36±0.18a Sequera
Wt 6 69.96 ± 7.60a 17.18 ± 1.17abcd 41.28 ± 1.58a 0.15 ± 0.01a 53.27 ± 5.27ab 0.22 ± 0.02ab 2.00±0.15ab AQP 4 77.81 ± 4.59a 21.65 ± 2.09de 54.76 ± 1.25a 0.14 ± 0.04a 54.00 ± 6.40ab 0.28 ± 0.03b 2.58±0.48ab PYL 4 83.98 ± 2.79a 21.00 ± 1.63cde 51.49 ± 1.69a 0.14 ± 0.03a 47.30 ± 2.20ab 0.24 ± 0.02ab 2.51±0.17ab T3 3 73.69 ± 2.28a 21.94 ± 1.53e 49.84 ± 1.35a 0.16 ± 0.06a 46.71 ± 5.99ab 0.23 ± 0.04ab 1.43±0.26a T10 4 83.16 ± 3.81a 18.83 ± 0.22bcde 51.31 ± 4.53a 0.16 ± 0.05a 44.35 ± 4.07ab 0.22 ± 0.01ab 2.07±0.13ab Mitjana 77.72 ± 4.21b 20.12 ± 1.33b 49.74 ± 2.08b 0.15 ± 0.04a 49.13 ± 4.79a 0.24 ± 0.02b 2.18±0.24a Les lletres en superíndex indiquen diferència significativa (P < 0.05) entre les diferents espècies i grups basat en la prova de comparació múltiple de Tukey per a cadascuna de les característiques.
14 Les diferències no foren significatives (P < 0.05) entre les diferents línies mutants per a la taxa de creixement relatiu (RGR) (Taula 2). Tampoc hi hagué diferències en quan als tractaments aplicats per aquest paràmetre. Així mateix, l’error estàndard fou dues vegades superior en el tractament en sequera, probablement per la falta de nombre de rèpliques.
Figura 7. Seguiment fotogràfic a diferents dies per al càlcul de RGR on s’aprecia un creixement gradual de la rosseta. Els números corresponen als dies diferents en la captura d’imatges, on els números 1,2,3,4,5 corresponen al les edats de les plantes de 24,26,31,37 i 42 dies respectivament. Les línies de colors representen les diferents línies d’estudi
Respecte a l’àrea de la rosseta els valors més baixos foren per les línies dobles mutants T3 i T10, tant pel que fa al tractament control, com per el de sequera. Ambdues no presenten diferències significatives entre si, tot i que sí les presenten front a la línia AQP, on aquest fou el major valor en el tractament control. Mentrestant, no hi hagué diferències intra-línea per el tractament en sequera (Taula 2).
15 Pel que fa al pes sec, l’anàlisi estadístic ANOVA mostrà diferències en el tractament.
En sequera totes les línies mostren un increment en el pes sec en comparació al control.
Tal com indiquen aquests resultats en condicions de sequera aquests genotips obtenen un increment en la matèria seca, el que es tradueix en una millor eficiència fotosintètica.
Per altra banda, no hi hagué diferències en el test de Tukey (P < 0.05), generalment en totes les línies mutats. Exceptuant els casos particulars en les línies AQP en sequera i PYL en condicions control. En el primer cas la quantitat de matèria seca en la rosseta va ser major en totes les línies i tractament. En canvi la línia PYL control va mostrar els valor mes baixos. Finalment l’ANOVA no va mostrar diferències significatives en la interacció línia*tractament (Taula 2).
Per a acabar, els valors de pes fresc foren majors com era de esperar per el tractament control amb una mitjana de 2.36g en comparació al tractament en sequera 2.18g, tot i que l’anàlisi estadístic ANOVA no mostrà diferències significatives. Pel contrari, si que hi hagué diferències significatives entre les línies AQP en condicions control, i T3 en sequera, tot i que també el nombre de rèpliques analitzades per aquetes dues línies fou significativament diferent en nombre.
Correlacions entre caràcters
Realitzada la matriu de correlació de Perason per als 7 paràmetres analitzats i per a les diferents línies mutants descrites en aquest treball (Taula 3), es descriuen tan sols les correlacions significatives a l’anàlisi conjunt. D’aquesta manera, es pot observar en aspectes generals que les correlacions no es mostren molt elevades, valors mínims i màxims de r2 entre 0.28 i 0.67 respectivament. En el cas del pes fresc, aquesta es correlaciona positivament amb una significació lleugerament elevada amb el pes sec, amb una r2 de 0.67. De la mateixa manera el LMA R també mostrà una correlació semblant a la anterior amb el pes sec, amb una r2 de 0.65. En general, els 7 paràmetres analitzats mantenen una correlació positiva amb el pes sec, a excepció de RWC on la correlació resultà negativa, amb una r2= 0.33 respectivament.
16 Taula 3: Matriu de correlació de Pearson dels paràmetres fisiològics a les diferents línies d’estudi. Els valors en negreta indiquen que els coeficients de correlació han estat significatius (P < 0.01) i els valors en cursiva coeficients de correlació significatius (P < 0.05). Les abreviatures dels paràmetres coincideixen amb les de la taula 2.
FW Àrea LMA R LMA D RWC RGR DW
FW 0.41 0.44 0.28 0.67
Àrea 0.39 0.32 0.58
LMA R 0.39 0.65
LMA D 0.35
RWC -0.33
RGR 0.35
DW
17 DISCUSIÓ
NtAQP1 ha estat una de les poques AQP que han estat completament estudiades en la darrera dècada (Sade et.al. 2013). Els primers informes van suggerir que NtAQP1 afecta a la conductància hidràulica de les arrels i a la permeabilitat d’aigua a les arrels, particularment sota condicions d’estrès (Siefritz et al. 2002). Estudis posteriors van revelar la importància en la difusió de CO2 a través de les cèl·lules del mesòfil , i la seva vinculació directe en l’increment de la fotosíntesis neta (Flexas et.al. 2006). Per altra banda, estudis en PYL4A194T han demostrat que valors baixos de conductància estomàtica estan directament vinculats amb una sensibilitat millorada a l’ABA i per tant a l’obertura estomàtica. Com a conseqüència, PYL4A194T indueix baixa transpiració, i en general una millora en l’eficiència en l’ús de l’aigua (Pizzio et al. 2013). En el present treball, s’obtingueren dues línies dobles mutants per a promocionar l’ acció conjunta d’aquestes mutacions. Per una banda, disminuint la gs, augmenta l’estalvi d’aigua. I per altre banda, augmentant la gm ,augmenta la fotosíntesi. Així doncs, incrementar la fotosíntesis i a la vegada l’eficiència en l’ús d’aigua (AN/gs), que al mateix temps s’ha demostrat que depèn del quocient gm/gs (Flexas et.al. 2014). Aquest constitueix un nou enfocament per conferir resistència a la sequera, el qual s’espera que ajudi a millorar el creixement en aquestes condicions.
En els resultats d’aquest treball (Taula 2) en general no s’han observat importants diferències en els paràmetres entre genotips. Pel que fa a les mesures no destructives, com l’àrea de la rosseta i el RGR, no s’han observat diferències entre els genotips ni en resposta a la sequera. Part d’aquesta falta d’efecte pot deures a problemes metodològics derivats del fet que el creixement en rosseta d’Arabidopsis interfereix en l’estima del creixement mitjançant seguiment fotogràfic, com ja s’ha discutit prèviament a l’apartat dels resultats. Més enllà d’aquestes qüestions metodològiques, les mesures finals destructives, en general confirmen que no hi ha hagut efectes importants en el creixement. Per un banda, els valors mes alts en el pes sec (DW) en sequera enfront a les condicions de control, resulten ser uns resultats sorprenents i inesperats. Un efecte comú en les plantes en condicions d’estrès hídric es la reducció de la biomassa fresca i seca (Jaleel et al. 2009).Podria ser que, en Arabidopsis, un cert nivell d’estrés hídric resultés favorable pel creixement, però calen més estudis per confirmar aquest punt. Per altre banda, els valors de LMA D foren significativament superiors en resposta a la sequera en comparació a les condicions control. Aquests resultats concorden amb Poorter et al. (2009), segons els quals les fulles que es desenvolupen baix condicions de sequera, les cèl·lules del mesòfil són més petites, estretes i amb una fracció menor d’espai d’aire, de manera col·lectiva resulta amb en major densitat foliar. Com a resultat, les fulles són més rígides i amb menys tendència al marciment. És a dir, que els valors de LMA augmenten així com disminueix la disponibilitat d’aigua, així com també valors de AN alts doten de valors de LMA alts, vinculats amb alta intensitat lumínica i en general a una vida mes llarga i útil de la fulla (Poorter et al. 2009).
Atenent amb aquests resultats, podria esser que un cert nivell de sequera moderada fos favorable en termes fotosintètics, aíxí com demostra l’increment de pes sec en condicions de sequera (taula 2). Pel que fa a les diferències entre els genotips, el valors de LMA D de PYL varen esser els mes baixos en comparació a les línies dobles mutants (taula 1) on la teoria suggereix que els genotips amb valors baixos de gs obtenen valors de LMA baixos, relacionat amb els genotips amb alta concentració de proteïnes i RWC.
En general, aquests efectes suggereixen un major estalvi d’aigua, com es el cas de PYL.
18 Tot i que el LMA pot esser entès com a part de tot un conjunt de característiques interconnectats que en conjunt forma el rendiment de les plantes (Poorter et.al. 2009), no basta per discernir la manca de l’efecte esperat sobre el creixement en sequera dels genotips especialment dissenyats. Cal esmentar que, aquesta falta d’efecte no es deu a la baixa incidència de la sequera, com demostra la davallada del RWC (Taula 2), tot i que no es descarta la idea que la sequera a la qual es varen sotmetre les plantes d’aquest estudi fos de caire feble o moderada, però no extrema. Aquest fet també podria explicar la falta d’efecte de les respostes fisiològiques dels paràmetres no significatius a la sequera, així com l’àrea de la rosseta, el RGR i el pes fresc (taula 2). Així doncs, caldrà esperar a l’anàlisi de les dades moleculars, així com de intercanvi de gasos per a discernir de forma clara els processos fisiològics descrits en les presents línies dobles mutants, així com si la manca d’efectes esperats es deu a la baixa incidència de la mutació, per tal de seguir avançant amb l’objectiu d’aconseguir genotips més eficients i amb major producció en condicions de falta d’aigua.
19 CONCLUSIONS
A) Objectiu principal: Avaluar la potencialitat de millora en productivitat de plantes mitjançant la modificació d’ aquaporines i estomes en condicions de sequera
1) No s’ha produït una millora en la productivitat entre els genotips avaluats.
Gran part podria deure’s als problemes metodològics derivats del creixement en rosseta d’Arabidopsis thaliana.
2) Part d’aquesta falta d’efecte es pot deure també a la baixa magnitud de la sequera.
B) Objectius específics:
1. Estudiar i comparar el creixement de mutants d’Arabidopsis thaliana alterades en el contingut de les proteïnes PP2C, de la aquaporina NtAQP1 i ambdues.
- Els anàlisis a l’hora d’avaluar millores de producció i biomassa en plantes que han estat modificades genèticament canvia molt en funció del punt de vista fisiològic, molecular, genètic. Els paràmetres avaluats en el present estudi soc escassos per discernir si hi ha diferències en quan al creixement entre els genotips. Per tant, caldrà esperar a estudis posteriors així com l’anàlisi de les dades moleculars i de intercanvi de gasos.
2. Analitzar si l’acció conjunta de les dues mutacions produeix algun efecte positiu, negatiu o nul sobre el creixement de les plantes.
Els paràmetres avaluats en el present estudi soc escassos per discernir si l’acció conjunta de les mutacions produeix efecte sobre el creixement de les línies dobles mutants. Per tant, caldrà esperar a estudis posteriors així com l’anàlisi de les dades moleculars i de intercanvi de gasos. Cal afegir que no es descarta l’idea de que els nivells d’expressió d’una de les proteïnes usades en els dobles mutants, pugui afectar la expressió de l’altre proteïna, i viceversa, afavorint a compensar la inactivació de ambdues proteïnes fins al punt de no afectar al creixement.
20 BIBLIOGRAFIA
Bourlaug N. (2000). Ending world hunger. The promise of biotechnology and the threat of antiscience zealotry. Plant Physiology. 124: 487-490.
Cattivelli L, Rizza F, Badeck FW, Mazzucotelli E, Mastrangelo AM, Francia E, Tondelli A, Stanca AM. (2008). Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to genomics. Field Crops Research 105: 1–14
Cutler SR, Rodriguez PL, Finkelstein RR, Abrams SR .(2010). Abscisic acid:
emergence of a core signaling network. Annu Rev Plant Biol 61: 651–679
Devi F, Garkoti SC, Borah N. (2014). Periodicity of leaf growth and leaf dry mass changes in the evergreen and deciduous species of Southern Assam, India. Ecol Res. 29:
153–165
FAO. (2011). El estado de los recursos de tierras y aguas del mundo para la alimentación y la agricultura.
Flexas J, Ribas-Carbo M, Hanson DT, Bota J, Otto B, Cifre J, McDowell N, Medrano H, Kaldenhoff R .(2006). Tobacco aquaporin NtAQP1 is involved in mesophyll conductance to CO2 in vivo. Plant J 48:427–439
Flexas J, Ortuño MF, Ribas-Carbó M, Diaz-Espejo A, Flórez-Sarasa ID and Medrano H.2007. Mesophyll conductance to CO2 in Arabidopsis thaliana. New Phytologist. 175:
501-511
Flexas J, Diaz-Espejo A, Gago J, Gallé A, Galmés J, Gullías J, Medrano H. (2014).
photosynthetic limitations in mediterranean plants: a review. Environmental and Experimental Botany. 103:12-23
IPCC.(2013). Contribución del grupo de trabajo I al quinto informe de evaluación del grupo intergubernamental de expertos sobre el cambio climático.
Jallel CA, Manivannan P, Wahid A, Faro M, Al-Juburi HJ, Somasundaram R, Panneerselvam R. (2009). Drought Stress in Plants: A Review on Morphological Characteristics and Pigments Composition. International journal of agriculture &
biology. 11(1):100–105
Kaldenhoff R, Bertl A, Otto B, Moshelion M, Uehlein N. (2007). Characterization of plant aquaporins. Methods Enzymol 428:505–531
Leister D, Varotto C, Pesaresi P, Niwergall A, Salamini F. (1999). Large-scale evaluation of plant growth in Arabidopsis thaliana by non-invasive image analysis.
Plant Physyiol. Biochem: 37(9):671-678.
Mahdieh M, Mostajeran A, Horie T, Katsuhara M. (2008). Drought Stress Alters Water Relations and Expression of PIP-Type Aquaporin Genes in Nicotiana tabacum Plants.
Plant Cell Physiol. 49(5): 801–813
21 Maurel C, Verdoucq L, Luu DT, Santoni V.(2008). Plant aquaporins: membrane channels with multiple integrated functions. Annu Rev Plant Biol. 59:595–624
Mohamed EE, Clerkx JM, Ruys J, Koornneef M, Vreugdenhil D.(2004). Quantitative Trait Locus Analysis of Growth-Related Traits in a New Arabidopsis Recombinant Inbred Population Plant Physiology, 135: 444–458
Pantin F, Monnet F, Jannaud D, Costa JM, Renaud J, Muller B, Simonneau T, Genty B (2013). The dual effect of abscisic acid on stomata. New Phytol 197:65–72
Parry MAJ, Andralojc PJ, Scales JC, Salvucci ME, Carmo-Silva AE, Alonso H and Whitney SM. (2013). Rubisco activity and regulation as targets for crop improvement.
Journal of Experimental Botany. 64 (3): 717-730.
PizzioGA, Rodriguez L, Antoni R, Gonzalez-Guzman M, YuntaC, Merilo E, Kollist H, Albert A, Rodriguez PL. (2013). The PYL4 A194T Mutant Uncovers a Key Role of PYR1-LIKE4/PROTEIN PHOSPHATASE 2CA Interaction for Abscisic Acid Signaling and Plant Drought Resistance. Plant Physiol.163, 441-455
Poorter H, Niinemets U, Poorter L,Wright IJ, Villar R.(2009). Causes and consequences of variation in leaf mass per area (LMA): a meta-analysis. New Phytologist . 182: 565–
588
Rubio S, Rodrigues A, Saez A, Dizon MB, Galle A, Kim T-H, Santiago J, Flexas J,Schroeder JI, Rodriguez P. 2009. Triple Loss of Function of Protein Phosphatases Type 2C Leads to Partial Constitutive Response to Endogenous Abscisic Acid. Plant physiology.150:1345-1355.
Sade N, Galle A, Flexas J, Lerner S, Peleg G, Yaaran A, Moshelion M. (2014).
Differential tissue‑specific expression of NtAQP1 in Arabidopsis thaliana reveals a role for this protein in stomatal and mesophyll conductance of CO2 under standard and salt‑stress conditions. Planta. 239(2):357-66
Mayak S, Tirosh T, Glick BR.2004. Plant growth-promoting bacteria that confer resistance to water stress in tomates and Peppers.Plant Science.166:525-530
Siefritz F, Biela A, Eckert M, Otto B, Uehlein N, Kaldenhoff R .(2001). The tobacco plasma membrane aquaporin NtAQP1. J Exp Bot 52:1953–1957
Tyerman SD, Niemietz CM, Bramley H .(2002). Plant aquaporins:multifunctional water solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25:173–194
Yamasak S, Rebello L. (1999). Mesurements of leaf relative water content in Auracaria angustifolia. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 11(2):69-75
