Trombosi hereditària: factor V de Leiden a Illes Mediterrànies

(1)

TREBALL FI DE GRAU

TROMBOSI HEREDITÀRIA: FACTOR V DE LEIDEN A ILLES MEDITERRÀNIES

Maria Rigo Mesquida

Grau de Bioquímica Facultat de Ciències

Any Acadèmic 2019-20

(2)

(3)

TROMBOSI HEREDITÀRIA: FACTOR V DE LEIDEN A ILLES MEDITERRÀNIES

Maria Rigo Mesquida

Treball de Fi de Grau Facultat de Ciències

Universitat de les Illes Balears

Any Acadèmic 2019-20

Paraules clau del treball:

trombofília hereditària, tromboembolisme venós, Factor V de Leiden, freqüència al·lèlica

Nom Tutor/Tutora del Treball Antònia Picornell Rigo

Nom Tutor/Tutora (si escau)

S'autoritza la Universitat a incloure aquest treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línia, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació

Autor Tutor Sí No Sí No

☒ ☐ ☒ ☐

(4)

(5)

1

Resum

La trombofília és un desequilibri en l’hemostàsia que provoca un increment en el risc a desenvolupar un trombe venós o arterial, és a dir, la formació de coàguls o trombes que obstrueixen les venes o artèries. El tromboembolisme venós, en particular, és un trastorn en el qual es produeix una coagulació anormal de la sang a les venes profundes del cos. Aquest trastorn pot ser causat tant per factors hereditaris com ambientals. Dins els factors hereditaris, un dels més importants és el Factor V de Leiden, una mutació al gen del Factor V que provoca una resposta anticoagulant deficient a la proteïna C activada, produint d’aquesta manera una major generació de trombina. En aquest treball es pretén estudiar la freqüència del Factor V de Leiden a algunes illes mediterrànies i comparar-la amb poblacions del seu entorn geogràfic fent un recull bibliogràfic, així com el risc que suposa de cara a la trombosi venosa. Es van genotipar 106 mostres provinents de l’illa de Sicília i 43 mostres de l’illa d’Eivissa mitjançant una PCR al·lelo-específica per determinar la freqüència al·lèlica. Els resultats que es van obtenir indiquen que les freqüències més elevades es troben a Europa oriental. Per tant, es pot deduir que la mutació s’hauria originat a l’Orient Mitjà i s’hauria estès cap a Europa. També cal mencionar que per qüestions de deriva genètica, les illes poden de presentar freqüències al·lèliques més elevades, però a aquest estudi no s’ha observat. A més, amb les dades recollides s’ha calculat que augmenta el risc a patir un tromboembolisme venós unes 5 vegades en individus heterozigots en comparació a la població general. Per tant, amb aquest estudi s'ha pogut elucidar l’origen geogràfic del Factor V de Leiden i la seva influència en l’aparició de la trombosi venosa.

Abstract

Thrombophilia is an imbalance in hemostasis that causes an increased risk of developing a venous or arterial thrombus, that is, the formation of clots or thrombi that clog veins or arteries. Venous thromboembolism is a disorder in which abnormal blood clotting occurs in the deep veins of the body.

This disorder can be caused by both hereditary and environmental factors. Among the hereditary factors, one of the most important is Factor V Leiden, a mutation in the Factor V gene that causes a deficient anticoagulant response to activated protein C, thus producing increased thrombin generation. The aim of this work is to study the frequency of Factor V Leiden in some Mediterranean islands and compare it with populations in its geographical environment by making a bibliographic collection, as well as the risk posed by venous thrombosis. 106 samples from the island of Sicily and 43 samples from the island of Ibiza were genotyped using allele-specific PCR to determine allelic frequency. The results obtained indicate that the highest frequencies are found in Eastern Europe.

Therefore, it can be deduced that the mutation originated in the Middle East and spread to Europe. It should also be mentioned that due to genetic drift, islands may have higher allelic frequencies, but in this study, this could not be observed. In addition, the data collected show that the risk of developing venous thromboembolism increases approximately 5-fold in heterozygous individuals compared to the general population. Therefore, this study has elucidated the geographical origin of Factor V Leiden and its influence on the onset of venous thrombosis.

(6)

2

Abreviatures

APC: proteïna C activada DLB: tampó de lisi directe DNA: àcid desoxiribonucleic dNTP: desoxinucleòtid trifosfat EDTA: àcid etilendiamintetraacètic EP: embòlia pulmonar

g: força centrífuga relativa

HMW-K: cininogen d’alt pes molecular LDL: lipoproteïna de baixa densitat PCR: reacció en cadena de la polimerasa SDS: dodecilsulfat sòdic

SNP: polimorfisme d’una sola base TE: Tris-EDTA

TEV: tromboembolisme venós TVP: trombosi venosa profunda VD: ventricle dret

VE: ventricle esquerre

(7)

3

ÍNDEX

1. Introducció ... 4

1.1. Trombofília hereditària ... 4

1.1.1. Hemostàsia ... 4

1.1.2. Fisiopatologia... 6

1.1.3. Factors genètics i adquirits del tromboembolisme venós ... 7

1.2. Factor V de Leiden ... 7

1.3. Altres factors genètics relacionats amb la trombofília hereditària ... 9

2. Objectius ... 10

3. Material i mètodes ... 11

3.1. Mostres ... 11

3.2. Extracció i quantificació de l’àcid desoxiribonucleic ... 11

3.3. Reacció en cadena de la polimerasa al·lelo-específica ... 11

3.4. Electroforesi i interpretació ... 13

3.5. Anàlisi estadística ... 14

4. Resultats i discussió ... 14

4.1. Extracció i quantificació del DNA ... 14

4.2. Posada a punt de la tècnica ... 14

4.3. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden ... 15

4.3.1. Comparació amb altres poblacions ... 16

4.3.2. Factor V de Leiden a població amb tromboembolisme venós ... 20

5. Conclusions ... 25

6. Bibliografia ... 25

(8)

4

1. Introducció

1.1. Trombofília hereditària

La trombofília és un desequilibri en l’hemostàsia que provoca un increment en el risc a desenvolupar un trombe venós o arterial (1), és a dir, els pacients que presenten aquest estat d’hipercoagulabilitat són més propensos a patir trombosi (2).

La trombosi és la formació de coàguls o trombes que obstrueixen les artèries o venes a causa d’un desequilibri entre els factors procoagulants, anticoagulants i fibrinolítics (3). La trombosi pot ser arterial o venosa. A la trombosi arterial, els trombes estan formats per plaquetes i es formen al voltant d’una placa arterioescleròtica, mentre que a la trombosi venosa els trombes estan formats per fibrina i glòbuls vermells (4).

Els factors de risc més importants de la trombosi arterial són la hipertensió arterial, els nivells elevats de colesterol associat a lipoproteïnes de baixa densitat (LDL), el tabaquisme i la diabetis (4). Mentre que la trombosi venosa pot ser adquirida, si hi intervenen factors de risc com l’edat o l’ús de contraceptius orals; o hereditària, si hi intervenen factors genètics (5).

1.1.1. Hemostàsia

L’hemostàsia és un sistema biològic en el qual intervenen diferents elements tant plasmàtics com cel·lulars amb la finalitat de taponar lesions i mantenir la sang dins dels vasos. El sistema d'hemostàsia es divideix en dos: l’hemostàsia primària, on interactuen els vasos sanguinis i les plaquetes; i l’hemostàsia secundària, on actuen els factors de coagulació i els elements cel·lulars (6).

La coagulació sanguínia es pot iniciar pel factor tissular, que s’allibera per un dany a la paret vascular (7); per l’activació de citocines o de cèl·lules endotelials; o per monòcits activats que responen a les lesions vasculars. El cúmul plaquetari inicial del vas es forma i creix cap al centre del lumen del vas, alternant capes de fibrina i glòbuls vermells que queden atrapats entre les capes de plaquetes (Figura 1). A mesura que el trombe creix dins el torrent sanguini, es corba en la direcció del flux i s’estén per tot el lumen. El flux que es troba al voltant del trombe es va fent turbulent i disminueix gradualment (8).

Figura 1. Formació del coàgul.

(9)

5 El sistema de coagulació sanguínia als mamífers consisteix en una cascada d’activació enzimàtica on proteases serines activen les proteïnes (proenzims i cofactors) en la següent fase de la cascada mitjançant una proteòlisi limitada. El resultat final és la polimerització de la fibrina i l’activació de les plaquetes per formar el coàgul de sang. Aquesta coagulació es produeix mitjançant dos mecanismes:

la via extrínseca i la via intrínseca. La via extrínseca és l’única que funciona durant l’hemostàsia normal però ambdues participen en la trombosi. Finalment, ambdues conflueixen formant la via comú (Figura 2) (9).

La via extrínseca comença amb un traumatisme de la paret vascular o dels teixits extravasculars que entren en contacte amb la sang. El teixit que ha sofert el trauma allibera un complex format per diversos factors anomenat factor tissular que funciona principalment com un enzim proteolític.

Llavors, el factor tissular forma un complex amb el Factor VII i, en presència de ions calci, aquest complex activa el Factor X per formar el Factor X activat (10).

La via intrínseca comença quan la sang entra en contacte amb una superfície amb càrrega negativa, com per exemple una plaqueta o un vidre. Això provoca l’activació del Factor XII formant el Factor XII activat i l’alliberació dels fosfolípids plaquetaris a causa del dany que es produeix a les plaquetes.

L’activació del Factor XII es produeix gràcies a l’acció del cininogen d’alt pes molecular (HMW-K) que activa la pre-cal·licreïna per formar la cal·licreïna. La cal·licreïna juntament amb el HMW-K activarà el Factor XII per formar el Factor XII activat. Els fosfolípids plaquetaris contenen el factor plaquetari 3, una lipoproteïna que participarà en les següents reaccions de la coagulació. Després, el Factor XII activat actua sobre el Factor XI i l’activa formant el Factor XI activat. El Factor XI activat llavors activa el Factor IX per formar el Factor IX activat. El Factor IX activat juntament amb el Factor VIII activat, els fosfolípids plaquetaris i el factor plaquetari 3 activen el Factor X per formar el Factor X activat (10,11).

Aquestes dues vies conflueixen formant la via comú que comença amb l’activació del Factor X. El Factor X activat es combina amb els fosfolípids tissulars o plaquetaris i amb el Factor V per formar el complex activador de la protrombina. En presència de Ca²⁺, la protrombina s’activa formant la trombina. La trombina polimeritza les molècules de fibrinogen en fibres de fibrina que formaran el coàgul. Una vegada s’ha format la trombina, aquesta activa el Factor V que a la vegada activarà més la protrombina, de manera que es produeix una retroalimentació positiva (10).

Figura 2. Vies de la coagulació sanguínia. Extreta de Gartner, 2017 (12).

(10)

6 Per regular la cascada de la coagulació hi ha diferents mecanismes anti-trombòtics, com per exemple l’acció que du a terme la proteïna C. La proteïna C és un zimogen que es transforma en la proteïna C activada (APC), una proteasa de serina amb activitat anticoagulant. Per tant, una funció essencial de la APC és reduir el risc a patir trombosi (13).

Aquesta activitat anticoagulant la realitza mitjançant la inactivació proteolítica dels factors V i VIII activats juntament amb l’acció de la proteïna S, diversos lípids, lipoproteïnes d’alta densitat i el Factor V que actuen com a cofactors. La inactivació del Factor V activat evita la generació de trombina a causa d’una o més escissions a les posicions Arg306, Arg506 i Arg679 del Factor V activat. L’escissió de Arg506 es produeix ràpidament, mentre que l’escissió a Arg306 és més lenta, però es requereix per la inactivació completa del Factor V activat. A més, s’ha vist que són necessaris residus carregats positivament situats a la superfície de l’APC per la inactivació ràpida del Factor V activat (14–19).

1.1.2. Fisiopatologia

La tríada de Virchow és la causa principal de la trombosi i inclou: canvis en el revestiment de la paret del vas (danys a la paret), canvis en el flux sanguini (estasi o flux baix) i canvis en els components de la sang (hipercoagulabilitat). Aquests factors afavoreixen la formació de coàguls interrompent l’equilibri dels sistemes de coagulació i de fibrinòlisi (20).

El tromboembolisme venós (TEV) és un trastorn en el qual es produeix una coagulació anormal de la sang a les venes profundes del cos (21). Les seves principals manifestacions clíniques són l’embòlia pulmonar (EP), que es caracteritza per la formació de coàguls que formen èmbols i viatgen als pulmons;

i la trombosi venosa profunda (TVP), que es caracteritza per la formació de coàguls que es formen a les venes de les cames i braços (22,23).

L’embòlia pulmonar es produeix quan un coàgul de sang s’introdueix en la circulació pulmonar (24).

L’impacte i la resposta del ventricle dret (VD) són factors claus en el seu resultat. El VD està format per parets primes i en estat normal bombeja contra una circulació pulmonar i una resistència baixes. La resistència vascular pulmonar està regulada per diversos factors, entre els quals s’inclouen els mecanismes detectors de l’oxigen. Per tant, en l’embòlia pulmonar la post-càrrega del VD pot augmentar de manera aguda no només per l’obstrucció mecànica, sinó també per la vasoconstricció deguda a la hipòxia (25–27). A més, els mediadors inflamatoris com el tromboxà A2 i la histamina que s’alliberen en resposta al coàgul incrementaran encara més la constricció (25).

La capacitat del VD per adaptar-se a aquesta resistència és limitada, sobretot si es compara amb el ventricle esquerre (VE) (28). La disfunció del VD no només es produeix com a resultat de la resistència vascular pulmonar, sinó també com a conseqüència de la disminució de la contractilitat per la isquèmia miocàrdica i l’augment de la pre-càrrega del VD. Aquests processos condueixen a la dilatació del VD que causa un desplaçament del septe interventricular cap al VE, un menor ompliment del VE i un xoc obstructiu (29).

La trombosi venosa profunda es pot definir com la formació d’un coàgul de sang dins una vena profunda. Tot i que es produeix de manera més freqüent a les venes profundes de la part inferior de la cama i la cuixa, també pot aparèixer dins de les venes profundes de les extremitats superiors, venes viscerals i fins i tot de la vena cava (30).

La majoria de TVP es desenvolupen als bessons i s’originen als sinusoides del múscul soli i darrere les vàlvules venoses (31). Els corrents de Foucault que es produeixen quan la sang passa per una vàlvula fomenten la deposició de trombes dins la membrana de la vàlvula (32). Quan s’exerciten els músculs

(11)

7 es produeix una compressió vascular que pot eliminar aquests dipòsits, però també poden ser l’origen de la generació de coàguls de trombina i fibrina (20).

Quan un trombe s’adhereix a l’endoteli, estimula una resposta inflamatòria hiperèmica que inicia processos d’organització. El granuloma envaeix el coàgul que és substituït per teixit fibrós. A més, si aquest trombe es manté lliure dins el lumen, la polimerització i la maduració de la fibrina dins el trombe provoquen que es retregui. Aquesta retracció i organització del trombe condueix finalment a la recanalització i endotelització. Aquest procés destrueix totes les vàlvules del segment afectat de la vena i va acompanyat d’un eixamplament de les venes colaterals (8).

1.1.3. Factors genètics i adquirits del tromboembolisme venós

El TEV és una malaltia multifactorial causada tant per factors hereditaris com ambientals (33).

Els factors hereditaris es poden classificar en cinc grups (34). En el primer grup s’inclouen defectes qualitatius o quantitatius dels inhibidors dels factors de coagulació (deficiències en: antitrombina, proteïna C, proteïna S, cofactor II de l’heparina, inhibidor de la via del factor tissular i trombomodulina).

El segon grup comprèn un augment en els nivells o la funció de factors de coagulació (resistència a la proteïna C activada, Factor V de Leiden, mutació G20210A del gen de la protrombina, disfibrinogenèmia, hiperfibrinogenèmia i nivells elevats dels factors de coagulació VII, VIII, IX i XI) (35–

37). En el tercer grup s’inclou la hiperhomocisteïnèmia. En el quart grup trobem defectes del sistema fibrinolític incloent el plasminogen, l’activador tissular del plasminogen, l’inhibidor de fibrinòlisi activable per trombina, el Factor XIII i la lipoproteïna (a). Finalment, el cinquè grup inclou les alteracions de la funció plaquetària (glicoproteïnes plaquetàries GPIb-IX, GPIa-IIa i GPIIb-IIIa) (35).

Dins els factors de risc ambientals, alguns són no provocats (o no modificables) i d’altres són provocats (o modificables). Els principals factors no provocats són l’edat, el sexe i l’ètnia (23). Encara que el TEV es pot produir a qualsevol edat, es produeix de manera més freqüent a persones majors (38). Aquesta tendència pot ser deguda a un augment de la coagulabilitat sanguínia amb l’edat (39), juntament amb una major prevalença d’altres factors de risc modificables com ara el càncer, el sedentarisme o l’hospitalització (23).

A més, la incidència és més elevada en homes que en dones (38), encara que és un tema controvertit ja que a l’edat adulta les dones tenen més risc a causa de l’exposició hormonal que es produeix, per exemple, durant l’embaràs (38,40). Que la incidència en persones majors sigui més elevada en homes podria ser a causa del diferent estil de vida entre ambdós sexes (38,41).

En quant a les diferències ètniques, alguns estudis realitzats proposen que la incidència seria superior a individus africans (42), però d’altres no han obtingut diferències significatives (43). A més, l’accés a l’assistència mèdica també podria suposar diferències entre les diferents regions, per tant els resultats són controvertits perquè pot ser no es detecten en igualtat de condicions (43).

Per altra banda, els principals factors de risc provocats són l’obesitat, la hipertensió, la diabetis mellitus i l’ús de diferents fàrmacs com els contraceptius orals, l’hormonoteràpia, els corticoesteroides o les estatines (23).

1.2. Factor V de Leiden

El Factor V de Leiden és una mutació al gen del Factor V que provoca una resposta anticoagulant deficient a la proteïna C activada (44,45). Aquest terme es refereix a la substitució específica de guanina per adenina al nucleòtid 1691 del gen del Factor V, de manera que l’arginina situada a la posició 506, que és un lloc d’escissió de l’APC, és substituïda per una glutamina. A causa d’aquesta

(12)

8 substitució, el Factor V activat és resistent a l’APC i es desactiva a una velocitat 10 vegades més lenta del que seria normal, produint una major generació de trombina (46–48).

El Factor V de Leiden és la forma hereditària més comú de trombofília hereditària ja que representa entre el 40 i el 50% dels casos i a més es troba entre el 20 i el 25% de pacients que presenten TEV. La freqüència d’aquesta mutació a la població general varia segons el grup. Mentre que la freqüència d’individus heterozigots és d’un 3-8% en els Estats Units i Europa; en poblacions asiàtiques, africanes i indígenes australianes és molt rara (49). A la Figura 3 es representa la freqüència d’individus heterozigots a distints països europeus recollides a l’estudi d’Hotoleanu, 2016 (50).

Figura 3. Freqüència del Factor V de Leiden a Europa a població normal/a població amb TEV (%). Modificada de Hotoleanu, 2016 (50).

La freqüència de la forma homozigota del Factor V de Leiden en poblacions caucàsiques és aproximadament d’1 de cada 5.000 casos.

L’anàlisi de l’haplotip del gen del Factor V indica que la mutació va ser un únic esdeveniment que va ocórrer fa 20.000-30.000 anys, després de la separació evolutiva dels individus caucàsics dels asiàtics i africans (51). L’elevada prevalença que presenta el Factor V de Leiden a la població caucàsica també fa pensar que hi hauria algun tipus d’avantatge de supervivència associada amb l’estat heterozigot. El lleuger estat protrombòtic que suposa la mutació podria reduir la mortalitat per sagnat durant el part o a causa d’algun trauma en èpoques premodernes (45,51). A diversos estudis, els heterozigots del Factor V de Leiden tenen una pèrdua de sang menor durant les menstruacions, el part o una cirurgia cardíaca. També s’ha vist que els hemofílics greus que són heterozigots pel Factor V de Leiden tenien hemorràgies menys greus (52–54). Tot i això, no s’ha confirmat un benefici evolutiu en la supervivència relacionat amb aquesta mutació (55).

(13)

9 L’expressió clínica de la trombofília associada al Factor V de Leiden és variable. Molts dels individus que presenten aquesta mutació, no arriben a desenvolupar trombosi. La majoria d’individus afectats desenvolupen trombosi a l’edat adulta, però a alguns pot aparèixer abans dels 30 anys (56).

Un 25% dels pacients que tenen per primera vegada un TEV i un 30-50% dels que presenten la malaltia de manera recurrent tenen la mutació (57,58). El risc relatiu a patir el primer TEV augmenta de 3 a 8 vegades en individus heterozigots pel Factor V de Leiden (59,60), mentre que en individus homozigots incrementa de 10 a 80 vegades (61,62). També s’ha vist que en individus heterozigots, el risc a patir TEV de manera recurrent augmenta de 1,4 a 1,6 vegades (63), mentre que en individus homozigots augmenta de 2 a 3 vegades (64) (Taula 1).

Taula 1. Prevalença del Factor V de Leiden a pacients amb complicacions trombòtiques i risc de complicacions trombòtiques en individus heterozigots i homozigots per la mutació.

Complicació trombòtica

Prevalença (%) del Factor V de Leiden en

individus amb TEV

Risc d’individus heterozigots a patir TEV

(oportunitat relativa)

Risc d’individus homozigots a patir TEV

(oportunitat relativa)

Primer TEV 25 3-8 10-80

TEV recurrent 30-50 1,4-1,6 2-3

A més, el risc a patir un TEV també augmenta si es combina el Factor V de Leiden en heterozigosi amb diferents factors ambientals (Taula 2) (55).

Taula 2. Risc a patir TEV en individus que presenten algun factor de risc ambiental i en individus heterozigots pel Factor V de Leiden combinat amb factors ambientals.

Factor de risc ambiental Risc a patir TEV (oportunitat relativa)

Risc a patir TEV combinat amb el Factor V de Leiden (oportunitat relativa)

Obesitat 2,5 8

Contraceptius orals 4 11-41

Teràpia de reemplaçament

hormonal 2-4 7-16

S’ha vist que un 10% dels heterozigots desenvolupen TEV al llarg de la seva vida (59) i que els homozigots tenen més probabilitat de desenvolupar el primer TEV a una edat més jove (56).

Encara que els individus homozigots pel Factor V de Leiden tenen un risc més gran de patir trombosi que els heterozigots, l’episodi trombòlic que es pugui patir no és més greu en els homozigots que en els heterozigots (55).

Finalment, cal mencionar que el Factor V de Leiden pot interactuar amb altres factors de risc genètics i ambientals i promoure la trombosi arterial (65); i també s’ha relacionat amb avortaments en repetició (66).

1.3. Altres factors genètics relacionats amb la trombofília hereditària

Com ja s’ha comentat anteriorment, el Factor V de Leiden no és l’únic factor genètic que pot estar relacionat amb la trombofília hereditària. Altres factors de risc genètics importants són la mutació G20210A de la protrombina; les deficiències en anticoagulants com l’antitrombina, la proteïna C i proteïna S; un augment dels factors de coagulació i la hiperhomocisteïnèmia (67–69).

(14)

10 La mutació G20210A de la protrombina és una mutació puntual a la regió 3’ no traduïda del gen de la protrombina que condueix a un augment dels nivells de protrombina, i per tant, de l’activació de la trombina (70). S’ha identificat a un 3% de la població caucàsica, a un 0,06% de poblacions africanes i asiàtiques i entre un 7 i un 18% en individus amb TEV (70,71). A més, s’ha vist que aquesta mutació en heterozigosi augmenta el risc a patir un TEV unes 3 vegades (70).

Les deficiències en anticoagulants van ser les primeres trombofílies hereditàries que es van identificar (72). En aquest cas, s’han identificat més de 100 mutacions (71). Les deficiències en aquests anticoagulants s’han detectat en un 0,5% de la població caucàsica i en un 2-5% dels individus amb TEV (68,71). L’antitrombina és una glicoproteïna que quan s’uneix a heparina exògena inactiva els factors II (protrombina), X, IX, XI i XII activats (73). Normalment tots els individus que presenten aquesta mutació són heterozigots, ja que en homozigosi provoca la mort abans del naixement (74). En aquest cas el risc a patir un TEV pot augmentar fins a 50 vegades (74–77). En canvi, en una deficiència en les proteïnes C i S el risc augmenta de 4-15 vegades i d’1 a 10 vegades, respectivament (68,77,78).

En quant a l’augment dels factors de coagulació, s’ha vist que un polimorfisme genètic en la proteïna 1 relacionada amb el receptor de lipoproteïnes de baixa densitat (LRP1 663 C > T) està associat amb nivells elevats del Factor VIII en individus heterozigots. Aquests pacients presenten un risc 3 vegades més elevat a patir un TEV (79). També s’han identificat variacions genètiques en el gen del Factor XI i en aquest cas el risc a patir un TEV augmenta unes 2 vegades (80).

Finalment, un altre factor de risc seria la hiperhomocisteïnèmia, un augment dels nivells de homocisteïna a causa d’un deteriorament en la conversió de metionina a cisteïna. Aquest deteriorament pot ser a causa de mutacions en la metilen-tetrahidrofolat reductasa o la cistationina- β-sintasa (67,81). La hiperhomocisteïnèmia pot augmentar el risc a patir un TEV de 1,5 a 2 vegades però el mecanisme no està clar. Podria ser per: activació del Factor V, inhibició de la proteïna C o un deteriorament en la funció de les cèl·lules endotelial, entre d’altres (73).

A més, la combinació d’aquests factors genètics també augmenta el risc a patir TEV (Taula 3) (55).

Taula 3. Risc a patir TEV en individus que presenten algun factor de risc genètic i en individus heterozigots pel Factor V de Leiden combinat amb factors genètics.

Factor de risc genètic Risc a patir TEV (oportunitat relativa)

Risc a patir TEV combinat amb el Factor V de Leiden (oportunitat relativa) Mutació G20210A de la

protrombina 4 20

Hiperhomocisteïnèmia 3-4 22

2. Objectius

L’objectiu d’aquest treball és l’estudi de la freqüència del Factor V de Leiden a les illes de Sicília i Eivissa, la seva comparació amb poblacions del seu entorn geogràfic i el càlcul del risc relatiu que suposa de cara a la trombosi venosa.

(15)

11

3. Material i mètodes

3.1. Mostres

Foren genotipades 106 mostres de Sicília i 43 mostres d’Eivissa. Les mostres d’Eivissa pertanyen a la col·lecció d’àcid desoxiribonucleic (DNA) de poblacions mediterrànies del laboratori de Genètica de la UIB i les de Sicília al Forensic DNA Department del SIMEF (Studio Indagini Mediche e Forensi) (Reggio Calabria, Itàlia). Les mostres foren extretes a partir de sang o mucosa bucal d’individus de la població general i no emparentats entre sí.

A més, es varen emprar 2 mostres de mucosa bucal que s’empraren per extreure DNA que s’utilitzà per a la posada a punt de la tècnica.

3.2. Extracció i quantificació de l’àcid desoxiribonucleic

Es recullen les mostres de mucosa bucal per duplicat emprant un escovilló i passant-lo durant uns 30 segons per l’interior de les galtes i les genives. A continuació, es posa l’escovilló en un tub eppendorf amb 500 μL de tampó de lisi directe (DLB). A cada tub s’afegeixen 50 μL de dodecilsulfat sòdic (SDS) al 10% i 5 μL de Proteïnasa K (20 mg/mL). Les mostres s’incuben al bany Tectron Bio (J. P. Selecta, Barcelona) 37ºC durant tota la nit amb agitació suau. Després s’afegeixen 20 μL de NaCl 5 M, 250 μL de fenol i 250 μL de cloroform:isoamílic (24:1) i s’agita per inversió. Es centrifuga (Centrifuge 5415C - Eppendorf, Hamburg) 10 minuts a 15777 g i es passa la fase aquosa (superior) a un altre tub. Una vegada passats els 10 minuts, s’afegeixen 500 μL de cloroform:isoamílic (24:1), s’agita, es centrifuga amb la mateixa centrífuga durant 10 minuts a 15777 g i es torna passar la fase superior a un nou tub.

Llavors s’afegeix 1 mL d’etanol absolut fred, s’agita i es guarden les mostres a -20ºC durant tota la nit.

Passades les 24 hores, es centrifuga (Minispin - Eppendorf, Hamburg) durant 30 minuts a 11337 g i s’elimina el sobrenedant. Finalment, s’eixuga el precipitat amb la bomba de buit durant 10-15 minuts i es resuspèn el “pellet” amb 20 μL de Tris-EDTA (TE) amb l’ajuda d’un vòrtex.

Després d’unes 2-3 hores d’haver afegit TE a la passa final de l’extracció es pot realitzar la quantificació del DNA amb el quantificador NanoVue Plus (General electric, Boston). Primer s’afegeixen 2 μL de TE per fer el blanc i a continuació 2 μL de la mostra a quantificar.

3.3. Reacció en cadena de la polimerasa al·lelo-específica

La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) al·lelo-específica és un tipus de PCR que permet discriminar entre dues seqüències que només es diferencien per un sol nucleòtid. Per tant, s’empra per identificar els polimorfismes d’una sola base (SNPs).

Per dur-la a terme es realitzen dues PCRs per cada mostra, una per identificar l’al·lel salvatge i l’altra per identificar l’al·lel mutat. A ambdues s’empra el mateix encebador forward, però els encebadors reverse són diferents, difereixen en un nucleòtid en la regió 3’. En el cas de la PCR per l’al·lel salvatge, l’encebador reverse és complementari a la seqüència salvatge, mentre que a la PCR per l’al·lel mutat, l’encebador reverse és complementari a la seqüència mutada.

Si la seqüència del genoma és salvatge, només s’amplificarà la primera reacció, mentre que si la seqüència del genoma està mutada, només s’amplificarà la segona reacció. Si s’amplifiquen les dues reaccions és perquè l’individu és heterozigot per la mutació. Per tant, les condicions de la PCR han de ser molt específiques, ja que la diferència entre els dos encebadors reverse és només d’un nucleòtid.

(16)

12 A la Figura 4 podem observar com es duen a terme les dues reaccions amb un exemple concret. En aquest cas, la seqüència normal a la regió 3’ contindria una G, mentre que a la seqüència mutada la G passaria a ser una A.

Figura 4. Esquema de la PCR al·lelo-específica.

La seqüència dels encebadors emprats és la que es mostra a la Taula 4.

Taula 4. Seqüències dels encebadors emprats.

Encebador forward (FVF) AAGAACAACAACATGATC

Encebador reverse al·lel normal (FVnormal) GGACAAAATACCTGTATTCCAC Encebador reverse al·lel mutant (FVmutant) GGACAAAATACCTGTATTCCAT

Per a la realització de la PCR, emprant el termociclador 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City), a cada tub es deposita el DNA de les mostres i la mix de la PCR que conté aigua, tampó 10X, desoxinucleòtids trifosfat (dNTPs), els encebadors mencionats anteriorment i la DNA polimerasa.

Les quantitats d’aquests reactius, així com els encebadors emprats per cada PCR estan descrits a la Taula 5.

Taula 5. Reactius emprats per les PCRs. Els encebadors presenten una concentració de 20 ng/μL.

PCR G [DNA] = 20 ng/μL PCR A [DNA] = 20 ng/μL

Aigua 16,3 μL

22 μL

Aigua 16,3 μL

22 μL

Tampó 10X 2,5 μL Tampó 10X 2,5 μL

dNTPs 0,5 μL dNTPs 0,5 μL

Encebador FVnormal 1 μL Encebador FVmutant 1 μL

Encebador FVF 1 μL Encebador FVF 1 μL

DNA polimerasa 0,7 μL DNA polimerasa 0,7 μL

DNA 3 μL DNA 3 μL

Total 25 μL Total 25 μL

(17)

13 Una vegada preparats tots els tubs es realitza la PCR amb les condicions representades a la Figura 5.

Figura 5. Condicions de la PCR.

Com s’ha comentat anteriorment, l’al·lel normal conté una G a la posició 1691 del gen del Factor V, en canvi, si l’al·lel està mutat conté una A. Per tant, si l’individu no presenta la mutació, sols s’amplificarà la seqüència de la PCR amb l’encebador complementari a la seqüència salvatge i el seu genotip serà GG. Si és homozigot per la mutació, s’amplificarà la seqüència de la PCR amb l’encebador per l’al·lel mutat i l’individu serà AA. Finalment, si és heterozigot s’amplificaran totes dues i el seu genotip serà GA.

3.4. Electroforesi i interpretació

Per dur a terme l’electroforesi es realitza un gel d’agarosa al 2% amb una concentració final de bromur d’etidi de 0,5 μg/mL. Les mostres es preparen afegint 2 μL de tampó de càrrega (compost per glicerol i el colorant blau de bromofenol) a 8 μL del producte de la PCR. També es preparen dos tubs que contenguin 3 μL del marcador de pes molecular de múltiples de 100 parells de bases que du tampó de càrrega incorporat (Bioline, Londres).

Una vegada el gel ha solidificat, es carreguen els marcadors de pes molecular i les mostres dins els pouets. Els productes de les dues PCRs fetes amb la mateixa mostra es carreguen a pouets consecutius.

Finalment, es deixa córrer l’electroforesi a 80 V durant aproximadament 20-25 minuts.

Quan les mostres han corregut, es procedeix a la visualització de les bandes amb el fotodocumentador per fluorescència ultraviolada i llum blanca MiniBIS Pro (DNR Bio-Imaging Systems, Neve Yamin).

Si només s’ha amplificat la PCR corresponent a l’al·lel normal, només es veurà una banda al carril on s’havia carregat el producte d’aquesta PCR i l’individu serà GG. Si es veuen dues bandes, s’hauran amplificat les dues PCRs i l’individu serà GA. En canvi, si l’individu és homozigot per la mutació, només es veurà una banda on s’havia carregat el producte de PCR que contenia la mutació i l’individu serà AA (Figura 6).

Homozigot normal Heterozigot Homozigot mutat

G A G A G A

Figura 6. Representació dels diferents casos que es poden obtenir a l’hora d’interpretar l’electroforesi. En el primer cas, l’individu és homozigot normal; en el segon, és heterozigot per la mutació; i en el tercer, és homozigot per la mutació.

(18)

14

3.5. Anàlisi estadística

Per l’anàlisi estadística de la mutació estudiada es calcula la freqüència de l’al·lel mutat (q) mitjançant la següent fórmula: q = nombre d’al·lels mutats / (2n), on n és el nombre d’individus. A més, es calcula l’error estàndard (SD) segons la fórmula SD = √(𝑝 · 𝑞)/(2𝑛), on p és la freqüència de l’al·lel normal, q és la freqüència de l’al·lel mutat i n és el nombre d’individus.

També es calcula el risc relatiu a patir TEV si es té el Factor V de Leiden mitjançant la fórmula: (a · d) / (b · c), on a és el nombre d’individus de la població general que presenten l’al·lel normal, b és el nombre d’individus de la població amb TEV que presenten l’al·lel normal, c és el nombre d’individus de la població general que presenten l’al·lel mutat i d és el nombre d’individus de la població amb TEV que presenten l’al·lel mutat.

4. Resultats i discussió

4.1. Extracció i quantificació del DNA

A la Taula 6 es mostren els resultats de la quantificació del DNA de les mostres extretes.

Taula 6. Resultats quantificació DNA.

Mostra [ ] (ng/uL) 260/280 260/230

MR 232 1,322 0,675

MR* 45 1,607 0,573

La concentració obtinguda de DNA es calcula amb l’absorbància obtinguda a 260 nm, mentre que la puresa de la mostra es calcula amb les absorbàncies dels següents quocients: 260/280 i 260/230.

El quocient 260/280 indica el grau de contaminació amb composts aromàtics, ja siguin fenols o proteïnes. Es considera que el DNA té una puresa òptima si el valor d’aquest quocient està entre 1,8 i 2. Si el valor és major a 1,6 es pot considerar que té una puresa acceptable, mentre que un valor inferior a 1,6 indica contaminació per composts aromàtics. En canvi, si és superior a 2,1 indicaria la presència de RNA a la mostra (82). El quocient 260/230 indica el grau de contaminació amb sals, fenols o carbohidrats. En aquest cas, es considera que el DNA és pur quan el seu valor està entre 1,5 i 2,2. Per tant, si és inferior a 1,5 podem considerar que la mostra està contaminada (82).

Els resultats obtinguts indiquen que la mostra MR* tindria una puresa acceptable, mentre que la MR estaria contaminada per composts aromàtics. En canvi, ambdues presentarien contaminació per sals, fenols o carbohidrats.

4.2. Posada a punt de la tècnica

Abans de determinar els genotips de Sicília i Eivissa, es va posar a punt la tècnica amb controls negatius i positius. Els controls positius eren mostres prèviament genotipades provinents de pacients amb trombosi venosa de Son Espases. També es va amplificar la mostra MR quantificada anteriorment, i encara que sortís contaminada, no va donar problemes a l’hora de realitzar la PCR i el gel (Taula 7 i Figura 7).

(19)

15

Taula 7. Genotips dels pacients que patien trombosi venosa i la mostra MR.

Mostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MR

Genotip GA GG GG GA GG GA GA GA GG GG

Figura 7. Gel realitzat amb les mostres de pacients que havien patit algun episodi tromboembòlic (1-9) i la mostra amb la qual s’havia fet l’extracció del DNA (MR). Al primer carril de cada fila s’hi carrega el marcador de pes molecular (PM) i a continuació 5 mostres (primer el producte de PCR corresponent a l’al·lel normal i després el corresponent a l’al·lel mutat).

Al final de cada fila s’hi carreguen els dos controls negatius: a la primera fila el corresponent a l’al·lel normal (CNG) i a la segona fila el corresponent a l’al·lel mutat (CNA). Les mostres 1, 4, 6, 7 i 8 corresponen a individus heterozigots per la

mutació, i les mostres 2, 3, 5, 9 i MR a individus homozigots normals.

4.3. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden

Cal mencionar que les mostres de Sicília i Eivissa proporcionades havien estat quantificades i complien els estàndards de qualitat i concentració necessaris per una correcte amplificació. Els genotips obtinguts dels diferents individus es mostren a la Taula 8.

Taula 8. Genotips dels individus estudiats.

Illa Genotip

GG GA AA Sicília (N = 106) 103 3 0 Eivissa (N = 43) 43 0 0

A partir dels genotips obtinguts, es calculen les freqüències al·lèliques de les dues illes (Taula 9).

Taula 9. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden a Sicília i Eivissa.

Illa Freqüència al·lèlica de l’al·lel G Freqüència al·lèlica de l’al·lel A Sicília (N = 106) 0,986 ± 0,008 0,014 ± 0,008

Eivissa (N = 43) 1 0

(20)

16 Tenint en compte la freqüència del Factor V de Leiden descrites a la bibliografia a Espanya (entre 1,6 i 5,8) i Itàlia (entre 2 i 13) (50) i aplicant la fórmula n · q ≥ 5, com la mida mostral adequada per detectar l’al·lel amb freqüència dins la població dins un marge d’error inferior al 5%, a una població espanyola s’haurien d’estudiar un mínim d’individus entre 86 i 312 i a una població italiana entre 38 i 250. Per tant, podríem considerar que la mostra analitzada de Sicília a priori podria ser més o menys representativa de la freqüència al·lèlica del Factor V de Leiden a la població, mentre que la d’Eivissa clarament no. Inicialment es tenia previst genotipar-ne un nombre més elevat, però la feina al laboratori es va veure interrompuda per la situació sanitària ocasionada per l’epidèmia de la covid-19.

4.3.1. Comparació amb altres poblacions

S’ha fet una recerca bibliogràfica de les freqüències al·lèliques (al·lel A) del Factor V de Leiden de poblacions generals que es representen per continents: Europa (Taula 10), Àsia (Taula 11), Àfrica (Taula 12), Amèrica (Taula 13) i Oceania (Taula 14).

Taula 10. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden de poblacions generals d’Europa.

País Població Nombre d’individus Freqüència al·lèlica Referència Alemanya

Nord-est 814 0,037 (83)

Frankfurt 80 0,044 (83)

Munich 180 0,039 (83)

Anglaterra Oxford 237 0,044 (83)

Sheffield 144 0,014 (83)

Àustria Viena 104 0,024 (83)

Bòsnia i Hercegovina Tuzla 107 0,037 (84)

Bulgària 100 0,045 (85)

Croàcia Població dàlmata 168 0,012 (86)

Zagreb 155 0,045 (87)

Eslovàquia Ètnia eslovaca 269 0,030 (88)

Ètnia gitana 271 0,066 (88)

Espanya

Oviedo 150 0,017 (89)

País Basc 198 0,005 (83)

València 493 0,010 (90)

Finlàndia Hèlsinki 137 0,015 (83)

França Montpeller 492 0,017 (83)

París 597 0,026 (83)

Grècia Atenes 203 0,042 (83)

Groenlàndia Inuit 133 0 (83)

Hongria Budapest 132 0,057 (83)

Irlanda Belfast 178 0,028 (83)

Islàndia Reykjavík 159 0,031 (83)

Itàlia

Meridional 112 0,009 (83)

Milà 344 0,013 (83)

Roma 134 0,015 (83)

132 0,019 (91)

Països Baixos Leiden 474 0,015 (83)

Polònia Varsòvia 200 0,025 (92)

Portugal 203 0,005 (83)

(21)

17 Turquia

Ankara 285 0,049 (83)

Denizli 1030 0,095 (93)

Istanbul 120 0,046 (83)

Xipre Nord 99 0,061 (83)

Greek 187 0,070 (83)

Taula 11. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden de poblacions generals d’Àsia.

País Població Nombre

d’individus

Freqüència

al·lèlica Referència

Aràbia Saudita 70 0,007 (94)

Indonèsia 105 0 (49)

Jordània Població txetxena 120 0,092 (95)

L’Índia 120 0,004 (96)

L’Índia/Pakistan/la Xina El Caixmir 250 0 (97)

La Xina Changchun 102 0 (98)

Pakistan Rawalpindi 100 0,010 (22)

Tailàndia 200 0 (99)

Taula 12. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden de poblacions generals d’Àfrica.

País Població Nombre d’individus Freqüència al·lèlica Referència

Algèria 75 0,013 (83)

Egipte Mansura 211 0,102 (100)

Kenya 60 0 (49)

Senegal 96 0 (49)

Zàmbia 95 0 (49)

Taula 13. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden de poblacions generals d’Amèrica.

Argentina Bons Aires 215 0,028 (92)

Brasil 275 0,005 (101)

100 0,010 (102)

Canadà 229 0,004 (92)

Mèxic 4345 0,007 (103)

Veneçuela Caracas 134 0,015 (104)

Xile Talca 160 0,006 (105)

Taula 14. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden de poblacions generals d’Oceania.

Austràlia 73 0 (49)

Indonèsia 105 0 (49)

Papua Nova Guinea 95 0 (49)

A la Figura 8 es representen les dades de les taules anteriors (Taula 10, Taula 11, Taula 12, Taula 13 i Taula 14) en un mapa on els països estan acolorits amb diferents gradients segons la freqüència al·lèlica.

(22)

18

Figura 8. Mapa de les freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden de poblacions generals. Figura creada amb mapchart.net.

(23)

19 Com podem observar tant a les taules com al mapa, les freqüències més elevades les presenten les poblacions europees; i dins aquestes poblacions, la freqüència va disminuint d’est a oest. A més, a Àfrica, Àsia i Oceania les freqüències són molt baixes, mentre que a Amèrica són bastant semblants a les que presenten les poblacions de l’est d’Europa.

Per tant, l’al·lel mutant del Factor V sembla estar present només en les poblacions caucàsiques (europeus, jueus, àrabs israelians i indis), i es posa de manifest un únic origen de la mutació (106).

L’anàlisi de l’haplotip del gen del Factor V (51,107,108) indica que aquesta mutació va ocórrer fa 21.000-34.000 anys, després de la separació dels ancestres no africans dels africans (fa uns 100.000 anys) i la separació dels ancestres asiàtics de les subpoblacions caucàsiques (fa uns 60.000-40.000 anys) (51). A més, també es va demostrar que un únic haplotip és la base de la mutació del Factor V de Leiden a les poblacions mediterrànies i índies, recolzant la hipòtesi d’una població ancestral comuna (agricultors neolítics) que van estendre la mutació des de l’Orient Mitjà cap a Europa i l’Índia fa uns 10.000 anys (108).

A més, és destacable que la freqüència al País Basc és relativament baixa (109). Es creu que aquesta població deriva d’un antic poble europeu paleolític que té una identitat genètica diferent a la resta de poblacions europees. Per tant, aquest fet també recolza, de manera indirecta, la hipòtesi de la migració de la població d’agricultors neolítics cap a Europa (109,110).

La perdurabilitat d’aquesta mutació a la població caucàsica fa pensar que el Factor V de Leiden ha pogut proporcionar un avantatge per a la supervivència. S'ha demostrat que aquesta mutació proporciona un menor risc de sagnat greu després del part, per tant durant la història de la humanitat hauria d'haver proporcionat un benefici important per a la supervivència (111). D’altra banda, l’augment del risc a patir un TEV associat al Factor V de Leiden probablement no ha estat un factor negatiu per la supervivència ja que la trombosi apareix en edats avançades i no afecta la fertilitat (45).

Respecte a les poblacions insulars, aquestes solen ser petites i aïllades i, per tant, propenses als efectes de la deriva genètica, sobretot a través dels colls de botella i els efectes fundadors. El resultat d’aquests fenòmens sol conduir a una diversitat genètica reduïda, una identitat estesa per compartició de descendència i un nombre més elevat d’homozigosi (112). La pèrdua de diversitat genètica després d'una disminució sobtada de la grandària de la població és un procés que es pot observar amb més facilitat en entorns que han experimentat un aïllament geogràfic i/o cultural (113).

La deriva genètica és important a les poblacions insulars per diverses raons. En primer lloc, moltes poblacions insulars són fundades per un nombre reduït d’individus la composició genètica dels quals pot diferir significativament de la població d’origen (sovint continental) a causa de l’atzar (114,115).

En segon lloc, les poblacions insulars solen tenir mides efectives petites (116,117). El tercer motiu són els colls de botella. Igual que moltes poblacions, és probable que les poblacions insulars experimentin fluctuacions en la mida de la població al llarg de la seva història, de vegades produint reduccions importants de mida de població o colls de botella (116,118). No obstant això, a diferència de les poblacions continentals, les poblacions insulars aïllades poden no rebre una variacions genètiques a través del flux genètic després dels colls de botella, la qual cosa produeix una reducció permanent de la variació genètica (o almenys a una reducció a llarg termini, ja que la mutació pot acabar reemplaçant parcialment la variació genètica perduda) (117).

En concret, l’illa de Sicília està situada al centre del mar Mediterrani, cosa que ha tingut un paper clau en la seva història de poblament (119). Aquesta àrea ha estat descrita com una “gresol antic” on es van instal·lar diferents pobles en diferents èpoques que es van mesclar formant diferents capes genètiques (120,121).

(24)

20 En un estudi (120) es va demostrar que Sicília es caracteritza per una gran variabilitat genètica dins la població i per una baixa variabilitat entre poblacions. Aquesta variabilitat és diferent de la que es va observar al nord d’Itàlia (122). A més, anàlisis del cromosoma Y indiquen una gran relació amb les poblacions dels Balcans del sud. Per tant, es produïren migracions importants durant el neolític i l’edat del bronze creant l’homogeneïtat genètica intrapoblacional que es coneix a Sicília (120,123).

Eivissa forma part de l’arxipèlag balear, situat al mar Mediterrani occidental, prop de la costa oriental de la península Ibèrica. Per la seva posició geogràfica al mar Mediterrani, les Illes Balears han estat assentades al llarg de la seva història per diferents poblacions. Aquest fet ha modelat l'estructura genètica de la població humana de l'arxipèlag. Es poden trobar diferències entre Eivissa i les altres dues illes principals, Mallorca i Menorca, especialment en els orígens dels assentaments fundadors. La població eivissenca ha estat aïllada durant segles, per tant ha rebut poc flux genètic de població de fora (124,125), cosa que es reflecteix en el conjunt de gens de la població contemporània (126).

Per comprendre millor el procés històric de diferenciació humana es van utilitzar diferents tipus de marcadors genètics. La població d’Eivissa es caracteritza genèticament per marcadors clàssics (126) i cinc microsatèl·lits autosòmics (127), que indiquen l’existència de diferències genètiques entre Eivissa i les altres principals illes balears. Aquests resultats podrien reflectir la petjada genètica de l’origen fenici/cartaginès històric d’Eivissa i proporcionar proves que el conjunt de gens gènics de la població és un reflex de la seva història única (128). Nous estudis han indicat, però, que a la gran diferenciació d’Eivissa el que més hi ha contribuït és la deriva genètica (129,130).

Per tant, es podria esperar que les illes tinguessin una freqüència al·lèlica i un nombre d’individus homozigots més elevats que les poblacions continentals a causa de la homogeneïtat genètica que presenten. De totes maneres, el Factor V de Leiden pràcticament no s’ha estudiat en illes, per això en aquest treball s’havia proposat estudiar illes del Mediterrani.

En aquest estudi, les freqüències trobades a les illes són molt semblants a les freqüències trobades en les poblacions properes, per tant no s’han trobat diferències. En el cas de Sicília, es va trobar una freqüència de 0,014 coincidint amb les que s’han trobat al conjunt d’Itàlia (0,019), Itàlia meridional (0,009), Milà (0,015) i Roma (0,019) (83,91). Per la seva banda, la mostra analitzada d’Eivissa va donar una freqüència de 0 ja que no és suficient representativa, per tant no es pot comparar amb les freqüències trobades al continent respectiu.

4.3.2. Factor V de Leiden a població amb tromboembolisme venós

S’ha fet una cerca bibliogràfica de la freqüència al·lèlica (al·lel A) d’aquest factor a individus amb TEV.

A les següents taules s’hi representen les freqüències trobades per continents: Europa (Taula 15), Àsia (Taula 16) i Amèrica (Taula 17).

Taula 15. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden a poblacions amb TEV d’Europa.

Bòsnia i Hercegovina Tuzla 111 0,117 (84)

Bulgària 128 0,125 (85)

Croàcia Zagreb 160 0,244 (87)

Espanya Oviedo 51 0,275 (89)

València 131 0,019 (90)

Itàlia Pàdua 1970 0,102 (131)

(25)

21

Taula 16. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden a poblacions amb TEV d’Àsia.

Iran Central 100 0,07 (132)

L’Índia 155 0,071 (96)

L’Índia/Pakistan/la Xina El Caixmir 250 0,038 (97)

Pakistan Rawalpindi 100 0,065 (22)

Tailàndia 27 0,056 (99)

Taula 17. Freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden a poblacions amb TEV d’Amèrica.

Brasil 53 0,038 (101)

81 0,049 (102)

Veneçuela Caracas 208 0,058 (104)

Xile Talca 62 0,032 (105)

A continuació, es compararan les freqüències al·lèliques trobades en població general i població amb TEV (Taula 18).

Taula 18. Comparació de les freqüències al·lèliques entre població sana i població amb TEV.

País Població Freqüència al·lèlica població general

Freqüència al·lèlica

població amb TEV Referència

Bòsnia i Hercegovina Tuzla 0,037 0,117 (84)

Brasil 0,005 0,038 (101)

0,010 0,049 (102)

Bulgària 0,045 0,125 (85)

Croàcia Zagreb 0,045 0,244 (87)

Espanya Oviedo 0,017 0,275 (89)

València 0,010 0,019 (90)

L’Índia/Pakistan/la Xina El Caixmir 0 0,038 (97)

Pakistan Rawalpindi 0,010 0,065 (22)

Tailàndia 0 0,056 (99)

Veneçuela Caracas 0,015 0,058 (104)

Xile Talca 0,006 0,032 (105)

A partir de les dades de la Taula 18, es representa a la Figura 9 una gràfica comparant població general i amb TEV.

(26)

22

Figura 9. Gràfica on es comparen les freqüències al·lèliques per l’al·lel A entre població general i població amb TEV.

Al ser el Factor V de Leiden una causa del TEV veiem que la freqüència d’aquesta mutació està sobre- representada en la població amb la malaltia respecte a la general. El rang de la freqüència a la població amb TEV es troba entre 0 (la Xina) i 0,244 (Croàcia), coincidint amb la freqüència en individus heterozigots reportada a poblacions no asiàtiques (0,15-0,20) (133).

Per altra banda es pot observar que, en general, hi ha una correlació entre la freqüència al·lèlica a la població general i la freqüència al·lèlica a la població amb TEV (Figura 10).

Figura 10. Gràfica on es mira la correlació entre la freqüència al·lèlica a la població general i la freqüència al·lèlica a la població amb TEV.

A continuació, es calcula el risc relatiu a patir TEV si es té el Factor V de Leiden a partir de les dades de la Taula 18. Es representa el risc que presenta cada país i el risc total a la Taula 19.

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Freqüència al·lèlica

Regió

Comparació freqüència al·lèlica població general i amb tromboembolisme venós

Població sana Població amb TEV

y = 3,6458x + 0,0089 R² = 0,7653

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05

Freqüència al·lèlica població amb TEV

Freqüència al·lèlica població sana

Correlació entre la freqüència al·lèlica a la població

general i la freqüència al·lèlica a la població amb TEV

(27)

23

Taula 19. Risc relatiu a patir TEV si es té el Factor V de Leiden.

País (Ciutat) Genotips/al·lels Població general Població amb TEV Risc (OR) (95% CI) Bòsnia i

Hercegovina (Tuzla)

GG 84 103 1 (referència)

GA 20 8 0,33 (0,14-0,78)

AA 3 0

G 188 214 1 (referència)

A 26 8 0,44 (0,12-0,61)

Brasil

GA 3 4 7,40 (1,61-34,10)

AA 0 0

A 3 4 7,15 (1,58-32,43)

Brasil

GA 2 40 47,80 (11,03-207,13)

AA 0 0

A 2 10 32,46 (7,71-136,72)

Bulgària

GA 9 32 3,37 (1,52-7,45)

AA 0 0

A 9 32 3,03 (1,41-6,51)

Croàcia (Zagreb)

GA 5 27 6,34 (2,37-16,93)

AA 1 6 7,04 (0,84-59,25)

A 7 39 6,01 (2,64-13,65)

Espanya (Oviedo)

GA 5 26 31,41 (10,99-89,78)

AA 0 1

A 5 28 22,32 (8,34-59,79)

Espanya (València)

GA 10 5 1,91 (0,64-5,71)

AA 0 0

A 10 5 1,90 (0,64-5,60)

L’Índia/

Pakistan/la Xina (El Caixmir)

GA 0 15

AA 0 2

A 0 19

La Xina (Changchun)

GA 0 0

AA 0 0

A 0 0

(28)

24 Pakistan

(Rawalpindi)

GA 2 13 7,32 (1,61-33,36)

AA 0 0

A 2 13 6,88 (1,53-30,91)

Tailàndia

GA 0 3

AA 0 0

A 0 3

Veneçuela (Caracas)

GA 4 24 4,24 (1,44-12,51)

AA 0 0

G 264 392 1

A 4 24 4,04 (1,39-11,78)

Xile (Talca)

GA 2 8 11,70 (2,41-56,82)

AA 0 0

A 2 8 10,97 (2,29-52,39)

Total

GA 62 205 5,28 (3,94-7,07)

AA 4 9 3,59 (1,10-11,69)

A 70 223 4,81 (3,66-6,32)

Podem observar que es produeixen moltes variacions entre les diferents poblacions. El risc en individus heterozigots varia entre 0,33 a Bòsnia i Hercegovina i 47,80 a Brasil. De la mateixa manera, el risc de l’al·lel A està entre 0,44 a Bòsnia i Hercegovina i 32,46 a Brasil. El risc més elevat es dóna a Brasil, Xile i Oviedo (Espanya), possiblement perquè a aquestes poblacions també hi ha altres factors ambientals o genètics. També cal comentar que a moltes poblacions el nombre d’al·lels mutats trobats als estudis és baix, donant d’aquesta manera valors estadístics poc representatius.

Tot i que es sap que els individus homozigots tenen més risc a patir TEV que els heterozigots (55), en aquest anàlisi de risc relatiu basat en dades de poblacions no es reflexa, possiblement pel poc nombre d’homozigots trobats als estudis emprats.

Molts estudis (134–136) han demostrat que el Factor V de Leiden és la mutació més habitual en pacients amb trombosi venosa, augmentant el risc de 3 a 7 vegades en comparació amb els que no presenten la mutació (1,49,134,135,137). Aquestes dades coincideixen amb el risc total calculat a partir de diversos estudis realitzats en diferents poblacions (5,28, CI: 3,94-7,07). A més, s’ha vist que el risc respecte l’al·lel A és d’unes 4 vegades (104), coincidint també amb els resultats del risc total de les diferents poblacions estudiades (4,81, CI: 3,66-6,32).

A més, s’ha vist que no hi ha correlació entre el risc relatiu i la freqüència al·lèlica de la població general (R² = 0,1302) ni entre el risc i la freqüència al·lèlica de la població amb TEV (R² = 0,0226).

(29)

25 També cal comentar que si aquesta mutació es combina amb la mutació G20210A de la protrombina el risc augmenta de manera considerable ja que la trombosi és de causa multifactorial on hi intervenen factors tant genètics com adquirits (105).

5. Conclusions

A aquest treball s’han estudiat les freqüències al·lèliques del Factor V de Leiden a les illes de Sicília i Eivissa i s’ha comparat amb altres poblacions arreu del món. També s’ha estudiat el risc relatiu a patir TEV si es té aquesta mutació.

- La freqüència al·lèlica a Sicília és de 0,014 ± 0,008, coincidint amb les poblacions continentals del voltant.

- A Eivissa la freqüència al·lèlica ha estat 0, però el nombre d’individus estudiats no ha estat prou significatiu.

- El recull bibliogràfic d’aquesta mutació a poblacions d’arrel del món ha posat en evidència que les freqüències al·lèliques més elevades es troben a Egipte i Turquia, mentre que la mutació està pràcticament absent a Àfrica, Àsia i Oceania.

- El risc relatiu de patir TEV relacionat amb l’al·lel Factor V de Leiden va de 0,44 a 32,46 segons la població, de manera que varia molt, segurament degut a la interacció del Factor V de Leiden amb altres factors de risc genètics i ambientals. La mitjana és de 4,8 en concordança amb el que s’ha trobat a altres estudis.

6. Bibliografia

1. Rosendaal FR. Venous thrombosis: a multicausal disease. Lancet. 1999;353(9159):1167-73.

2. Mahan CE, Hornsby LB, Burnett A, Marcy TR, Conway SE. Thrombophilia Issue. J Pharm Pract.

2014;27(3):224-6.

3. Rosendaal FR, Van Hylckama Vlieg A, Doggen CJM. Venous thrombosis in the elderly. J Thromb Haemost.

2007;5(SUPPL. 1):310-7.

4. Koupenova M, Kehrel BE, Corkrey HA, Freedman JE. Thrombosis and platelets: An update. Eur Heart J.

2017;38(11):785-91.

5. Colucci G, Tsakiris DA. Thrombophilia Screening: Universal, Selected, or Neither? Clin Appl Thromb Hemost. 2017;23(8):893-9.

6. Uribe Olivares RA. Fisiopatología: La ciencia del porqué y el cómo. Barcelona: Elsevier; 2018.

7. Bauer KA, Kass BL, ten Cate H, Hawiger JJ, Rosenberg RD. Factor IX is activated in vivo by the tissue factor mechanism. Blood. 1990;76(4):731-6.

8. Salzman E, Hirsh J. The epidemiology, pathogenesis and natural history of venous thrombosis. En: Colman R, Hirsh J, Marder V, editors. Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. 3a ed.

Philadelphia: Lippincott; 1994.

9. Smith SA, Travers RJ, Morrissey JH. How it all starts: Initiation of the clotting cascade. Vol. 50, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. Taylor and Francis Ltd; 2015. p. 326-36.

10. Hall JE, Guyton AC. Guyton y Hall: Tratado de fisiología médica. Barcelona: Elsevier; 2016.

11. Gargani Y. Lo esencial en Hematología e inmunología. Barcelona: Elsevier; 2013.

12. Gartner LP. Texto de histología: atlas a color. Barcelona: Elsevier; 2017.

13. Griffin JH, Mosnier LO, Zlokovic B V. Protein C anticoagulant and cytoprotective pathways. Int J Hematol.

2012;95(4):333-45.

14. Gale AJ, Griffin JH. Characterization of a thrombomodulin binding site on protein C and its comparison to an activated protein C binding site for factor Va. Proteins. 2004;54(3):433-41.

15. Rezaie AR. Exosite-dependent regulation of the protein C anticoagulant pathway. Trends Cardiovasc Med. 2003;13(1):8-15.

16. Gale AJ, Tsavaler A, Griffin JH. Molecular characterization of an extended binding site for coagulation

(30)

26 factor Va in the positive exosite of activated protein C. J Biol Chem. 2002;277(32):28836-40.

17. Friedrich U, Nicolaes GAF, Villoutreix BO, Dahlbäck B. Secondary Substrate-binding Exosite in the Serine Protease Domain of Activated Protein C Important for Cleavage at Arg-506 but Not at Arg-306 in Factor Va. J Biol Chem. 2001;276(25):23105-8.

18. Shen L, Villoutreix BO, Dahlbäck B. Interspecies loop grafting in the protease domain of human protein C yielding enhanced catalytic and anticoagulant activity. Thromb Haemost. 1999;82(3):1078-87.

19. Gale AJ, Heeb MJ, Griffin JH. The autolysis loop of activated protein C interacts with factor Va and differentiates between the Arg506 and Arg306 cleavage sites. Blood. 2000;96(2):585-93.

20. Line BR. Pathophysiology and diagnosis of deep venous thrombosis. Semin Nucl Med. 2001;31(2):90-101.

21. Watson HG, Craig J, Manson L. Blood disease. En: Waker B, Clledge N, Ralstan S, Peman I, editors.

Davidson’s Principle & Practice of Medicine. 22a ed. Londres: Elsevier; 2014. p. 1054–1055.

22. Saeed A, Sumreen, Kashif MA. To determine the frequency of Factor V Leiden in cases of Deep Vein Thrombosis and Healthy controls. Pakistan J Med Sci. 2015;31(5):1219-22.

23. Crous-Bou M, Harrington LB, Kabrhel C. Environmental and Genetic Risk Factors Associated with Venous Thromboembolism. Semin Thromb Hemost. 2016;42(8):808-20.

24. Bagot CN, Arya R. Virchow and his triad: A question of attribution. Vol. 143, British Journal of Haematology. John Wiley & Sons, Ltd; 2008. p. 180-90.

25. Mizera R. Pathophysiology of development of pulmonary hypertension after acute pulmonary embolism.

Ceskoslov Fysiol. 2012;61(1):4-8.

26. Burrowes KS, Clark AR, Wilsher ML, Milne DG, Tawhai MH. Hypoxic pulmonary vasoconstriction as a contributor to response in acute pulmonary embolism. Ann Biomed Eng. 2014;42(8):1631-43.

27. Delcroix M, Mélot C, Vermeulen F, Naeije R. Hypoxic pulmonary vasoconstriction and gas exchange in acute canine pulmonary embolism. J Appl Physiol. 1996;80(4):1240-8.

28. Weaver WD. Heart disease: a textbook of cardiovascular medicine. Circulation. 1997;96(7):2465-6.

29. Jaff MR, McMurtry MS, Archer SL, Cushman M, Goldenberg N, Goldhaber SZ, et al. Management of massive and submassive pulmonary embolism, iliofemoral deep vein thrombosis, and chronic thromboembolic pulmonary hypertension: A scientific statement from the american heart association.

Circulation. 2011;123(16):1788-830.

30. Bevis PM, Smith FCT. Deep vein thrombosis. Vol. 34, Surgery (United Kingdom). Elsevier Ltd; 2016. p. 159- 64.

31. Cronan JJ. Venous thromboembolic disease: The role of US. En: Radiology. Radiology; 1993. p. 619-30.

32. Sevitt S. The structure and growth of valve-pocket thrombi in femoral veins. J Clin Pathol. 1974;27(7):517- 28.

33. Kreidy R. Influence of acquired and genetic risk factors on the prevention, management, and treatment of thromboembolic disease. Int J Vasc Med. 2014;2014:859726.

34. Franchini M, Veneri D, Salvagno GL, Manzato F, Lippi G. Inherited Thrombophilia. Crit Rev Clin Lab Sci.

2006;43(3):249-90.

35. Buchanan GS, Rodgers GM, Branch DW. The inherited thrombophilias: Genetics, epidemiology, and laboratory evaluation. Vol. 17, Best Practice and Research: Clinical Obstetrics and Gynaecology. Bailliere Tindall Ltd; 2003. p. 397-411.

36. Crowther MA, Kelton JG. Congenital thrombophilic states associated with venous thrombosis: A qualitative overview and proposed classification system. Vol. 138, Annals of Internal Medicine. American College of Physicians; 2003. p. 128-34.

37. Kyrle PA, Eichinger S. Deep vein thrombosis. En: Lancet. Elsevier Limited; 2005. p. 1163-74.

38. Silverstein MD, Heit JA, Mohr DN, Petterson TM, O’Fallon WM, Melton LJ. Trends in the incidence of deep vein thrombosis and pulmonary embolism: A 25-year population-based study. Arch Intern Med.

1998;158(6):585-93.

39. Luxembourg B, Schmitt J, Humpich M, Glowatzki M, Seifried E, Lindhoff-Last E. Intrinsic clotting factors in dependency of age, sex, body mass index, and oral contraceptives: Definition and risk of elevated clotting factor levels. Blood Coagul Fibrinolysis. 2009;20(7):524-34.

40. Roach REJ, Lijfering WM, Rosendaal FR, Cannegieter SC, Le Cessie S. Sex difference in risk of second but not of first venous thrombosis: Paradox explained. Circulation. 2014;129(1):51-6.

41. Severinsen MT, Johnsen SP, Tjønneland A, Overvad K, Dethlefsen C, Kristensen SR. Body height and sex- related differences in incidence of venous thromboembolism: A Danish follow-up study. Eur J Intern Med.

2010;21(4):268-72.

42. Buckner TW, Key NS. Venous thrombosis in blacks. Circulation. 2012;125(6):837-9.

43. Zakai NA, McClure LA, Judd SE, Safford MM, Folsom AR, Lutsey PL, et al. Racial and regional differences