Masteroppgave 2016 30 stp
Institutt for kjemi, biokjemi og matvitenskap
Ex vivo fordøyelse av melk, nativ myse, WPC80 og en ukjent
proteiningrediens. Effekt av
varmebehandling på viskositet,
proteindegradering og frigjøring av FAA.
Ex vivo digestion of milk, native whey, WPC80 and an unknown protein ingredient. Effect of heat
treatment on viscosity, protein degradation and release of FAA.
Kjersti Wanggaard Nilsen
Matvitenskap, retning produksjon og utvikling av næringsmidler.
I
Forord
Denne studien ble utført ved institutt for kjemi, bioteknologi og matvitenskap (IKBM) ved Universitetet for miljø- og biovitenskap. Oppgaven utgjør 30 studiepoeng og er det avsluttende arbeidet i min mastergrad i Matvitenskap, retning «produksjon og utvikling av næringsmidler».
Arbeidet ble utført i perioden februar til juni 2016, og alt praktisk arbeid er utført ved NMBU.
Takk til Tine SA for godt samarbeid og økonomisk støtte til gjennomføring av oppgaven.
Først og fremst vil jeg gi en stor takk til hovedveileder professor Gerd Vegarud og medveileder Anne-Grethe Johansen. Takk for gode diskusjoner og konstruktive tilbakemeldinger, oppgaven hadde ikke blitt den samme uten dere. Jeg setter pris på deres engasjement og all hjelpen jeg har fått underveis. Tusen hjertelig takk til doktorgradsstipendiat Gyrd Omholt Gjevestad, for
muligheten til å delta i dette prosjektet. Uten ditt engasjement og din forskning, ville ikke denne oppgaven blitt til. Jeg vil deretter rette en stor takk til laboratorieingeniør Irene Comi og Kari Olsen for analyser av enzymer, frie aminosyrer og god veiledning underveis. Takk til Guro Dørum og Trygve Almhøy for hjelp når jeg hadde gått meg bort i statistikkens verden, dere fikk meg på rett spor. Tusen hjertelig takk til øvrig laboratoriepersonale og medstudenter for gode samtaler, råd, felles lunsj og en kaffekopp i to-draget, dere har alle vært fantastiske og har bidratt til at dette semesteret har blitt et riktig fint semester. I tillegg vil jeg takke «mentor- Guro» som på daglig basis har holdt ut med meg som har hengt en måned etter alle andre. Du har svaret på alt, uansett om det gjelder statistikk, fag eller om jeg faktisk bør forlate lesesalen til fordel for en bedre middag med deg. Takk, du har gjort mastertåka vanvittig mye lettere. Tusen takk til familie og venner, for daglig støtte, korrekturlesing og motivasjon underveis dette semesteret.
Ved å sitere den kjente fysikeren Edvard Teller; «Dagens forskning er morgendagens teknologi», håper jeg med dette at mine resultater kan bidra til å føre forskningen et lite steg videre.
God fornøyelse.
Norges miljø- og biovitenskapelige universitet.
Ås, 29. juni 2015
Kjersti Wanggaard Nilsen.
Sammendrag
Melk og produkter av melk har i en årrekke vært kjent som et viktig næringsmiddel, som følge av deres sammensetning av essensielle aminosyrer og bioaktive peptider. De siste årene har fokuset på myse forandret seg. For å dekke etterspørselen etter ulike myseingredienser utvikles nå ny teknologi for å utnytte råvaren best mulig, og for å dra nytte av forskjeller i funksjonelle egenskaper. Målet for denne oppgaven var å sammenligne om forskjellig varmebehandling hadde innvirkning på viskositet, proteinnedbrytning og dannelse av essensielle frie aminosyrer før og etter fordøyelse i ulike produkter. Ex vivo fordøyelse med humane mage- og tarmenzymer ble gjennomført på melk, nativ myse, WPC80 og ukjent X, etter to ulike varmebehandlinger;
pasteurisering og UHT- behandling i tillegg til ubehandlet produkt.
Varmebehandling av viste signifikant økning i viskositet etter pasteurisering og UHT behandling i melk, nativ myse og WPC80 sammenlignet med ubehandlet produkt. Det ble sett en signifikant reduksjon i ukjent X som følge av varmebehandling. Det ble observert en signifikant forskjell i produkt på viskositet, hvor nativ myse var signifikant forskjellig fra melk og ukjent X, men ikke WPC80. Det ble sett signifikant forskjell mellom WPC80, melk og ukjent X. Ex vivo fordøyelse av melk, nativ myse, WPC80 og et ukjent X førte til forskjell i proteindegradering og frigjøring av BCAA som følge av varmebehandling. Degradering av kaseiner og BSA var fullstendig etter 60 min. fordøyelse i magesekk. Det ble sett fullstendig degradering av β-Lg D120 i samtlige produkter med unntak av pasteurisert melk og UHT-behandlet nativ myse. Degradering av α-La varierte som følge av varmebehandling da UHT- behandling av melk, nativ myse, WPC80 og i mindre grad ukjent X viste aggregering av α-La i D120. Samme trend ble ikke sett etter
pasteurisering, hvor α-La var fullstendig degradert i D120 i samtlige produkter med unntak av pasteurisert melk. Pasteurisering viste høyest grad av frigjøring av Leu, Ile og Val, sammenlignet med ubehandlet og UHT-behandlet produkt. Det ble sett forskjeller i frigjøring av BCAA som følge av produkt. Nativ myse hadde større frigjøring av Leu og Ile sammenlignet med WPC80, ukjent X og melk i pasteurisert og UHT- behandlet produkt. Nativ myse hadde større frigjøring av Val enn WPC80 og melk i pasteurisert og UHT-behandlet produkt.
III
Abstract
Milk and products of milk are widely known as an important nutrient, because of their
composition of essential amino acids and bioactive peptides. In recent years, the focus on whey have changed. To meet the demand for various whey ingredients, new technology is
continuously developed to exploit the full potential of the raw material, and to take advantage of differences in functional properties. The aim of this study was to compare the effect of different heat treatment on viscosity, protein degradation and release of essential free amino acids before and after digestion in various products. Ex vivo digestion with human gastrointestinal enzymes was conducted on milk, native whey, WPC80 and an unknown protein ingredient. Two different heat treatments was tested; pasteurization and UHT- treatment in addition to the untreated product.
Heat treatment showed a significant increase in viscosity after pasteurization and UHT treatment of milk, native whey and WPC80 compared with untreated products. A significant reduction in unknown X was seen as a result of heat treatment. A significant difference in viscosity was observed. Native whey was significantly different from milk and unknown X, but not WPC80.
The results showed a significant difference between WPC80, milk and unknown X. Ex vivo digestion of milk, native whey, WPC80 and an unknown X led to the difference in protein degradation and release of BCAA was seen because of heat treatment. Degradation of casein and BSA was complete after 60 min. digestion in the stomach. Complete degradation of β-Lg was observed in D120 in all products, except for pasteurized milk and UHT-treated native whey.
Degradation of α-La varied because of heat treatment. In UHT- treated milk, native whey WPC80 and to a lesser extent unknown X showed aggregation of α-La in D120. The same trend was not seen after pasteurization, in which α-La was completely degraded in D120 in all
products except pasteurized milk. Pasteurization showed the highest degree of release of Leu, Ile and Val, as compared with untreated and UHT-treated products. It was observed differences in the release of BCAA was seen as a result of different products. Native whey had higher release of Leu and Ile, compared with WPC80, unknown X and milk in both pasteurized and UHT- processed products. Native whey had greater release of Val than WPC80 and milk in pasteurized and UHT-treated products.
Forord ... I Sammendrag ... II Abstract ... III Forkortelser ... VIII
1 Innledning ... 1
1.1 Hensikt ... 1
2 Teori... 3
2.1 Melk ... 3
2.2 Melkens proteiner ... 4
2.2.1 Kaseiner ... 4
2.2.2 Myseproteiner ... 5
2.2.3 β -Laktoglobulin (β-Lg) ... 6
2.2.4 α-Laktalbumin ... 7
2.2.5 Frie aminosyrer ... 7
2.3 Filtrering av melk ... 8
2.3.1 Mikrofiltrering ... 9
2.3.2 Ultrafiltrering ... 10
2.3.3 Diafiltrering... 10
2.3.4 Produkter av myse, myseproteinkonsentrat (WPC80) og nativ myse (NWP) ... 11
2.4 Reologi ... 11
2.4.1 Generelt ... 11
2.4.2 Klassifisering av flytende væsker. ... 13
2.4.3 Måling av viskositet ... 14
2.5 Statistiske analyser ... 14
2.5.1 Variansanalyse ... 14
V
2.5.2 Boksplott ... 15
2.5.3 Tukeys metode ... 15
2.6 Human fordøyelse ... 16
2.6.1 Inndeling av fordøyelsessystemet ... 17
2.6.2 Munn, svelg og spiserør ... 17
2.6.3 Magesekk (ventrikkel) ... 17
2.6.4 Tynntarm (duodenum, jejenum og ileum) ... 18
2.6.5 Fordøyelse av proteiner... 18
2.6.6 Tykktarm (Colon) ... 19
2.7 Ex vivo fordøyelse ... 19
3 Metode ... 23
3.1 Råstoff ... 23
3.1.1 Behandling av råstoff ... 23
3.2 Fordøyelse av melk, WPC80, nativ myse og ukjent X. ... 24
3.2.1 Humane mage og tarmsafter ... 24
3.3 Proteinseparering og degradering. ... 26
3.3.1 Proteinseparering ved natriumdodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS- PAGE). ... 27
3.3.2 Tillaging av prøveløsninger til SDS-PAGE ... 27
3.3.3 Tillaging av SDS polyakrylamidgel og elektroforese. ... 27
3.3.4 Identifisering av proteinbånd i SDS PAGE ... 28
3.4 Analyse av frie aminosyrer ved RP-HPLC. ... 29
3.5 Viskositetsmåling av produkt ved bruk av reometer. ... 30
3.6 Statistiske analyser. ... 30
4 Resultater ... 33
4.1 Viskositetsmåling av melk, nativ myse WPC80 og et ukjent proteinpreparat. ... 33
4.1.1 Variasjon i data ... 34
4.1.2 Statistiske analyser og interaksjonseffekter. ... 35
4.2 Proteindegradering av melk, nativ myse, WPC80 og en ukjent proteiningrediens med mage og tarmsaft. ... 38
4.3 Frigjøring av frie aminosyrer før og etter ex vivo fordøyelse (HPLC) ... 41
4.3.1 Frigjøring av forgrenede aminosyrer (BCAA) før og etter ex vivo fordøyelse ... 42
4.3.2 Frigjøring av andre essensielle aminosyrer etter ex vivo fordøyelse ... 44
5 Diskusjon ... 49
5.1 Effekt av varmebehandling ... 49
5.1.1 Effekt av varmebehandling på viskositet i nullprøver. ... 49
5.1.2 Effekt av varmebehandling på proteindegradering ved fordøyelse med HGJ og HDJ. 51 5.1.3 Effekt av varmebehandling på frigjøring av essensielle frie aminosyrer etter fordøyelse med HGJ og HDJ. ... 54
5.2 Effekt av variasjon i råmateriale ... 56
5.2.1 Effekt av variasjon av råmateriale på viskositetsendring i nullprøver ... 56
5.2.2 Effekt av produkt på proteindegradering. ... 57
5.2.3 Effekt av produkt på frigjøring av essensielle aminosyrer ... 59
6 Konklusjon... 60
7 Til ettertanke og videre forsøk ... 61
7.1 Svakheter ved forsøksoppsett. ... 61
7.2 Videre forskning ... 61 Vedlegg ... A Vedlegg 1. Oppskrifter på elektrolyttløsninger ... B Vedlegg 3. Gjennomsnitt gjentak på målinger av viskositet. ... C Vedlegg 2. Resultater fra HPLC ... D
VII
Forkortelser
α Alfa
β Beta
BCAA Forgrenede aminosyrer BSA Bovint serumalbumin
Ca2+ Kalsium
CaCl2 Kalsiumklorid
EAA Essensielle aminosyrer FAA Frie aminosyrer
γ Gamma
HCl Hydrogenklorid
HPLC Høytrykk væske kromatografi (fra engelsk; high-pressure liquid chromatography) HTST Høy temperatur, kort tid pasteurisering (fra engelsk; high temperature short time)
κ Kappa
MF Mikrofiltrering
mL Milliliter
NaOH Natriumhydroksid
SDS-PAGE Natrium dodecylsulfat- polyakrylamid gel elektroforese TCA Trikloreddiksyre (fra engelsk; trichloroacetic acid) UF Ultrafiltrering
WPC Myseproteinkonsentrat (fra engelsk; whey protein concentrate)
1
1 Innledning
Melk og produkter av melk har lenge vært benyttet som næringsmiddel for en stor del av befolkningen. Myseproteiner fra osteproduksjon ble lenge sett på som biprodukt og enten benyttet til dyrefôr eller produksjon av brunost. I senere tid har synet på myseproteinene snudd på bakgrunn av deres funksjonelle egenskaper så vel som sin ernæringsmessige gode
sammensetning. Det har blitt satt fokus på utnytting av råvaren og å benytte dets fulle potensial.
For å produsere fremtidens mat, med helsepåstander med vitenskapelig grunnlag, er det viktig å utvikle en underliggende kunnskap og forståelse om hvordan maten påvirkes, endres og
absorberes under human fordøyelse (Norton et al. 2006). For å sikre suksessfull utvikling og forbrukeraksept er vitenskapelig basert forskning nødvendig for å underbygge helsepåstander (Gray et al. 2003). I dag benyttes myseproteinkonsentrater i dag i en rekke ulike produkter, ofte som tørkede preparater. Prosessen som benyttes for å fremstille disse preparatene påvirker produktene i forskjellig grad. Ostemysen går gjennom en syrning ved tilsetting av løpe under osteproduksjon, så vel som varmebehandling av melken og myseproteinet i form av
pasteurisering, ved oppkonsentrering eller ved spraytørking. Alle disse prosessene påvirker både funksjonelle egenskaper og næringsinnholdet i produktet. De siste årene har det vært fokus på å filtrere mysen direkte ut fra skummetmelk, for å skape et produkt uten rester av løpe og som i prinsippet ikke trenger å ha vært gjennom unødvendig varmebehandling. Dette for å se på om de ernæringsmessige og funksjonelle egenskapene ble endret som følge av prosessen. Jomfrumyse eller nativ myse som den vil bli omtalt som er en spennende ingrediens som har nøytral pH og inneholder udenaturerte proteiner, er fri for rester fra osteproduksjon. Ved å benytte
membranstørrelse på ≤ 0,2 µm, kan produktet benyttes uten videre varmebehandling, da
produktet omtales som sterilt. Dette er et veldig spennende produkt som jeg ønsket å finne ut mer om i samarbeid med parallellgående prosjekter.
1.1 Hensikt
Hensikten med denne oppgaven var å undersøke i hvilken grad proteiner fra fire ulike produkter degraderes og frie aminosyrer frigjøres i human fordøyelse. Produktene jeg har undersøkt er melk, nativ myse, WPC80 og et industrielt framstilt protein. Undersøkelsen er gjort ved bruk av en ex vivo-fordøyelsesmodell med humane enzymer. Det skulle avdekkes i hvilken grad
temperaturbehandling ved 63 °C i 30 minutter og 90 °C i 120 minutter hadde innvirkning på viskositeten til produktene og om dette hadde innvirkning på fordøyelsen og dermed frigjøringen av frie aminosyrer. I tillegg ville jeg undersøke om det er forskjell mellom produktene i
funksjonelle og ernæringsmessige egenskaper.
Nullhypotese H0: Det er ingen forskjell i viskositet eller frigjøring av frie aminosyrer mellom produktene som følge av temperaturbehandling og/ eller de ulike fordøyelsesstegene.
Alternativ hypotese H1: Det er en reell forskjell i viskositet og/eller frigjøring av aminosyrer som følge av temperaturbehandling og/eller de ulike fordøyelsesstegene.
3
2 Teori
2.1 Melk
Melk og melkens bestanddeler benyttes i dag som ingredienser under produksjon av ulike næringsmidler. Melk har en rekke viktige fysiologiske funksjoner hos mennesket, deriblant at nyfødte skal dekke sitt næringsbehov til å fremme vekst og styrke immunforsvaret (Fox et al.
2015b). Det finnes mange ulike typer melk med ulik sammensetning, og i denne oppgaven ligger fokus på kumelk og ingredienser produsert av proteiner fra kumelk. Kumelk omtales heretter som «melk» med mindre annet er oppgitt. Melk består hovedsakelig av vann, laktose, fett, proteiner, salter og mineraler (Walstra et al. 2005c). Tabell 1 viser komposisjon av de ulike bestanddelene i melk. Melk er basisingrediens ved produksjon av en rekke meieriprodukter som for eksempel ost og syrnede produkter som yoghurt, fløte og rømme. De ulike komponentene utnyttes i forskjellig grad, og som et biprodukt av osteproduksjon benyttes myseproteiner til å produsere en rekke ulike proteinkonsentrater. Proteinkonsentratene kan tørkes og benyttes som ingrediens i en ulike produkter som følge av deres funksjonelle egenskaper (De Wit 1990; Morr
& Ha 1993). De siste årene har etterspørselen etter proteinkonsentrater økt som følge av økt bruk i sportsernæring, barnemat og helsekost (Lagrange et al. 2015).
Tabell 1: Variasjon og gjennomsnitt av komponenter, hhv. vann, totalt tørrstoff, fett, proteiner, laktose, mineraler og energiinnhold i melk (Bylund & Systems 2015b; Fox et al. 2015b; Walstra et al. 2005b)
Kumelk Variasjon (%) Gjennomsnitt (%)
Vann 85,5 – 89,5 87,5
Totalt tørrstoff 10,5 - 14,5 13,0
Fett 2,5 - 6,0 3,9
Total protein
Totalt kaseiner α-S1- kaseiner α-S2- kaseiner β- kaseiner κ- kaseiner
Totalt myseprotein α-Laktalbumin β- Laktoglobulin Bovint Serumalbumin
2,9 -5,0 3,4
26 % av total protein 10 % av total protein 2,6 % av total protein 9,3 % av total protein 3,3 % av total protein 6,3 % av total protein 1,2 % av total protein 3,2 % av total protein 0,4 % av total protein
Laktose 3,6 - 5,5 4,8
Mineraler 0,6 - 0,9 0,8
Energiinnhold (kJ/kg) 2,763
2.2 Melkens proteiner
Melk inneholder vanligvis mellom 2,9 -5,0 % protein, men konsentrasjonen varierer under laktasjonen, spesielt under de første dagene etter fødsel hvor den største forskjellen ligger i mysefraksjonen (Bylund & Systems 2015b; Fox et al. 2015a; Fox et al. 2015b). Melkeproteiner bidrar til å forsyne organismer med essensielle aminosyrer (EAA) for å kunne utvikle muskelvev og forsyne andre deler av kroppen med biologisk aktive proteiner, immunoglobuliner, vitamin- og metallbindende proteiner samt ulike hormoner (Fox et al. 2015a). Egenskapene til
melkeproduktet avhenger av de fysiologiske og kjemiske egenskapene til de ulike
melkeproteinene. Melkeproduktet avhenger av de fysiologiske og kjemiske egenskapene til de ulike melkeproteinene, og kjennetegnes med ulike funksjoner sånn som vannbinding, gel-, skum- og emulgeringsegenskaper (Swaisgood 1993).
Melk kan fraksjoneres i to ulike definerte grupper. Ved syrning, pH 4,6,ved 30°C, vil 80% av proteinene felle ut, denne fraksjonen kalles ofte iso elektrisk (sure) kaseiner (Fox et al. 2015a).
Proteiner som forblir løselig i serum omtales som serum- eller myseproteiner.
2.2.1 Kaseiner
I følge Walstra et al. (2005b) defineres kaseiner som de proteinene som felles ut fra melk ved pH 4,6. Om lag 80 % av proteinene i melken er en kombinasjon av fire ulike kaseiner: αs1- αs2-, β- og κ- kaseiner (Walstra et al. 2005c). De ulike kaseinene innehar ulike egenskaper som følge av variasjon i grad av fosforylering, disulfidbinding, hydrolyse av primere kaseiner ved
plasminglykosylering og genetisk polymorfisme (Fox et al. 2015a).
I følge Fox et al. (2015a) er kaseiner svært varmestabile proteiner. Melk kan varmes opp til 100°C nøytral pH (6,7) i 24 timer uten å koagulere, mens kasein tåler å bli varmet opp til 140°C i 20 min. uten at den endrer struktur (Fox et al. 2015a). Walstra et al. (2005b) hevder derimot at oppvarming til 120°C vil føre til kjemiske forandringer som bidrar til lavere løselighet. Slik varmebehandling kan forårsake ulike forandringer i melka, blant annet produksjon av melkesyre fra laktose (Fox et al. 2015a). Dette resulterer i reduksjon i pH og forandringer i saltbalansen, noe som igjen påvirker utfellingen av kaseiner (Fox et al. 2015a). Reduksjonen i pH som følge av varmebehandling kan derfor bidra til utfelling av kasein i melk (Walstra et al. 2005b).
5 2.2.2 Myseproteiner
Synet på myseproteiner har forandret seg de siste årene. Tidligere ble myse sett på som et
biprodukt fra osteproduksjon, som enten ble benyttet til fôr eller gjødsel (Fox et al. 2015b). I dag er det et høyt verdsatt produkt som blant annet benyttes som ingrediens i morsmelkerstatning, konsistensforbedrer, i fôr og til produksjon av proteinkonsentrater til idrett- og
kroppsbyggermiljøet (Lagrange et al. 2015).
Myse defineres som den gruppen proteiner som er løselig i melk (serum) etter utfelling av kasein ved iso elektrisk punkt, pH 4,6 ved 20 °C (Farrell Jr et al. 2004). Det finnes ulike typer myse, og de to vanligste er sur myse fra syrefelling av kasein og søt myse fra løpekoagulert melk ved ysting (Schmidt et al. 1984).
De siste årene har det derimot blitt utviklet filtreringsteknologi som muliggjør direkte filtrering av skummetmelk for å produsere «nativ myse» (Brans et al. 2004). Serumproteiner omtales ofte som myseprotein, men er ikke en presis sammenligning ifølge Walstra et al. (2005b), da
løpekoagulert myse også inneholder glykomakropeptid (GMP) fra κ- kasein. Omtrent 20% av det totale proteininnholdet i kumelk består av myseproteiner (Fox et al. 2015a). Proteiner som β- Laktoglobulin (β-Lg) og α- Laktalbumin (α-La) er de viktigste serumproteinene i melk (Fox et al. 2015a), i tillegg til mindre proteiner og enzymer som bovint serum albumin (BSA),
immunoglobuliner (Ig) og laktoferrin (LF). Alle serumproteiner, med unntak av protose peptone- fraksjonen (PEP), er globulære proteiner (Walstra et al. 2005b).
Mysen fra syre- og løpeinduserte prosesser inneholder peptider fra kaseinderivater samt PEP som er produsert av plasmin fra β-kasein (Fox et al. 2015a). I følge Mather (2000) er søt myse et biprodukt fra løpeindusert koagulering av melk ved produksjon av ost, og dette er den vanligste kilden til myse. Søt myse inneholder mindre serumproteiner og proteiner fra membranen til melkefettglobuler i tillegg til de øvrige serumproteinene. Nye metoder innenfor
filtreringsteknologi utvikles for å sikre optimal utnyttelse av bestanddelene i melk. Brans et al.
(2004) beskriver fraksjonering av melk ved hjelp av mikrofiltrering (MF) for å produsere en kaseinrik fraksjon i tillegg til nativ myse for å produsere et myseproteinkonsentrat uten GMP.
Innholdet av β-Lg og α-La i myse og nativ myse er henholdsvis 50 % og 20 % (Madureira et al.
2007). Myseproteinene er varmelabile, og denatureres ved oppvarming til 90 °C i 10 min. (Fox et al. 2015b).
2.2.3 β -Laktoglobulin (β-Lg)
β-Lg er et av de viktigste proteinene i melk og står for omtrent 50 % av totalt myseprotein, eller 12 % av totalt proteininnhold i melk (Fox et al. 2015b). Iso elektrisk punkt for β-Lg er ~pH 5,2, og fremkommer i melk som dimere med en molekylvekt på 36,6 kDa (Walstra et al. 2005b).
Sammensetningen av aminosyrer og deres molekylvekt til noen viktige proteiner i melk vises i Tabell 2.
Tabell 2. Aminosyresammensetning og molekylvekt i de viktigste proteinene i kumelk. Kaseinene α s1, α s2- κ-, samt myseproteinene β-Lg og α-La (Fox et al. 2015b)
Aminosyre
α s1-CN B α s2-CN A κ-CN B β- CN A2 β-Lg A α-La- B
Asp 7 4 4 4 11 9
Asn 8 14 7 5 5 12
Thr 5 15 14 9 8 7
Ser 8 6 12 11 7 7
Ser P 8 11 1 5 0 0
Glu 24 25 12 18 16 8
Gln 15 15 14 21 9 5
Pro 17 10 20 35 8 2
Gly 9 2 2 5 3 6
Ala 9 8 15 5 14 3
½ Cys 0 2 2 0 5 8
Val 11 14 11 19 10 6
Met 5 4 2 6 4 1
Ile 11 11 13 10 10 8
Leu 17 13 8 22 22 13
Tyr 10 12 9 4 4 4
Phe 8 6 4 9 4 4
Trp 2 2 1 1 2 4
Lys 14 24 9 11 15 12
His 5 3 3 5 2 3
Arg 6 6 5 4 3 1
PyroGlu 0 0 1 0 0 0
Totalt antall enheter 199 207 169 209 162 123
Molekylvekt (MW) 23,612 25,228 19,05 23,980 18,362 14,174
Hϕ 4,89 4,64 5,12 5,58 5,03 4,68
Ved pH under 3,5 vil β-Lg dissosiere til monomere på størrelse ~18 kDa, mens mellom pH 5,5 og 7,5 vil all β-Lg i kumelk danne dimere med molekylvekt på 36 kDa (Fox et al. 2015a). Ved pH over 7,5 vil β-Lg gjennomgå en strukturendring og dissosierer til to monomere samtidig som en tiolgruppe eksponeres. Dette gir mulighet til å bidra med en sulhydryl-disulfid-utveksling (Fox et al. 2015a). Ved pH mellom 3,5 og 5,2, spesielt ved isoelektrisk punkt, vil β-Lg fra kumelk danne oktamere med molekylmasse på 144 kDa (Fox et al. 2015a; Walstra et al. 2005b).
7 Walstra et al. (2005b) hevder at det er lite sannsynlig at β-Lg har noen teknologisk eller
ernæringsmessig betydning.
2.2.4 α-Laktalbumin
α-La står for 20 % av proteinene i myse, og konsentrasjonen er 1-1,5 g/L-1, eller ca. 3,4 % av totalt proteininnhold i melk (Fox et al. 2015a; Swaisgood 1995). α-La er et lite, kompakt protein med en molekylmasse på ~14 kDa, samt iso elektrisk punkt på ~pH 4,8 (Walstra et al. 2005b). α- La er et globulært protein og består av ca. 123 aminosyreenheter som fordelingen 26 % α-heliks, 14 % β-struktur og 60 % underordnet struktur (Fox et al. 2015a; Redington et al. 2016).
Aminosyreinnholdet i α-la er gjengitt i Tabell 2. α-la inneholder relativt store mengder tryptofan, i tillegg til sulfat, som er tilgjengelig i cystin og metionin. Som følge av evnen α-La har til å binde kalsium (Ca2+), er α-la det mest varmestabile myseproteinet (Fox et al. 2015a). α-La har et spesifikt ueksponert bindingssete for et kalsiumion (Walstra et al. 2005b). Kalsium er sterkt bundet og stabiliserer proteinet, men ved reduksjon i pH til 4-5 vil asparginenheter bli protonert og miste deres evne til å binde Ca2+ (Fox et al. 2015a; Walstra et al. 2005b). Dette medfører en utfoldelse av proteinet og det metallfrie proteinet denatureres ved relativt lav temperatur, og renaturerer ikke ved nedkjøling (Fox et al. 2015a).
2.2.5 Frie aminosyrer
Innholdet av frie aminosyrer i kumelk er ifølge Fox et al. (2015b) 578 μmol/L, men variasjon vil forekomme som følge av blant annet kurase, laktasjonsperiode og sammensetning av ulike proteiner. Sarwar et al. (1998) fant et totalt innhold av frie aminosyrer på 1061 μmol/L.
Glutamin, glutamat, glycin, alanin og serin er de aminosyrene som finnes i høyest konsentrasjon i kumelk (Fox et al. 2015a).
2.3 Filtrering av melk
Filtrering defineres som en trykkdrevet behandling av en råvare for å separere løselige og uløselige deler ved å benytte en porøs membran (Albert Ibarz 2002). Membranseparering benyttes for å skille én væske til to flytende væsker med ulik sammensetning (Walstra et al.
2005a). Filtrering er prosesser hvor uønsket materiale holdes igjen på den ene siden av filteret (Albert Ibarz 2002). Membranfiltreringsprosesser, som mikrofiltrering (MF), ultrafiltrering (UF), nanofiltrering (NF) og revers osmose (RO), benytter en tverrstrøms metode (Koros et al. 1996).
Figur 1 viser en illustrasjon over filtreringsprosesser (A) og membransepareringsprosesser (B).
Figur 1. Forskjell i filtreringsprosesser (A), hvor strømmen går tvers gjennom filteret fører til at større partikler hopes opp på filtersiden, og membranseparering (B), hvor en tverrstrøm deler et flytende medie i to ulike deler, retentat og permeat,, med ulik sammensetning.(Adaptert fra Koros et al. (1996)).
Separasjon av komponenter i næringsmidler er nødvendig for å kunne produsere produkter med økt konsentrasjon av et spesifikt næringsstoff, for eksempel kasein- og myseproteinpreparater (Albert Ibarz 2002). Flere ulike filtreringsmetoder benyttes for å produsere ulike produkter av myseproteiner, deriblant MF, UF, NF og RO (Schmidt et al. 1984). Filtreringsprosesser av proteinfraksjoner kan være energikrevende, men separering med membranfilter er derimot mindre energikrevende ifølge Albert Ibarz (2002). Dette har ført til en økning i bruk av membranfiltrering de siste årene. I meieriindustrien erstatter membranseparering eldre
separasjonsmetoder (Walstra et al. 2005a). Ved ultrafiltrering benyttes en porøs semipermeabel membran, hvor egnet membranfilter med en satt porestørrelse for det produktet som ønskes og bidrar til seleksjon av hvilke komponenter som krysser membranen. Figur 2 viser en
klassifisering av de ulike membranprosessene og hvilke partikler som blir avvist (retentat) eller går gjennom membranen (permeat).
9
Figur 2. Klassifisering av ulike membranprosesser og hvilke partikler som holdes igjen av filteret i henholdsvis mikrofiltrering, ultrafiltrering, nanofiltrering og revers osmose på bakgrunn av molekylstørrelse. (Albert Ibarz 2002).
2.3.1 Mikrofiltrering
Mikrofiltrering omtales som en prosess som er en mellomting mellom vanlig filtrering og UF (Walstra et al. 2005a). Native kaseinmiceller kan bli fjernet fra skummetmelk ved å benytte mikrofiltrering ved hjelp av membraner med porestørrelse på 0,1 til 0,8µm (Fox et al. 2015b).
Ved å benytte denne metoden vil kaseinmicellene holdes tilbake i retentatet, mens løselige bestanddeler fra melk, som laktose, mineraler og myseproteiner, når gjennom til permeatet (Bylund & Systems 2015a). Bakterier og fett holdes også igjen av membranen, og derfor
benyttes denne metoden til pasteurisert skummetmelk (Saxena et al. 2009; Walstra et al. 2005a).
Mikrofiltrering benyttes da i kombinasjon med HTST-pasteurisering som alternativ til ultra- pasteurisering for å øke holdbarheten til kjølelagret skummetmelk (Elwell & Barbano 2006).
Som med UF av skummetmelk, vil det under MF være faktoren for volumkonsentrasjonen fra diafiltreringen som bestemmer den endelige proteinkonsentrasjonen og ratio mellom kasein og
myse i retentatet (Fox et al. 2015b). Ved omfattende konsentrering og diafiltrering, er det da mulig å generere et retentat med høyere proteinkonsentrasjon enn utgangspunktet (Fox et al.
2015a). Deretter tørkes retentatet for å produsere et pulver som er rikt på native kaseinmiceller (>90 % av total proteinkonsentrasjon) og har en rekke bruksområder. Isolater av kasein benyttes i stor grad til berikning av ystemelk og som ingrediens i næringsmidler. Permeatstrømmen fra denne prosessen er ifølge Fox et al. (2015a) bra startmateriale for produksjon av
myseproteinkonsentrat ved hjelp av tørking. MF-permeat fra skummetmelk inneholder hverken starterkultur, løpe eller forandring i pH som følge av fermentering, og har generelt bedre kvalitet enn tradisjonell, søt myse. Som følge av disse årsakene omtales denne mysen som «uforandret»
eller «nativ» myse.
2.3.2 Ultrafiltrering
Ultrafiltrering (UF) er en metode som benytter en porøs semipermeabel membran som selekterer makromolekyler som kan krysse membranen på grunnlag av molekylvekt, størrelse eller
utforming (Albert Ibarz 2002). Komponenter som kaseinmiceller, somatiske celler, fettgobuler og bakterier holdes igjen ved ultrafiltrering (Walstra et al. 2005a). Figur 2 viser en klassifisering av de ulike membranprosessene og hvilke partikler som blir avvist (retentat) eller går gjennom membranen (permeat). UF oppkonsentrerer partikler med molekylvekt mellom 300- 500000 Dalton (Da) eller ved porestørrelse på 3 til 300 nanometer (nm) (Walstra et al. 2005a). Ved å benytte en membran med størrelse på 10 til 20 kDa holdes både kaseiner og myseproteiner tilbake i retentatet, mens laktose og løselige salter er permeable. I melk vil fett og protein oppkonsentreres, mens laktose og salter transporteres gjennom membranen sammen med vann (Albert Ibarz 2002; Walstra et al. 2005c).
2.3.3 Diafiltrering
Diafiltrering er en prosedyre der vann tilsettes til mysen under filtreringsprosessen for å vaske ut lavmolekylære komponenter som kan passere membranen, hovedsakelig laktose og mineraler (Bylund & Systems 2015a). Dette fører til en ytterligere oppkonsentrering av større molekyler i retentatet (Walstra et al. 2005a). Metoden benyttes for å redusere laktoseinnhold i forbindelse med ultrafiltrering av melk.
11 2.3.4 Produkter av myse, myseproteinkonsentrat (WPC80) og nativ myse (NWP)
Myse kommer hovedsakelig fra to prosesser; enten som et biprodukt fra osteproduksjon (søt myse) eller under produksjon av syrnede produkter som cottage cheese, yoghurt eller kasein (sur myse) (Lagrange et al. 2015). To relativt nye og hurtigvoksende kilder er ifølge Lagrange et al.
(2015) myse fra mikrofiltrering av skummetmelk, «nativ myse» og myse produsert under separasjonsprosessen av Gresk yoghurt, «Greek whey» eller «sur myse». Hovedforskjellen mellom myseproteinkonsentrat (WPC) laget av nativ myse sammenlignet med WPC fra
ostemyse er mangelen på GMP i førstnevnte (Svanborg et al. 2016). I tillegg til forskjell i GMP, kan WPC fra nativ myse inneholde mindre fett og denaturerte proteiner, avhengig av
prosessbetingelser og typen membranfiltrering som benyttes (Morr & Ha 1993).
WPC har god aminosyreprofil med høyt innhold av tilgjengelig lysin (Lys) og cystein (Cys) (Bylund & Systems 2015a). WPC-pulver produseres ved å tørke retentat fra ultrafiltrering av myse og navngis som følge av proteininnhold i tørrstoff, som varierer fra 35 % til 80 % (Bylund
& Systems 2015d). For å produsere et 35 % WPC-pulver, vil væsken oppkonsentreres seks ganger (Bylund & Systems 2015d)
2.4 Reologi 2.4.1 Generelt
Reologi beskriver vitenskapen om flyt og deformasjon av fast stoff og væsker under påvirkning av mekaniske krefter (Albert Ibarz 2002; Steffe 1996). For å studere reologiske egenskaper er det nødvendig å benytte seg av reometri for å få kjennskap til ulike stoffers oppførsel under gitte betingelser. For å sikre tilfredsstillende prosess- og produktkvalitet, kan reologiske parametere være avgjørende i industrien. Når en kraft (F) påføres et legeme, er den observerte responsen forskjellig. Dette avhenger av materialet kraften virker på (Albert Ibarz 2002). Når en kraft påføres et elastisk legeme, vil det deformeres, men vil gjenoppta opprinnelig form når kraften opphører. Stress (σ) defineres som den kraften (F) som virker på et område (Areal/A) og oppgis i Pa (N/m2)(Albert Ibarz 2002; Bourne 2002). Kraften virker ned på et areal og fører til en
forlenging eller forkorting av et elastisk materiale avhengig av retningen på kraften. Figur 3 viser en skjematisk forklaring over hvordan normalt stress påvirker et materiale.
Figur 3. Normalt stress a) ingen stress påvirker materialet og materialet ligger i ro, b) normalt stress påvirker materialet og materialet beveger seg dermed som følge av stresset som ble påført (Albert Ibarz 2002).
Skjærkrefter (γ) virker tangentialt på materialets overflate, samtidig som materialets bunn
påvirkes av en kraft som går parallelt i motsatt retning (Albert Ibarz 2002; Bourne 2002). Figur 4 viser en skjematisk forklaring over hvordan skjærkrefter påvirker et materiale.
Figur 4: Skjærkrefter virker tangentialt på materialet. A) Ingen skjærkrefter virker på materialet og materialet ligger dermed i ro, b) skjærkrefter virker på materialet, og materialet forskyves (Albert Ibarz 2002).
Et stoff som deformeres under påvirkning av en kraft, men går tilbake til opprinnelig form ved opphør av kraften, har elastiske egenskaper. Ved tap av deformasjonsenergi er materialet viskøst og energien går tapt som følge av varmeproduksjon (Albert Ibarz 2002). Materialer som har både viskøse og elastiske egenskaper, kalt viskoelastiske stoffer, er svært vanlig i næringsmidler. Hvis
13 et produkt har Newtoniske egenskaper, som for eksempel vann, vil det fortsette å flyte når
kraften stopper. Viskositet defineres som den interne friksjonen i en væske eller dens tilbøyelighet for å motstå flyt (Albert Ibarz 2002). Viskositet benyttes for å kalkulere
parameterne moment og energitransportfenomener. Enheten for viskositet er Pascal sekund (Pa
·s), som tilsvarer 1000 mPas eller 1000 Centipose (cP). Pascalsekund kan også beskrives som kg/m/s (Albert Ibarz 2002).
2.4.2 Klassifisering av flytende væsker.
Væsker deles hovedsakelig inn i to grupper; væsker med og uten Newtoniske egenskaper. Dette avhenger av om deres reologiske egenskaper kan beskrives av Newtons lov om viskositet (Albert Ibarz 2002). Egenskapene til matvaren påvirkes av tiden skjærkraften virker på dem, og påvirker dermed både struktur og flyteegenskaper (Albert Ibarz 2002; Bylund & Systems 2015a).
Newtoniske væsker har konstant viskositet avhengig av temperatur, men uavhengig av påført skjærrate (Bylund & Systems 2015c). Skjærstrømning oppstår som følge av strømning mellom parallelle plan, virvelstrøm mellom koaksiale sylindre der en sylinder er stasjonær og en av sylinderne roterer (Bylund & Systems 2015a). Adferden til væsker er tidsavhengige og en funksjon av skjærspenning (Albert Ibarz 2002). Viskositeten er ved gitt temperatur avhengig av skjærraten. I Newtoniske væsker er viskositetsfunksjonen konstant, og verdien er Newtonisk viskositet. I ikke-Newtoniske væsker er funksjonen ikke konstant, og kan enten være avhengig eller uavhengig av tid. I ikke-Newtoniske væsker kan vi ikke måle viskositet, da forholdet mellom påført skjærkraft og skjærraten ikke er konstant. Stoffer som ved økende skjærrate får lavere viskositet betegnes som pseudoplastiske (skjærtynnende), mens de som får høyere
viskositet ved økt skjærrate omtales som dilatante (skjærtykkende). Figur 5 viser en oversikt over de ulike egenskapene til Newtoniske og ikke-Newtoniske væsker (Albert Ibarz 2002).
Figur 5. Klassifisering av egenskapene til tidsavhengige Newtoniske og ikke-Newtoniske væsker. A) Newtonsk, b) dilatant, c) pseudoplastisk, d) Bingham plastic, e) pseudoplastisk væske med flytegrense angitt på y aksen stress (σ), x-aksen representerer skjærrate(γ̇) (Albert Ibarz 2002).
2.4.3 Måling av viskositet
Ved måling av viskositet er det nødvendig å ta høyde for representative målinger med hensyn til skjærrate og temperatur (Bylund & Systems 2015c). Reologiske egenskaper til ulike produkter vil i mange tilfeller endres med tid og temperatur. Det er derfor nødvendig å påse at de
reologiske undersøkelsene gjøres i så nær i tid som mulig med hensyn til det gitte prosessen for å kunne sikre representative målinger (Bylund & Systems 2015c).
2.5 Statistiske analyser 2.5.1 Variansanalyse
Variansanalysen ANOVA benyttes for å sammenligne forventet verdi (μ) i to eller flere grupper (i) samtidig for å se om det er signifikante forskjeller mellom gruppene (Montgomery 2008). Det benyttes ofte to hypoteser, der nullhypotesen kan forkastes om det er signifikante forskjeller mellom gruppene.
H0 (nullhypotesen): Gruppene er like, det vil si at det ikke er noen forskjell mellom resultatene for de ulike gruppene testen gjennomføres på. Verdiene (μ) er like, μ1= μ2=…= μi.
15 H1: Gruppene er ulike, det vil si at det er en reell forskjell mellom resultatene for de ulike
gruppene som testen utføres på. Verdiene (μ) er ikke like, og minst to er forskjellige.
I dag gjøres beregning av signifikante verdier sjeldent for hånd. I beregningene for dette prosjektet benyttes statistikkprogrammet «R» (versjon 3.2.4, 16.03.2016, http://www.r- project.org/) og tilleggsprogrammet «R Commander» (http://repository.umb.no/R/).
Programmene oppgir p-verdi i tillegg til alle verdier som kan regnes for hånd. Ved
signifikansnivå på 0,01% (α=0,01) kan nullhypotesen forkastes dersom p- verdien er lavere enn 0,01.
2.5.2 Boksplott
Et boksplott er en grafisk fremstilling av observasjonene som viser fordelingen i et datasett (Montgomery 2008). I et boksplott vises den minste og den største observasjonen sammen med gjennomsnittet, medianen, nedre kvartil og øvre kvartil. Ved nedre kvartil ligger 25 % av observasjonene enten under eller på kvartilet, mens ved øvre kvartil ligger 75 % av
observasjonene. Krysset i boksen markerer gjennomsnittet, mens medianen er markert som en linje. Denne linjen er som regel 1,5 ganger boksens lengde. Resultater som går utenfor denne linjen markeres med sirkler og inneholder observasjoner som er mye større eller mindre enn det som normalt observeres. Vertikale linjer indikerer variasjonen henholdsvis nedenfor og ovenfor nedre og øvre kvartil. I noen tilfeller avviker resultatene i stor grad. Dette kan skyldes både at det er et reelt avvik, men kan også skyldes feil i datasettet. Dersom de avvikende resultatene fjernes og resultatene fremdeles er de samme, vil konklusjonen styrkes. Dersom konklusjonene avviker fra hverandre, vil det være hensiktsmessig å vurdere i hvilken grad dataene er valide
(Montgomery 2008).
2.5.3 Tukeys metode
Ved å benytte Tukeys metode kan en sammenligne parvise gjennomsnitt (Montgomery 2008;
Tukey 1949). Tukeys metode avklarer om to gjennomsnitt er signifikant forskjellige dersom den absolutte verdien av prøvene overstiges. Tukeys test er en et-trinns sammenligningsprosedyre som vurderer flere gjennomsnitt mot hverandre. Metoden kan benyttes alene eller i forbindelse med ANOVA-analyse (post-hoc)(Montgomery 2008). Tukeys test kan gjennomføres for hånd, samt ved bruk av statistiske programmer. Tukeys test er basert på en formel som er svært lik
vanlige t-tester. Tukeys test regnes som en t-test som tar høyde for sannsynligheten for å gjøre et eller flere falske funn, eller type 1 feil, blant hypotesen når det utføres flere hypotesetester (Tukey 1949).
2.6 Human fordøyelse
Human fordøyelse innebærer en kompleks prosess der mat brytes ned til mindre partikler og næringsstoffer tas opp gjennom tynntarmen (Guerra et al. 2012). Næringsstoffer blir brukt av kroppen til vekst, vedlikehold av celler og som energi (Saladin 2012). Under fordøyelsen er det to hovedprosesser som finner sted samtidig; mekanisk bearbeiding, som reduserer størrelsen på komponentene, og enzymatisk nedbrytning hvor komponenter hydrolyseres til mindre
nedbrytningsprodukter. Nedbrytningsproduktene blir deretter transportert over tarmepitelecellene og kan deretter tas opp i blodstrømmen. I munnhulen foregår en mekanisk nedbrytning av maten som inntas, samtidig som spytt tilsettes. I magesekken (ventrikkel), senkes pH som følge av utskillelse av fordøyelsessekreter og HCl til pH 1-5 (Guerra et al. 2012). Fall i pH og
tilstedeværelse av pepsin starter hydrolyse av proteiner, mens gastrisk lipase har betydning for fettfordøyelse (3-30%) (Guerra et al. 2012; Saladin 2012). Full enzymatisk fordøyelse og opptak av næringsstoffer skjer i hovedsakelig i tynntarmen. I Figur 6 vises hovedtrekkene i det humane fordøyelsessystemet.
Figur 6. Hovedtrekkene over humant fordøyelsessystem hvor hovedtrekkene beskrives. Deriblant endring i pH, mekanisk- og kjemisk nedbrytning samt utskillelse av ulike fordøyelsessekreter i henholdsvis munnhulen, magesekken, tynntarmen og endetarmen (Guerra et al. 2012).
17 Forskere stiller spørsmål til hvordan fordøyelsesprosessen påvirkes av ernæringsstatus,
toksikologi og mikrobiologi (Guerra et al. 2012). Å studere human fordøyelse er vanskelig som følge av mange ulike årsaker. In vivo undersøkelser er kostbart- og teknisk vanskelig, i tillegg til å være vanskelig å gjennomføre på en etisk forsvarlig måte.
2.6.1 Inndeling av fordøyelsessystemet
Fordøyelsessystemet har to anatomiske inndelinger, fordøyelseskanalen og tilhørende organer (Saladin 2012). Fordøyelseskanalen er en 5 til 9 meter lang muskelfylt kanal som strekker seg fra munnhulen til anus. Området fra magesekk til tynn- og tykktarm omtales ofte som
gastrointestinal (GI) traktus, hvor tilhørende organer som spyttkjertler, lever, galleblære og bukspyttkjertel bidrar med fordøyelsesenzymer. Selve fordøyelsen deles inn i mekanisk- og kjemisk fordøyelse (Guerra et al. 2012). Den mekaniske fordøyelsen omhandler den fysiske oppmalingen av maten til mindre nedbrytningsprodukter, som starter med tygging i munnhulen, men fortsetter i magesekk og tynntarmen ved hjelp av sammentrekninger. Den mekaniske bearbeidingen bidrar til å øke overflaten til matvaren, samt å gjøre den mer tilgjengelig for fordøyelsesenzymer. Kjemisk fordøyelse består av en serie med hydrolytiske reksjoner som bryter større makromolekyler ned til deres mono- og dimere (Saladin 2012). Proteiner brytes ned til aminosyrer ved hjelp av pepsin. Enkelte komponenter absorberes uten å måtte brytes ned, deriblant vitaminer, frie aminosyrer, mineraler, kolesterol og vann. Blodstrømmen, motiliteten og sekresjonen av fordøyelsesenzymer styres av det enteriske nervesystemet.
2.6.2 Munn, svelg og spiserør
Fordøyelsen starter i munnhulen, ved mekanisk bearbeiding og innblanding av spytt ved pH 6.8- 7 (Guerra et al. 2012; Saladin 2012). Oppholdstiden i munnhulen er kort, men tygging vil ha en viktig effekt på den generelle fordøyelsesprosessen og tømmehastigheten i magesekken (Saladin 2012). Spyttet består av en løsning 97,0 % til 99,5 % vann i tillegg til fordøyelsesenzymer, for karbohydrat- og fettnedbrytning, mens slim binder sammen og smører maten. Tygging av maten er første steg i den mekaniske nedbrytningen.
2.6.3 Magesekk (ventrikkel)
Primærfunksjonen til magesekken er å oppbevare mat, tilføre væske og bearbeide maten mekanisk og kjemisk i påvente av videre fordøyelse i tynntarmen (duodenum) (Saladin 2012).
Kjertler i celleveggen produserer daglig 2-3 liter magesaft som består av vann, saltsyre (HCl) og
fordøyelsesenzymet pepsin. Magesaft inneholder store andeler HCl, som har en pH på ca 0,8.
Magesyren har flere viktige funksjoner; blant annet å aktivere enzymer som pepsin og lingual lipase, oppbrytning av bindevev og planteceller, tilføre væske og forme kymen. McConnell et al.
(2008) har målt fastende pH i magesekken til 1,0-2,5, mens Ekmekcioglu (2002) har sett større variasjon i pH på 1,0- 3,5. Inaktive enzymer, zymogener, blir utskilt i magesekken, og aktiveres ved å fjerne enkelte aminosyrer(Saladin 2012). Celler i magesekken «chief-cells» skiller ut zymogenet pepsinogen som ved nærvær av HCl omdannes til pepsin. Pepsin har en auto
katalyserende effekt, siden pepsin bryter ned protein, mens pepsinogen er et protein i seg selv, vil tilstedeværelse av pepsin bidra til økt omdanning av pepsinogen til pepsin. Optimal funksjon for pepsin er å omdanne proteiner fra næringsmidler til kortere peptidkjeder, før fordøyelse i
tynntarmen.
2.6.4 Tynntarm (duodenum, jejenum og ileum)
Nesten all kjemisk fordøyelse og opptak av næringsstoffer foregår i tynntarmen (Saladin 2012).
Tynntarmen deles inn i tre regioner; tolvfingertarmen (duodenum), jejenum og ileum. Duodenum opptar de første 25 cm, og strekker seg fra pylorus ringmuskelen forbi pankreas
(bukspyttkjertelen) til overgangen til jejenum. Duodenum mottar kymus fra ventrikkelen, galle fra galleblæren og sekret fra pankreas. Zymogenet trypsinogen, utskilles fra pankreas og omdannes til trypsin ved hjelp av enterokinase, et enzym som utskilles fra slimhinnen i tarmepitelet. Trypsin er autokatalytisk, det dannes mer trypsin fra trypsinogen ved tilstedeværelse av trypsin. I tillegg til å omdanne to andre zymogener, kymotrypsin og
karboksypeptidase, vil hovedoppgaven til trypsin være å bryte ned protein fra næringsmidler.
Kymotrypsin og karboxypeptidase vil også bidra til nedbrytning av protein. Kymus fra
magesekken har av pH (1-5), og vil nøytraliseres av sekret fra pankreas og galle. Pankreatiske enzymer tar over den kjemiske nedbrytningen, samtidig som pepsin inaktiveres på bakgrunn av økning i pH. Hovedvekten av fordøyelsen og opptaket av næringsstoffer skjer i denne delen av tynntarmen, som følge av god blodtilførsel.
2.6.5 Fordøyelse av proteiner
Aminosyrene som absorberes i tynntarmen kommer fra tre kilder; maten som inntas,
fordøyelsesenzymer, og fra epitelceller som fordøyes av enzymene (Saladin 2012). Endogene aminosyrer utgjør ifølge Saladin (2012) om lag 30 g/dag sammenlignet med 44 til 60 g/dag fra
19 maten som inntas. Fordøyelse av proteiner avhenger av utslipp av de human-spesifikke
proteasene; trypsin, kymotrypsin, elastase, karboksy- og aminopeptidase i gastrointestinaltrakten (Devle et al. 2014). Pepsin hydrolyserer peptidbånd mellom tyrosin og fenylalanin, og fordøyer 10 til 15 % av proteiner fra maten til kortere polypeptider og en liten mengde frie aminosyrer (FAA) (Saladin 2012). Optimal pH for pepsin er 1,5 til 3,5, derfor inaktiveres den i tynntarmen i nærvær av basisk sekret fra galle og pankreas. Ved hjelp av hydrolyse brytes polypeptider ned til mindre oligopeptider. Karboxypeptidase fjerner deretter aminosyrer fra syreenden av kjeden, mens aminopeptidase fjerner fra aminenden, før dipeptidase splitter dipeptider på midten og frigjør de to siste aminosyrene før overføring til tarmepitelet ved hjelp av aktiv og passiv
transport. Typen proteiner som inntas påvirker ifølge Boirie et al. (1997) total muskelanabolisme som følge av opptak av FAA i tarmen. Kasein metaboliseres sakte, trolig på grunn av deres evne til å koagulere i surt miljø i magesekken, som bidrar til en forsinkelse i tømming av ventrikkelen (Boirie et al. 1997). Kasein bidro her til en bedre netto leucinbalanse etter syv timer med inntak av et kaseinpreparat og et mysepreparat. β-Lg regnes som et relativt raskt metabolisert protein (Mahe et al. 1996), på tross av immunitet mot fordøyelse av pepsin i magesekken (El-Zahar et al.
2005; Mandalari et al. 2009).
2.6.6 Tykktarm (Colon)
Proteinfordøyelsen påvirkes i ingen eller liten grad i tykktarmen. Enkelte epitelceller og proteiner skilles ut, men ellers påvirkes ikke proteinfordøyelsen. Det foregår små kjemiske forandringer i tykktarmen, hovedoppgaven er å re-absorbere vann og salter (Saladin 2012).
2.7 Ex vivo fordøyelse
Simulering av fordøyelsessystemet er viktige modeller og anvendt i mange felt innenfor mat- og ernæringsrettet forskning (Minekus et al. 2014). Humane forsøk er ofte svært kostbare, teknisk vanskelige, resurskrevende, og etiske aspekter er diskutable (Guerra et al. 2012). Som følge av dette er det benyttet in vitro-modeller som alternativ for å kunne bestemme endepunkter i biotilgjengelighet i næringsstoffer eller graden de ulike mikronæringsstoffene fordøyes, for å kunne bygge nye hypoteser in vivo. Et bredt spekter av in vitro modeller er tilgjengelig, både statiske og dynamiske modeller (Guerra et al. 2012). Metoder som benyttes til fordøyelse av proteiner involverer ofte bruk av enzymer. Mange proteaser er tilgjengelige for dette formålet,
hvor hver enkelt har ulike karakteristika og spesifisitet, effektivitet og optimale
fordøyelsesforhold (Switzar et al. 2013). Det har blitt benyttet mange ulike metoder, og ulike enzymkilder fra blant annet gris, kanin og menneske, som naturlig nok har ulik sammensetning- og enzymaktivitet. Enzymkilder fra ulike arter har forskjellig spesifisitet og aktivitet (Minekus et al. 2014). Dette har gjort sammenligningsgrunnlaget av de ulike forsøkene vanskelig.
Ulike fordøyelsesmodeller benyttes til å undersøke grad av fordøyelighet, strukturelle endringer og frigjøring av ulike komponenter, under forhold som etterligner in vivo fordøyelse (Hur et al.
2011). Det er derimot vanskelig og etterligne in vivo fordøyelse, da det er komplekse fysiologiske og fysiokjemiske forhold som er vanskelige å etterligne. In vivo forsøk på fordøyelse er vanskelig å rettferdiggjøre på en god økonomisk, etisk og teknisk måte, derfor benyttes det i dag ulike in vitro modeller. Det finnes i hovedsak to typer in vitro
fordøyelsesmodeller- statiske og dynamiske. Den mest benyttede modellene er de statiske ifølge Guerra et al. (2012). Statiske modeller karakteriserer kjemisk fordøyelse, men de tar ikke høyde for den mekaniske påvirkningen fra fordøyelseskanalen. Mekanisk påvirkning bidrar til
mekanisk og kjemisk nedbrytning av maten, så vel som absorpsjon og transport (Ferrua & Singh 2010). Dynamiske in vitro modeller har fordel av at de i større grad etterligner in vivo forhold (Amorim-Carrilho et al. 2014), og benyttes i større grad for å få et mer realistisk resultat. Enkelte modeller som er styrt av datamaskiner viser forskjell i utslipp av enkelte komponenter
sammenlignet med forsøk med samme produkt i statiske modeller (Roman et al. 2012). Dette tyder på at bruk av ulike modeller bidrar til varierende resultater ved forsøk på samme produkt.
Som følge av mange ulike in vitro modeller, er det derfor vanskelig å sammenligne resultater. En rekke forskere på fordøyelse fra ulike land har utarbeidet «COST action InfoGest FA1005
INFOGEST», en standardisert og praktisk statisk in vitro metode basert på fysiologiske relevante forhold (Minekus et al. 2014). Ved bruk av en felles metode, vil det i fremtiden være mulig i større grad å sammenligne forsøk. Det er i denne metoden benyttet kommersielle enzymer, derav navnet. For å danne et mer realistisk bilde på human fordøyelse er det i dette forsøket benyttet humane enzymer, aspirert fra frivillige personer. Dette er et steg nærmere in vivo fordøyelse, og derfor benyttes terminologien ex vivo fordøyelse. Sammenlignet med dynamisk in vitro
fordøyelse med kommersielle enzymer vil denne typen studie være nærmere human fordøyelse basert på valg av enzymkilde (Aarak et al. 2013; Eriksen et al. 2010).
21 Enkelte svakheter finnes imidlertid ved bruk av en slik metode. Fiksert pH med HCl, vil kunne gi både for rask økning/reduksjon under ulike steg i fordøyelsen. Dette kan påvirke produktet som fordøyes på en måte som ikke stemmer over ens med human fordøyelse hvor utslipp av enzymer, HCl ol. styres av sentralnervesystemet. Tidsvariasjon i de ulike fasene av fordøyelsen kan avvike fra in vivo fordøyelse. En annen svakhet er mangelen på absorpsjon av nedbrytningsproduktene fra «tarmen», og hvilken innvirkning dette har på netto nedbrytning av ulike næringsstoffer, i dette tilfellet frigjøring av aminosyrer fra proteiner. Sammenlignet med fysiologiske situasjoner mangler denne modellen en membran, hvor vannløselige fordøyde produkter fjernes
kontinuerlig, produktene vil akkumulere over tid og fordøyelsen vil muligens stoppe opp.
23
3 Metode
3.1 Råstoff
Lettmelken som ble benyttet ble kjøpt inn fra leverandør A. Melken var pasteurisert og hadde et proteininnhold på 3,2 %. Myseproteinkonsentratet (WPC80) og nativt myseprotein (NWP) ble innhentet direkte fra leverandør B. WPC80 hadde et proteininnhold på 77,4 %, og var produsert fra tørking av pasteurisert ostemyse. Den native mysen hadde en proteinkonsentrasjon på 9,9 %, og var produsert av upasteurisert skummetmelk. Den proteinbaserte ingrediensen ukjent X, ble innhentet fra leverandør C og hadde en proteinkonsentrasjon på 83 %. Det ble ikke opplyst om varmebehandlingshistorien til ukjent X.
3.1.1 Behandling av råstoff
Det ble gjennomført to varmebehandlinger av produktene henholdsvis melk, nativ myse, WPC80 og ukjent X. Alle varmebehandlingene ble gjort i vannbad (Leuda AL18, Tyskland), men ved ulike temperaturer. Første varmebehandling gjenspeilte en «in vat» lavpasteurisering, 63 °C i 30 min. Andre varmebehandling ble gjennomført ved 90°C i 120 min for å simulere en langtids UHT-behandling av melk. Optimalt burde disse produktene vært varmebehandlet slik de vil bli behandlet i industrien, høy temperatur, kort tid (fra engelsk; high temperature, short time, HTST) pasteurisering ved 72 °C i 15 sek. og UHT-behandling ved 135-145 °C i et par sek. Som følge av for små mengder prøvemateriale og påbrenning av flatene i pilotanlegg, kunne industriell
varmebehandling ikke benyttes. Figur 7 viser nativ myse og forandring i utseende etter de ulike behandlingene.
Figur 7. Viser fra venstre mot høyre; ubehandlet nativ myse, pasteurisert nativ myse og UHT-behandlet nativ myse etter «in vat»
varmebehandling i vannbad.
3.2 Fordøyelse av melk, WPC80, nativ myse og ukjent X.
3.2.1 Humane mage og tarmsafter
Anskaffelse av humane fordøyelsesenzymer ble gjort ved aspirasjon av magesaft (Human gastric juice, HGJ) og tarmsaft (Human duodenal juice, HDJ) fra frivillige utført ved Lovisenberg Diakonale Sykehus (Oslo, Norge) og Sykehuset i Moss (Moss, Norge). Metoden er beskrevet av Holm et al. (1988) og Ulleberg et al. (2011). 20 frivillige (7 menn og 13 kvinner) i alderen 20 til 42 år (Gjennomsnitt 25 ± 5 år) fastet i mer enn 8 timer før aspirasjon av fordøyelsesenzymene.
Metoden er godkjent av Norges forskningsetiske komité, og alle deltagere leverte skriftlig samtykke.
In vitro fordøyelsesmodell basert på Minekus et al. (2014), ble benyttet med enkelte modifikasjoner. Prøvene ble ikke eksponert for oral fase i dette forsøket. Det ble benyttet humane enzymer, i istedenfor kommersielle enzymer for å kunne relatere forsøket i større grad mot in vivo fordøyelse. Metoden omtales derfor videre som ex vivo fordøyelsesmodell.
Pepsinaktivitet i magesaft (HGJ) og trypsinaktivitet i tarmsaft (HDJ) ble målt som beskrevet i henhold til Minekus et al. (2014). Det ble benyttet en pepsinaktivitet i HGJ på 2000 U mL-1 og en trypsinaktivitet i HDJ på 100U/mL-1 per 1 mL prøve. Det ble benyttet to ulike batcher med magesaft (HGJ). Pepsinaktiviteten i batch 1 ble målt av laboratorieingeniør Irene Comi til
9090U/mL (Irene Comi, 10.09.15, NMBU, Ås) og batch 2 med HGJ til 4980 U/mL (Irene Comi, 08.03.16, NMBU). Trypsinaktiviteten i tarmsaft (HDJ) ble målt til 219 U/ml (Irene Comi, 10.09.15, NMBU, Ås).
Til å fordøye 2 ml prøve ble det benyttet henholdsvis 0,880 mL HGJ fra batch 1, og 1.604 mL av batch 2. Elektrolyttløsninger for fordøyelse i magesekk (SGF) og tynntarmen (SIF) ble laget i henhold til Minekus et al. (2014), det ble tilsatt 10 µL fersk 0, 3M kalsiumklorid (CaCl2) i tillegg til elektrolyttløsningene. Oppskriftene er gitt i vedlegg 1.Tabell 3 viser et eksempel på tilsatt mengde SGF, HGJ, samt andre tilsetninger under ex vivo fordøyelse av de ulike prøvene.
Tabell 3: Viser en oversikt over tilsatt mengde elektrolyttløsning (SGF), humane enzymer fra magesekk (HGJ), CaCl2. 1M HCl og vann per 2 mL prøvemateriale. *Elektrolyttløsningen SGF og HGJ utgjorde 80% av totalt volum. Mengden HCl og vann som ble tilsatt varierte som følge av bufferkapasitet for å nå pH 3. *I batch 2 ble det ikke tilsatt dH2O, men heller benyttet SGF, siden lav enzymaktivitet bidro til ingen plass for elektrolyttløsning.
Ingrediens Mengde
Batch 1 Batch 2
*Simulated Gastric Fluid electrolyte stock solution (SGF)(1.25x) 720 µL 256 µL*
25
*HGJ 880 µL 1604 µL
0.3 M CaCl2 10 µL 10 µL
1 M HCl 130 130
Vann (dH2O) 200 -
Total 2000 µL 2000 µL
Trypsinaktivitet i HDJ ble målt til 219U/mL. For å oppnå en trypsinaktivitet på 100 U/1mL ble det benyttet 3,653 mL HDJ per 2 ml prøve. Tabell 4 viser en oversikt over tilsatt mengde enzymer, elektrolyttløsning og andre tilsetninger i duodenal fordøyelse.
Tabell 4: Viser eksempelvis mengde tilsatt av de ulike ingrediensene i duodenal fase. Elektrolyttløsning (SIF) og tarmenzymer (HDJ) utgjorde over 80% da det ikke var mulig å opprettholde mengden, som følge av lav enzymaktivitet. Det ble derfor ikke tilsatt noe vann utover det som finnes naturlig i fordøyelsesvæske, og elektrolyttløsning.
Ingrediens Mengde
*Simulated Intestinal Fluid electrolyte stock solution (SIF) (1.25x) 200 µL
*HDJ 3653 µL
0.3 M CaCl2 10 µL
1 M NaOH 137 µL
Vann (dH2O) -
Total 4000 µL
Prøvene som ble fordøyd, henholdsvis melk, nativ myse, WPC80 og ukjent X ble standardisert til melkens proteinkonsentrasjon, 3,2 %. Nativ myse, WPC 80 og Ukjent X, ble fortynnet i destillert vann (dH2O), fra en utgangskonsentrasjon på henholdsvis 9,9 %, 77,4 % og 83 %.
Produktene ble overført til 100 ml glassflasker med skrukork og varmebehandlet ved henholdsvis 63 °C i 30 min., og 90 °C i 120 min. i vannbad (Leuda AL18, Tyskland).
2 ml prøve ble pipettert over i et 50 ml plastrør, en liten magnetrører ble tilsatt for å sikre tilstrekkelig rotasjon i fordøyelsen (hastighetstrinn 5) på magnetplaten (IKAMAG RET200-250V, Gmbh, Tyskland). Rørene ble holdt på is og tilsatt magesaft (HGJ) henholdsvis 880 μL og 1604 μL, elektrolyttløsninger (SGF), pH ble justert sakte til 3,0 ± 0,1 ved hjelp av 1M HCl (Merck, Tyskland) og pH-meter (Methrom 827 pH lab, Sveits). Deretter ble prøvene ristet på vortex (Vortex Genie 2, Heigal Scientific industries, Bohemia, N.Y, USA) før prøvene ble satt i vannbad (37 °C) i 60 min. Etter 60 min. ble prøve 2 (G60) tatt ut, homogenisert ved hjelp av ultra turrax (Yellowline DI 18 basic, Tyskland), hastighet 6 i 10 sekunder, og fordelt til henholdsvis analyser av frie aminosyrer (2,2 ml) og gel elektroforese (500μl), resten ble oppbevart som backup ved -20
°C. Alle prøvene fryst ved hjelp av flytende nitrogen og oppbevart ved -20 °C. Den duodenale fordøyelsen ble satt i gang 15 min etter G60, for å sikre tid til å justere pH i prøven, samt tilsette duodenale enzymer. Tarmsaft (HDJ, 219 U/ml) og duodenal elektrolyttløsning (SIF) ble tilsatt. PH
ble justert til 7,0 ± 0,1 med 1M NaoH (Merck, Tyskland) før prøvene ble satt i vannbad. Etter homogenisering ved ultra turrax ble det tatt ut prøver etter 5 min. (D5), 30 min. (D30) og 120 min.
(D120). Alle enzymer, prøver ol, ble oppbevart på is og tint i isvann, med unntak av elektrolyttløsninger som ble oppbevart i vannbad. Figur 8 viser en oversikt over de ulike stegene i fordøyelsesprosessen og prøveuttak.
Figur 8. Flytskjema over ex vivo fordøyelse. Produkter ble standardisert, pasteurisert (69°C, 30 min) og UHT behandlet (90° C 120 min). Prøver, enzymer og elektrolyttløsninger ble tilsatt før justering av pH. Det ble foretatt uttak etter 60 min i gastrisk fase (G60), 5 min (D5), 30 min (D30) og 120 min (D120) i duodenal fase. Prøvene ble umiddelbart homogenisert 10 sek i ultra turrax og fryst ved hjelp av flytende nitrogen. Prøvene ble deretter lagret ved -20°C
3.3 Proteinseparering og degradering.
Identifisering av proteiner skjer ofte ved hjelp av fire ulike analysemetoder (O’Donnell et al.
2004). Proteinseparering, protein fordøyelse, MS analyser av peptider, samt observerte peptider sammenlignes med en database. Separering av proteiner kan gjøres på flere ulike måter, enten ved gel elektroforese eller væske kromatografi. Dette avhenger av hvilke fokusområder som skal
27 omtales. I denne oppgaven er det benyttet proteinseparering ved hjelp av Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforese (SDS- PAGE).
3.3.1 Proteinseparering ved natriumdodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS- PAGE).
SDS- PAGE er en metode der proteiner og andre makromolekyler separeres i henhold til størrelse ved bruk av elektroforese i en polyakrylamid gel (Laemmli 1970). Før elektroforesen ble prøvene tilsatt natriumdodecyl sulfat (SDS), som er en anionisk detergent. SDS tilsettes for at alle proteinene skal få en netto negativ ladning og videre kan separeres på bakgrunn av sin molekylvekt (MW). Prosedyren ble gjennomført i henhold til Bio Rad standard basert på
Laemmeli metoden. Alle løsninger som ble benyttet er basert på Bio-rad Laboratories anbefaling (Laboratories 2010). Prøvene opparbeides til samme konsentrasjon og tilsettes SDS-prøvebuffer tilsatt dithiotheitol (DTT) før proteinprøvene tilsettes. Prøvene ristes på vortex og varmes opp til 100 °C i 5 min., for denaturering av proteinene. Etter oppvarming avkjøles prøvene på is.
Deretter tilsettes 7 μL prøvemateriale i hver brønn, før start av gel elektroforese. Etter kjøring ved 200V i omlag 40 min ble gelene fiksert, farget med Comassie Blue og tatt bilde av. Gelene ble oppbevart i preserveringsløsning.
3.3.2 Tillaging av prøveløsninger til SDS-PAGE
På grunn av ulik proteinkonsentrasjon etter fordøyelse ble ufordøyde prøver og G60- prøvene til samtlige produkter fortynnet med destillert vann (dH2O) tilsvarende duodenalfase (1:4). Prøvene ble oppbevart på is før tilsetting av prøvebuffer (Laboratories 2010). Prøvebuffer ble tilsatt DTT (Sigma, Aldrich, USA) rett før prøvelaging. 100 μl prøvemateriale ble fortynnet 1:1 med
prøvebuffer og blandet på vortex (Vortex Genie 2, Heigal Scientific industries, Bohemia, N.Y, USA). Prøvene ble kokt på varmeblokk (Thermolyne Type 17600 Dri Bath, USA) ved 100 °C i ca. 5 min., for denaturering av proteinene. Prøvene ble deretter fryst ned til -20 °C og oppbevart fram til de skulle benyttes til gel elektroforese.
3.3.3 Tillaging av SDS polyakrylamidgel og elektroforese.
Ferdige 12% akrylamidgeler (Bio-Rad Mini-PROTEAN® TGX™, Hemel Hempstead, Herts, UK) ble benyttet. Gelene ble vasket med dH2O, strips i underkant ble fjernet, gelen ble deretter plassert i gelkammeret. 1x runningbuffer (Laboratories 2010), ble tilsatt i midten av
gelkammeret, resten av kammeret ble fylt opp 50 %. Figur 9 A og B viser anretningen
