Nylig isolerte stammer av Bradyrhizobium viser stor diversitet i fenotypiske karakterer ved denitrifikasjon

diversitet i fenotypiske karakterer ved denitrifikasjon

Newly isolated strains of Bradyrhizobium show high diversity in their denitrification phenotype

Guro Heen

Institutt for Kjemi, Bioteknologi og MatvitenskapMasteroppgave 60 stp. 2012

Denne oppgaven ble gjennomført ved Universitetet for Miljø- og Biovitenskap (UMB) ved Institutt for Kjemi, Bioteknologi og Matvitenskap (IKBM), avdeling mikrobiologi.

Hovedveileder for oppgaven var professor Åsa Frostegård og medveileder var PhD student Daniel Mania.

Jeg vil først og fremst takke veilederne mine for en fremragende opplæring og oppfølging under hele prosessen. Dere har gitt meg motivasjon og innspill i både laboratoriearbeid og under skriveprosessen. Jeg er imponert over deres engasjement og at dere alltid stiller opp for spørsmål og diskusjoner. Jeg vil også rette en takk til avdelingsingeniørene Else Marie Aasen og Rannei Tjåland som alltid har vært behjelpelige med utstyr og instrukser.

Til slutt vil jeg takke samtlige av studenter og ansatte på mikrobiologigruppa og nitrogengruppa for å ha inkludert meg og gitt meg en fin opplevelse som masterstudent på UMB.

Ås, mai 2012

Guro Heen

Denitrifikasjon er en respiratorisk prosess som utføres av mange prokaryoter under anoksiske forhold. Under denitrifikasjonsprosessen reduseres nitrat (NO3-

) til nitritt (NO2-

) og videre til gassene nitrogenmonooksid (NO), lystgass (N2O) og molekylært nitrogen (N2). For å utføre en fullstendig denitrifikasjon kreves de fire reduksjonsenzymene: nitrat reduktase (Nar/Nap), nitritt reduktase (Nir), nitrogenmonooksid reduktase (Nor) og dinitrogenokside reduktase (Nos). Til dags dato er denitrifikasjon kun studert på noen få modellorganismer, og det er ingen god kjennskap mellom fylogeni og funksjon. Hovedforskjellen mellom de denitrifiserende bakterier viser seg å være hvor mye gass som blir emittert av NO, N₂O og N₂. Denitrifikasjons prosessen kan bli trunkert dersom en organsime mangler et eller flere denitrifikasjonsgener, men den kan også påvirkes av faktorer som lav pH. En trunkert denitrifikasjon resulterer i utslipp av NO eller N₂O. N₂O er en klimagass som bryter ned ozonlaget og er 310 ganger større globalt oppvarmingspotensial enn CO2.

Denne oppgaven karakteriserer regulatoriske fenotyper av denitrifiserende organismer (DRP) for ulike stammer av Bradyrhizobium ved å studere gasskinetikk, samt ekspresjon av nirK og nosZ i overgangen fra oksiske til anoksiske forhold. DRP er en fellesbetegnelse for en rekke fenotypiske og regulatoriske karakteristikker som blir bestemt gjennom standardiserte eksperimenter. Det ble utført en sluttpunktanalyse for å få en generell oversikt over de 39 Bradyrhizobium stammenes siste reduksjonssteg i denitrifikasjonen. Ut i fra disse resultatene ble det valgt ut tre stammer (79b1, 87j1 og 104a) som hadde N2 som sluttprodukt, og som viste en viss fylogenetisk avstand mellom hverandre. Denitrifikasjonsmønstret til de tre stammene ble registrert i et semiautomatisk inkuberingssystem hvor gassene CO2, O2, NO, N₂O og N₂ ble målt. Transkripsjonen av nirK og nosZ ble kvantifisert for 79b1 og 104a gjennom Real Time PCR. Transkripsjonen ble linket til gasskinetikken og sammenliknet mellom de to stammene. Transkripsjonsanalysene viste at ekspresjon for nirK og nosZ økte når oksygenkonsentrasjonen ble lav. For samtlige av stammene var ekspresjonen for nosZ generelt lavere enn nirK. Under transkripsjonsanalysene hadde kulturene et høyere celletall en hva som var blitt benyttet i tidligere forsøk. Dette resulterte i en raskere overgang fra et oksisk til et anoksisk miljø. Under en slik rast transisjon viste stamme 104a en høy akkumulering NO, mens stamme 79b1 viste en stringent kontroll over NO produksjon. Stamme 104a viste også en liten produksjon av N₂ under samtlige av gasskinetikk-forsøkene, noe som kan bety at den redusere mesteparten av nitratet til ammonium gjennom DNRA.

på å støtte vår forståelse for denitrifikasjon og gi grunnlag for formulering og kalibrering av en biokjemisk modell med hensikt for å kunne forutsi responsen i et denitrifiserende mikrobielt samfunn. Med en slik modell kunne vi motvirke utslipp av drivhusgass fra jordbruksområder.

Denitrification is a respiratory process that is carried out by many prokaryotes under anoxic conditions. During the process of denitrification, nitrate (NO3-

) is reduced to nitrite (NO2-

) and further on to the gases nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O) and molecular nitrogen (N₂). Four reductases are necessary to carry out complete denitrification: nitrate reductase (Nar or Nap), nitrite reductase (Nir), nitric oxide reductase (Nor) and nitrous oxide reductase (Nos). To date, denitrification is only studied in a few model organisms, and the relationship between phylogeny and phenotype is not well understood. The main difference between denitrifiers is the amount of gas that is emitted in form of NO, N₂O and N₂. Denitrification can be truncated if organisms lack one or more of the denitrification genes, but the process can also be affected by environmental factors like low pH. A truncated denitrification results in the emission of NO or N₂O. The latter is a greenhouse gas that destroys the ozone layer and has a global warming potential 310 times that of CO2.

This paper characterizes the denitrification regulatory phenotype (DRP) of different strains of Bradyrhizobium by studying gas kinetics, and the expression of nirK and nosZ during the transition from oxic to anoxic conditions. DRP is a collection of traits for a variety of phenotypic and regulatory characteristics that are determined through standardized experiments. An end-point analysis was preformed to obtain a general overview of the last reduction step in denitrification for 39 strains of Bradyrhizobium. Based on the results, three strains (79b1, 87j1 and 104a) were selected that had N2 as end product, and showed a certain phylogenetic distance to each other. The denitrification patterns of these three strains were determined in a semi-automatic incubation system where the gases CO2, O2, NO, N2O and N2

were measured. The transcription of nirK and nosZ was quantified for strains 79b1 and 104a by Real Time PCR. The transcription was linked to gas kinetics and compared between the two strains. Expression of nirK and nosZ increased after oxygen depletion. For both strains, expression of nosZ was generally lower than that of nirK. Cultures were grown to higher cell numbers for transcription analysis than for previous experiments, which resulted in a quicker transition from oxic to anoxic conditions. This caused high NO production and accumulation in strain 104a, while strain 79b1 had stringent control over NO production. Strain 104a also showed a low production of N₂ in all gas-kinetic experiments, which indicates that the fate of nitrate was another than denitrification, for example reduction to ammonium in DNRA.

This thesis provides phenotypic data from different strains of Bradyrhizobium and thereby supports our understanding of denitrification and aids the formulation and calibration of a

community to external factors. Such a model would enable us to counteract greenhouse gas emissions from agricultural sites.

Innholdsfortegnelse

Forord... I Sammendrag... II Abstract ... IV

1. Innledning ... 1

1.1 Nitrogensyklusen ... 2

1.1.1 Nitrogenfiksering ... 3

1.1.2 Ammoniumoksidasjon ... 4

1.1.3 Asimmilatorisk nitrat reduksjon ... 5

1.1.4 Ammonifikasjon ... 5

1.2 Disimmilatorisk nitratreduksjon ... 5

1.2.1 DNRA... 5

1.2.2 Denitrifikasjon ... 7

1.2.3 Nitrat reduktase ... 8

1.2.4 Nitritt reduktase ... 9

1.2.5 Nitric oxide reduktase ... 9

1.2.6 Nitrous oxide reduktase ... 10

1.3 Regulering av denitrifikasjon ... 10

1.4 Klima ... 11

1.5 Bradyrhizobium ... 13

1.5.1 Fylogeni, morfologi og metabolisme ... 13

1.5.2 Denitrifikasjons genene hos Bradyrhizobium japonicum ... 14

2. Materiell ... 17

2.1 Bakteriekulturer ... 17

2.2 Laboratorieutstyr og maskiner ... 18

2.3 Programvarer ... 19

2.4 Kit... 19

2.5 Proteiner og enzymer ... 20

2.6 Primere ... 20

2.7 Dyrkningsmedier, buffere og løsninger ... 20

2.7.1 Dyrkningsmedier ... 20

3.7.2 Buffere og løsninger ... 21

2.8 Kjemikalieliste... 23

3.2 Oppbevaring av Bradyrhizobium stammer ... 25

3.3 Dyrkning av Bradyrhizobium ... 25

3.4 Semiautomatisk inkuberingssystem for gasskinetikk-analyser ... 26

3.5 Sluttpunktanalyse ... 29

3.6 Celletall vs OD ... 29

3.7 Generasjonstid ... 31

3.8 Ekstraksjon av genomisk DNA... 31

3.8.1 Måling av DNA konsentrasjon ... 32

3.9 PCR ... 33

3.10 ERIC-PCR ... 34

3.11 Agarosegel-elektroforese ... 35

3.12 DNA ekstraksjon fra agarosegel ... 36

3.13 Sekvensering ... 37

2.3.5 Sekvenseringsinstrumentet ABI 3100 ved IKBM ... 37

2.3.7 GATC Biotech ... 38

3.14 TOPO kloning ... 39

3.14.1 Ligeringsreaksjon ... 40

3.15 Traskripsjonsanalysene ... 40

3.16 Nitrittmåling ... 41

3.17 Ekstraksjon av mRNA ... 41

3.17.4 Fjerning av genomisk DNA ... 43

3.17.5 Revers transkripsjon ... 44

3.17.6 Real Time PCR ... 44

4. Resultater ... 48

4.1 Sluttpunktanalyse ... 48

4.2 Analyser av gasskinetikk ... 52

4.3 Bestemmelse av celletall vs. OD ... 55

4.4 Primere ... 57

4.5 Plasmid ... 58

4.6 Gasskinetikk og transkripsjonsanalyser ... 59

5. Diskusjon ... 64

5.4 Transkripsjonsanalyse ... 68

5.5 Konklusjon og videre arbeid ... 70

6. Referanseliste ... 72

1. INNLEDNING

Slekten Bradyrhizobium, tilhører klassen α-proteobacteria, og inneholder mange ulike arter som fikserer molekylært nitrogen i symbiose med belgvekster. Det finnes en stor diversitet blant nitrogenfikserende bakterier og det oppdages og beskrives stadig nye arter.

Bradyrhizobium er mest kjent som en mikrosymbiont til den økonomisk viktige planten Glycine max soya, men danner også nitrogenfikserende symbiose med flere andre belgevekster som for eksempel Acacia, Albizia gummifera, Erythrina brucei, Faidherbia albida, Millettia ferruginea og Sesbania sesban (Kosslak et al. 1987; Mesa et al. 2001). På bakgrunn av dette er Bradyrhizobium mest undersøkt som en nitrogenfikserende bakterie, men i tillegg til dette kan Bradyrhizobium også utføre andre nitrogentransformasjoner som respirerende denitrifikasjon og DNRA, og det er der hovedfokuset vil ligge i denne oppgaven.

Til dags dato er denitrifikasjon kun undersøkt for noen få modellorganismer innen α- og γ- proteobacteria (Zumft 1997). Hovedforskjellene mellom disse modellorganismene viser seg å være hvordan denitrifikasjonen blir regulert, og derved hvor mye mellomprodukter som blir emittert. Et eksempel på en bakterie som utfører en trunkert denitrifikasjon er Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens tilhører α-proteobacteria og er en denitrifiserende organisme som mangler genet som koder for dinitrogenokside reduktase (Baek et al. 2008). For å få mer kunnskap om hvordan de regulatoriske systemene i denitrifikasjon kontrollerer utslipp av gassene NOx (NO, NO2 og N2O)er det nødvendig med mer data fra flere ulike fenotyper. For å kunne sammenlikne denitrifiserende bakterier må det utføres fenotypiske forsøk samt studier av funksjonelle egenskaper. Fenotypiske særpreg kan beskrives ved å analysere gasskinetikk til ulike organismer i overgang fra oksiske til anoksiske forhold med tilstedeværelse av nitrat eller nitritt i mediet. For å kunne sammenlikne ulike bakterier må de dyrkes under så like forhold som mulig og det må bli en enighet om hvilke parametere som skal måles. Bergaust et al. (2011) foreslo et antall slike parametere for å karakterisere denitrifikasjon regulatoriske fenotyper (DRP). To organismer som er blitt nøyere studert med hensyn på DRP er Paracoccus denitrificans (Bergaust et al. 2010) og Agrobacterium tumefaciens (Bergaust et al. 2008). Gasskinetikkforsøk viste at P. denitrificans har en større strigent kontroll over NO produksjon enn hva som ble sett hos A. tumefaciens. En forklaring til dette kan være at A. tumefaciens er en plantepatogen bakterie. Det er derfor sannsynlig at den blir eksponert for NO fra planten, noe som har gjort den mer tolerant for NO (Bergaust et al. 2008).

I denne oppgaven ble det sett nærmere på forholdet mellom fylogeni og funksjon av flere stammer innen Bradyrhizobium. For noen utvalgte stammer ble det også utført gasskinetikk og transkripsjonsanalyser for genene nirK og nosZ for å se nærmere på genotypiske og fenotypiske denitrifikasjonsmønstre. En detaljert karakterisering av denitrifikasjonen hos ulike stammer av Bradyrhizobium er ønskelig for å kunne få en bedre forståelse av NO og N2O utslipp fra komplekse systemer.

1.1 Nitrogensyklusen

Av den totale mengden nitrogen som finnes på jorden er omtrent 90 % bundet som gassform i atmosfæren, hvor de i all hovedsak forekommer som nitrogenmonoksid (NO), lystgass (N2O) og molekylært nitrogen (N₂). Av disse utgjør N₂ rundt 78 % av atmosfærens innhold, en gass som for fleste organismer er biologisk utilgjengelig. For at det inaktive nitrogenet (N₂) skal bli biologisk tilgjengelig for de fleste organismer må det konverteres til oksidert nitrogen (NO₂^- og NO₃^-) i biosfæren eller til nitrogenoksidene (NO_x; NO, NO₂ og N₂O) i atmosfæren.

Nitrogen kan også benyttes i redusert form som ammoniakk (NH₃) og ammonium (NH₄⁺).

Nitrogen er et grunnstoff som forekommer naturlig både i organisk og uorganisk form. I levende celler er organisk nitrogen en essensiell byggestein for aminosyrer, proteiner, enzymer, klorofyll og nukleinsyrer (Canfield et al. 2010). Gjennom nitrogensyklusens kontinuerlige oksidasjons- og reduksjonstrinn er uorganisk nitrogen i stadig endring med hensyn på oksidasjonstall fra +5 (NO₃^-) til -3 (NH₃). De vanligste formene for uorganisk nitrogen er N2O, NO, NH4+

, NH3, NO2-

og NO3-

.

De aller fleste prosessene i nitrogensyklusen medieres av mikroorganismer og inneholder flere katalyserte prosesser som: nitrogenfiksering, ammoniumoksidasjon, assimilatorisk nitrat reduksjon, dissimilatorisk transformasjon, ammonifikasjon og ammonium assimilering (van Spanning et al. 2007).

Figur 1.1 En forenklet figur av nitrogensyklusen (Bothe et al. 2007).

1.1.1 Nitrogenfiksering

Under nitrogenfiksering omdannes molekylært nitrogen (N₂) fra atmosfæren til ammoniakk (NH₃) i biosfæren (Canfield et al. 2010). Fiksert nitrogen er et begrenset næringsstoff for planter og andre organismer, og de er derfor avhengig av denne biologiske prosessen for å få tilgang på nitrogenet (Franche et al. 2008). Den biologiske prosessen som konverterer molekylært nitrogen til ammoniakk utføres i all hovedsak av prokaryoter som: rhizobier, Frankia og cyanobakterier, men det er også funnet hos noen metanogene Archaea.

Nitrogenfikserende bakterier står for hele 65 % av all nitrogen tilgjengelig i biosfæren (Lodwig et al. 2003). Nitrogenfiksering kan utføres av frittlevende bakterier i jord, eller bakterier som lever i symbiose med belgplanter dersom nitrogen er en begrenset ressurs i biosfæren (Newton 2007). Det er oftest bakterier innenfor rhizobia som innleder et symbioseforhold med belgplantene. Rhizobia er et felles navn for α-proteobacteria og omfatter: Allorhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Ensifer (tidligere kjent som Sinorhizobium) og Methylobacterium. Men det er også registrert at belgvekster kan innlede symbioseforhold med noen β-proteobacteria som Burkholderia og Cupriavidus (Dresler-Nurmi et al. 2009).

For at et symbioseforhold skal innledes starter den kompatible planten med å skille ut flavonoid fra røttene ut i rhizosfæren. Dette signalet fanges opp av rhizobienes spesifikke reseptor NodD, som trigger transkripsjonen av bakteriens noduleringsgener. Dette innebærer

produksjon av signalmolekylet, lipo-chitooligosakkarid også kalt nod-faktoren, som sendes ut til den kompatible planten (Franche et al. 2008). Nod faktoren registreres av spesifikke reseptorer i planterøttene som trigger rothårene til å krølle seg rundt bakterien slik at det dannes en symbiosome membran rundt bakterien. Inne i rothårene vil det dannes spesielle infeksjonsrør slik at bakterien kan komme inn til selve roten der det vil dannes rotknoller.

Inne i rotknollene vil bakteriene svelle opp og omgis av en bakteroidmembran. Etter denne morfologiske forandringen, som man mener er irreversibelt, kalles bakterien for en bakteroide (Franche et al. 2008). Under nitrogenfiksering skilles det ut ammonium til plantens rotceller.

Videre bruker planten dette til å syntetisere aminosyrer og amider. I gjengjeld transporterer planten sukrose til nodulen hvor dikarboksyl syre gir bakteroiden karbon og energi gjennom symbiosom membranen (Stougaard 2000).

Nitrogengass (N₂) er svært stabilt og den sterke trippelbindingen (N≡N) som holder molekylet sammen har en bindingsenergi på 940 kJ. Det kreves en stor mengde aktiveringsenergi for å bryte disse båndene. I alt brukes det 16 energiekvivalenter i form av ATP for å fiksere ett N₂ molekyl (Canfield et al. 2010). Nitrogenfiksering katalyseres av det oksygensensitive enzymet nitrogenase. Det er et kompleks enzym som deles inn i to separate proteiner: dinitrogenase og dinitrogenase reduktase. Enzymet inneholder jernprotein og jernmolybdenprotein som vil oksiderer og slutte å fungere dersom de kommer i kontakt med oksygen. Nitrogenfiksering forekommer under mikroaerobe og anaerobe forhold. Under mikroaerobe forhold må bakterien beskytte nitrogenase enzymet mot eksponering av oksygen. De frittlevende cellene kan produsere et slimlag rundt cellen eller holde respirasjonen på et nivå slik at oksygenkonsentrasjonen holdes nede. Under dannelse av noduler, som beskrevet ovenfor, får bakteroiden tilført oksygen fra planten under kontrollerte forhold av det oksygenbindende planteproteinet leghemoglobin (Stacey 2007).

1.1.2 Ammoniumoksidasjon

Som vist i figur 1.1 dannes ammonium fra nitrogenfiksering og fra nedbryting av organisk materialet gjennom ammonifikasjon. Ammoniumoksidasjon eller nitrifikasjon er en oksidativ prosess som konverterer ammoniakk (NH₃), ammonium (NH₄⁺) og enkle nitrogenforbindelser til nitritt (NO₂^-) eller videre til nitrat (NO₃^-) i biosfæren. Denne prosessen er energigivende og utføres av forskjelling autotrofe β-proteobakterier (Nitrosomonas og Nitrosospira), γ- proteobakterier (Nitrococcus), planctomycetes og Thaumarchaeota, er et fylum innen Archaea (Huang 2010).

Eksempel på bakterier som utfører ammonuimoksidasjon er Nitrosonomas og Nitrococcus (1) som reduserer ammoniakk til nitritt, før Nitrobacter (2) tar steget videre og reduserer nitritt til nitrat.

NH3 + O2 → NO2-

+ 3H⁺ + 2e^- Nitrosomonas eller Nitrococcus (1) NO2-

+ H2O → NO3-

+ 2H⁺ +2e^- Nitrobacter (2)

Ammoniumoksidasjon kan også forekomme under anoksiske forhold og kalles da for anammox. Under anammox oksideres ammonium (NH4+

) til molekylært nitrogen (N2) hvor nitritt (NO2-

) brukes som en elektronakseptor.

1.1.3 Asimmilatorisk nitrat reduksjon

Planter har et stort behov for nitrogen for å kunne vokse. På grunn av at det som oftest er et lavt nitrogeninnhold i jorden har planten et sensitivt opptakssystem slik at plantene kan benytte seg av de nitrogenkildene som er tilgjengelig. De mest brukte er NH₄⁺ og NO₃^-. Assimilatorisk nitrat reduksjon er det eneste trinnet som kan utføres av en høyere livsform som fotosyntetiserende planter. Nitrat som tas opp i røttene blir enten redusert til nitritt i cytosolen av assimilatorisk nitrat reduktase eller lagret i vakuoler. Nitritten transporteres deretter til plastider hvor det reduseres til ammonium (NH₄⁺) av assimilatorisk nitritt reduktase. Ammonium benyttes videre til syntese av glutamin eller glutamat, som fungerer som nitrogenkilde for syntese av andre aminosyrer (Tischner & Kaiser 2007).

1.1.4 Ammonifikasjon

Ammonifikasjon er nedbrytning av nitrogenholdige komponenter hvor aminosyrer og nukleotider reduseres til ammonium (NH4+

) (Maier et al. 2009).

1.2 Disimmilatorisk nitratreduksjon

Disimmilatorisk nitratreduksjon er en fellesbenevnelse for to ulike reaksjoner hvor begge starter med reduksjon av nitrat. Disse to reaksjonene er: dissimilatorisk nitrat reduksjon til ammonium (DNRA) og denitrifikasjon.

1.2.1 DNRA

DNRA utføres av fakulative- og obligat fermentative bakterier (Silver et al. 2001). Selv om de fleste undersøkte stammene innen Bradyrhizobium er kjent for sin evne til å fiksere nitrogen,

kan de også utføre DNRA. I motsetning til denitrifikasjon (som beskrevet nedenfor 1.2.2), hvor nitrat blir redusert i flere steg til nitrogengass (N2), omdanner DNRA nitrat til ammonium (NH4+

) slik at nitrogenet forblir tilgjengelig i biosfæren (An & Gardner 2002). De to trinnene i DNRA katalyseres av to ulike enzymer, hvor den første reaksjonen innebærer reduksjon av nitrat til nitritt ved lav eller ingen O2 tilstedet. Neste steg innebærer reduksjon av nitritt til ammonium. Forskning har vist at DNRA er mindre sensitiv mot oksygen og variable redoks-forhold enn hva man ser i denitrifikasjon. I DNRA spiller forholdet mellom karbon og nitrogen en viktigere rolle. Under forhold med lav nitrogentilgang og sterke reduserende forhold, med mangel på elektronakseptorer, vil DNRA foretrekkes ettersom flere elektroner kan overføres per mol nitrat. Sammenlikner man den potensielle energien mellom denitrifikasjon (-2669kJ mol^-1 glukose) og DNRA (-1796kJ mol^-1 glukose) får man mer utbytte av å redusere all nitrogen tilgjengelig til N₂ gjennom denitrifikasjon. I et forsøk viste det seg at bakterier som utfører DNRA kan syntetisere opptil dobbelt så mye cellemasse per mol nitrat i motsetning til denitrifiserende bakterier (Strohm et al. 2007).

Selv om DNRA i all hovedsak konserverer nitrat til ammonium har noen bakterier vist produksjon av lystgass (N₂O) under DNRA. Et forsøk med isotopmerket ¹³NO₃^- og ¹³NO₂^- viste at mesteparten av nitratet ble omdannet til NH₄⁺, men at samtlige av organismene i forsøket også produserte noe merket N2O som ikke ble videre redusert (Bleakley & Tiedje 1982). Forsøket bekreftet at DNRA bakterier kan produsere ammonium og lystgass samtidig, men opptil 90 % av tilgjengelig nitrat går til ammoniumproduksjon. Dette varierte noe ved ulike dyrkningsforhold og det er vist at økt glukosekonsentrasjon i mediet reduserer produksjonen av lystgass og økter produksjonen av ammonium. For noen av bakteriene som utfører DNRA foregikk lystgassproduksjon etter at den stasjonære fasen var nådd (Bleakley &

Tiedje 1982). Produksjon av N2O mener man kan skylde at at DNRA bakterier prøver å forhindre en akkumulering av nitritt som reduseres i det første steget. En akkumulering av nitritt vil kunne skade bakterien på grunn av dens toksiske effekt ved konsentrerte mengder.

Ammonium er en nitrogenkilde som er tilgjengelig for et stort antall mikroorgansimer og planter. I en fremtidig klimautvikling kan det bli er større mangel på tilgjengelig nitrogen i økosystemene på grunn av økt CO₂ konsentrasjon i atmosfæren som igjen kan gi en økt forespørsel av nitrogen for plantene (Rütting et al. 2011).

1.2.2 Denitrifikasjon

Denitrifikasjon er en form for anaerob respirasjon hvor nitrat (NO3-

) reduseres til nitritt (NO2-

) og videre til gassene nitrogenmonooksid (NO), lystgass (N2O) og molekylært nitrogen (N2).

Denitrifikasjon utføres oftest av hetrotrofe prokaryoter innen α- og β – proteobacteria, men det er også oppdaget denitrifikasjonegenskaper hos spesifikke Archaea og sopp (Chen et al.

2003; Zumft 1997).

Ved å bruke nitrat eller nitritt som en terminal elektronakseptor genereres det en elektrokjemisk gradient over den cytoplasmiske membranen som kan brukes til å konservere energi i form av ATP, på samme måte som oksygen blir brukt som elektronakseptor under oksiske forhold. Reaksjonen blir katalysert av fire ulike komplekse-multisete metalloenzymer (Figur 1.2). For de tre første enzymene i denitrifikasjonsprosessen er det blitt karakterisert to ulike utgaver (Zumft 1997). Enzymene NAR eller NAP reduserer nitrat (NO₃^-) til nitritt (NO₂^- ), mens NIR reduserer nitritt (NO₂^-) til nitrogenmonooksid (NO). Nitrogenmonooksid (NO) reduseres videre til lystgass (N₂O) av NOR, hvor N2OR står for det siste reduksjonssteget og reduserer lystgass (N₂O) til sluttproduktet nitrogengass (N₂) (Philippot & Hallin 2005).

Denitrifikasjonsenzymene uttrykkes med nitrat tilstedet og ved liten eller ingen tilstedeværelse av oksygen. På denne måten kan bakterien fortsette å få energi gjennom respirasjon selv om tilgjengeligheten på oksygen er begrenset eller fullstendig borte. Øker konsentrasjonen av oksygen vil dette hemme aktiviteten til de denitrifiserende enzymene og bakterien vil igjen benytte seg av aerob respirasjon, med O2 som terminal elektronakseptor (Zumft 1997). Dette er ettersom O2 gir mest energi i form av ATP (∆G° = -238 kJ) sammenliknet med denitrifikasjon (∆G° = -224 kJ).

Hele prosessen fra nitrat til nitrogengass kalles for den fullstendige denitrifikasjonen, men ikke alle denitrifiserende bakterier har nødvendigvis alle genene. Noen denitrifikasjonsbakterier vil kun klare å redusere etter eller flere av de fire reduksjonsstegene som utgjør en fullstendig denitrifikasjon. Et eksempel på dette er Rhizobium sullae som kun inneholder et reduksjonssteg og kan bare redusere nitritt (NO2-

) til nitrogenoksid (NO) (Casella et al. 2006).

Figur 1.2: Beskrivelse av denitrifikasjonen og genene (vises i kursiv) som koder for de ulike reduktasene.

Reduksjonen fra nitrat til nitritt katalyseres av membranbundet- (NAR) eller periplasmisk (NAP) nitrat

reduktase. Nitritt reduseres videre til NO og katalyseres av cytocrom cd1- (Cd-NIR) eller kopper (Cu-NIR) nitritt reduktase. NO reduseres til N2O av (NOR) eller (qNOR) nitric oxide reduktase. Reduksjonen av N2O til N2

katalyseres av nitrous oxide reduktase (NOS). (Philippot & Hallin 2005).

1.2.3 Nitrat reduktase

Det første steget i denitrifikasjonsprosessen starter med en reduksjon av nitrat (NO3-

) til nitritt (NO2-

). Denne to-elektron reduksjonen katalyseres av enzymet nitrat reduktase, og finnes i tre distinkte klasser: respiratorisk nitrat reduktase (NAR), og periplasmisk nitrat reduktase (NAP) og assimilatorisk nitrat reduktase (NAS). Samtlige av disse enzymene inneholder kofaktoren Mo-bis-molybdopterin guanine dinukleotid (Mo-bis-MGD) på det aktive sete og inneholder minimum en 4Fe-4S kluster (Richardson et al. 2001).

Respiratorisk nitrat reduktase (NAR) kodes av operonet NarGHI som er bygget opp av de tre subenhetene: NarG, NarH og NarI. NarG, α-subenheten, består av det katalytiske sete hvor selve reduksjonen finner sted. NarH, β-subenheten, inneholder fire Fe-S enheter: en med 3Fe- 4S og tre enheter med 4Fe-4S. Både NarG og NarH er lokalisert i cytoplasma hvor NarH er bundet til NarI. NarI er γ- subenheten, som er et intergrert membranprotein som består av fem transmembrane helikser, hvor den N-terminale enden vender mot periplasmaen. NarI inneholder to heme b, en lav potensial (heme bl) og en med høyt potensiale (heme bh). Under

nitratreduksjon oksideres quinol i periplasmaen slik at H⁺ frigis og to elektroner går fra heme bl til heme bh. Det dannes en elektrongradient over membranen slik at elektronene fra heme bh

i NarI doneres til 3Fe-4S i NarH og videre til NarG og det katalytiske sete hvor nitrat (NO3-

) reduseres til nitritt (NO2-

). Periplasmatisk nitrat reduktase (NAP) er bygget opp av to- subenheter lokalisert i periplasma. Den katalytiske subenheten (NapA) binder bis-MGD kofaktoren og en 4Fe4S kluster, samt en elektron overførende subenhet (NapB) som binder to c-type heme. Som NAR, er NAP også forbundet til quinol oksidasjon i elektrontransportkjeden hvor den er koblet sammen via en membranankret tetraheme cytocrom. Reduksjon av nitrat gjennom NAP kan kun bli koblet til fri energi transduksjon dersom quinone reduktase genererer en H+ elektrokjemisk gradient (Richardson et al. 2007).

Assimilatorisk nitrat reduktase (NAS) er lokalisert i cytoplasmaen, reduserer også nitrat, men deltar i nitrogenassimilering, og er ikke en del av noen respiratorisk nitrat reduktase system.

Selv om dette enzymet ikke er fullstendig forstått er det kjent vi at enzymet ikke er delaktig i denitrifikasjonen.

1.2.4 Nitritt reduktase

Dissimilatorisk nitritt reduktase (NIR) tar del i trinn to i denitrifikasjonen og reduserer nitritt (NO₂^-) til gassen nitrogenmonooksid (NO).

NIR kan inndeles i to ulike klasser, Cu inneholdende respiratorisk nitritt reduktase CuNIR med en kofaktor som inneholder kobber, og cd₁ nitritt reduktase cd₁NIR som inneholder heme. Genene som koder for disse apoproteinene er nirK (CuNIR) og nirS (cd1NIR). CuNIR finnes i både gram negative og gram positive bakterier hvor primærstrukturen er relativt godt konservert. Den er bygget opp av en homotrimer hvor hver av de tre identiske subenhetene består av to distinkte domener. cd1NIR er en homodimer og hver av subenhetene inneholder en heme c og en unik heme d1. cd1 enzymet er et periplasmatisk løselig protein. Nitritt reduksjonen bør ha en streng regulering ettersom store mengder NO er toksisk (Zumft 1997).

1.2.5 Nitric oxide reduktase

NOR er et kompleks intergrert metalloenzym og medlem av heme-kobber oksidase superfamilien. NOR finnes som to utgaver: bc-heme inneholdende nitric oxide oxidereductase cNOR og b-heme inneholdende nitric oxide oxireductase qNOR.

cNOR består av to subenheter, den heme c inneholdende subenhet NorC som består av en enkel transmembran α-heliks og sen store heme b inneholdende subenhet NorB. Denne subenheten er svært hydrofob med 12 transmembrane α-helikser. qNOR består av en enkel enhet og er inaktiv ved tilstedeværelse av cytocrome c som elektrondonor, men kan benytte seg av QH2 eller MQH2 (Hendriks et al. 2000).

1.2.6 Nitrous oxide reduktase

I det siste trinnet av denitrifikasjonen blir N2O redusert til N2. Reaksjonen katalyseres av et reduksjonsenzym, dinitrogenoksid reduktase N2OR, som kodes av genet nosZ. N2OR er det eneste reduktaseenzymet som kan redusere lystgass til molekylært nitrogen og utgjør en utrolig viktig prosess i nitrogensyklusen. N2OR er et multikopperprotein som består av en homodimer hvor hver monomer består av to domener. Hvert domene består av en C-terminal domene som bærer Cu(A) sete, samt en N-terminal domene hvor Cu(Z) sitter. Cu(A) er et elektronoverføringssenter som overfører elektroner fra Cu(A) til Cu(Z) (Haltia et al. 2003).

Genet eksisterer kun hos prokaryote og er svært viktig for å forhindre et økt utslipp av lystgass (N₂O) (Zumft 2005).

1.3 Regulering av denitrifikasjon

Denitrifikasjonsprosessen påvirkes av miljøfaktorer som: vanninnhold, temperatur og tilgjengelig karbonkilde. I tillegg til dette er denitrifikasjonsbakterier avhengig av tilgang på N-oksider for å kunne initiere denitrifikasjonen når oksygenkonsentrasjonen er redusert (Wallenstein et al. 2006). Under selve denitrifikasjonen er det to nøkkelfaktorer som anses som avgjørende for at prosessen skal kunne fullføre reduksjonen til sluttproduktet N2. Disse to faktorene er at oksygen forblir fraværende under hele denitrifikasjonsprosessen og at pH’en ikke reduseres. Dersom disse forhold ikke opprettholdes kan det føre til at gassene NO og N2O ikke reduseres videre til N2, men slippes ut i atmosfæren. N2OR er sensitiv mot oksygen og en undertrykkelse av denne reduktase vil føre til en akkumulering av N2O som diffunderer ut i atmosfæren. Dette er svært uønsket ettersom N₂O er en potensiell drivhusgass som vil skadeliggjøre ozonlaget.

En annen faktor som øker utslippet av NO og N₂O er jord med lav pH. Dette fenomenet er uavhengig av bakteriens pH optimum slik at lav pH legger en universell begrensning på reduksjonen av N₂O til N₂. Forklaringen på pH effekten er at N₂O-reduktase enzymet, som er lokalisert i periplasmaet hos gram negative bakterier, er følsom for lav pH. En analyse av

gasskinetikken og genuttrykkelse fra Paracoccus denitrificans i ulik pH (Bergaust et al. 2010) viste at det i større grad var fullstendig denitrifikasjon hos pH 7 – 7.5, men en trunkert denitrifikasjon hos kulturene som ble dyrket i pH 6. Resultatene for kvantifisering av transkribert gen for reduksjonsenzymene samstemte derimot ikke med observasjonen fra gassmålingene. Transkripsjonen av nosZ viste riktignok stor nedgang ved lav pH og det samme ble vist for nirS. Ratioen mellom nosZ og nirS ved pH 6 var lik med hva som ble vist ved pH 7, noe som forklarte den lave gassproduksjonen, men ikke N2O utslippet. Dette forsøket viste at organismen ikke hadde mulighet til å syntetisere et funksjonelt N2O reduktase enzym under en lav pH. På bakgrunn av dette ble det utført et forsøk hvor den samme bakterien ble dyrket opp i flasker med pH 6 og pH 7 tilsatt N₂O. Kulturene fra medie med pH 7 viste en rask reduksjon av N₂O til N₂, mens kulturene ved pH 6 viste ingen reduksjon. Bakteriene fra medie med pH 7 ble overført til nytt medie med nitrat og ved ulik pH: 6, 6.5, 7 og 7.5. Etter at bakteriene hadde redusert nitratet ble det injisert N₂O til flaksene.

Etter injiseringen ble det jevnlig tatt prøver for å studere N₂O-reduktase aktiviteten.

Resultatene viste at de cellene som ble tatt fra pH 7 og inokulert i medie med lavere pH (pH 6) kunne fortsatt redusere en viss del av N₂O som var i tomrommet, men over en lengre tidsperiode. Ettersom nosZ ble transkribert ved lav pH ble det foreslått at hemmingen av N₂O reduktase enzymet skyldes et posttranskripsjonelt steg hvor proteinet ikke får fullført foldingen i periplasma slik at det ikke blir et funksjonelt enzym, eller at integreringen av kopper inn i det aktive setet ikke fungerer som det skal (Bergaust et al. 2010).

1.4 Klima

Sammenliknet med den pre-industrielle tiden har nåtidens menneskelige og biologiske aktivitet økt det reaktive nitrogenet i biosfæren fra 270 ppm til 319 ppm i 2005 (Wofsy et al.

2007). En viktig årsak til denne økningen skyldes en hyppigere bruk av nitrogenholdig gjødsel for å fremme planteveksten og derved øke produksjon av mat (Vitousek et al. 1997).

En grunn til utslipp av nitrogenholdige gasser i atmosfæren skyldes prosesser fra nitrogensyklusen. Sluttproduktene fra nitrifikasjon og denitrifikasjon er henholdsvis NO3-

og N₂, men allikevel er det en viss prosent av nitrogenet som passerer disse biokjemiske reaksjonene som blir frigitt ut i atmosfæren som nitrogenmonoksid (NO) og lystgass (N₂O).

På bakgrunn av disse opplysningene ble det utviklet en modell som ble kalt for ”Hole in the pipe” modellen (Figur 1.3) (Firestone et al. 1989).

Figur 1.3: Demonstrerer ”Hole in the pipe” modellen, hvor det er et utslipp av NO og N2O i både nitrifikasjon- og denitrifikasjonsprosessen (Davidson & Verchot 2000).

Av den totale mengden lystgass (N₂O) i atmosfæren, blir 70 % produsert fra bakterier i jord hvor største delen kommer fra denitrifiserende bakterier (Mosier 1998; Sutton et al. 2011).

N₂O er betydningsfull drivhusgass i den forstand at den har et 310 ganger større GWP (global oppvarmings potensial) enn CO2. Når N2O slippes ut i troposfæren er den en stabil gass, men i stratosfæren ødelegger N₂O stratosfærisk ozon (Ravishankara et al. 2009). Det vises en stadig økning av N2O i atmosfæren, og det er blitt registrert en kontinuerlig økning på 0.3 % hvert år. Lystgass har en lang halveringstid slik at konsentrasjonen i stratosfæren vil forbli høy over en lengre periode selv om mengde utslipp reduseres (Hansen et al. 2005). Utslipp av klimagasser er med på å påvirke energibalansen i klimasystemet og bidrar til endringer i atmosfærens sammensetning med hensyn på mengden aerosoler, arealdekke og solstråling.

En økt produksjon av drivhusgasser vil forsterke den globale oppvarmingen. Som vist i figur 1.4 vil noen av solens strålinger som treffer jorden alltid reflekteres tilbake ut til atmosfæren.

Disse refleksjonsstrålene er mer langbølget enn de kortbølgede elektromagnetiske strålene som solen avgir. Disse langbølgede strålene vil bli absorbert av gassmolekylene (N2O, CO2, CH₄ og H₂O). Denne absorpsjonen fører til økt temperatur i atmosfæren og varmeenergien fra atmosfæren vil sendes tilbake til jorden. På denne måten får jorden en dobbel varmestråling:

direkte fra solen og igjen indirekte fra atmosfæren. I den øvre stratosfæren vil UV-strålinger oksidere N₂O til NO. NO er et høyt reaktivt fritt radikalt som ved konservert mengde kan være giftig. I stratosfæren vil NO fører til ødeleggelse av ozonlaget og beskyttelsen mot UV- strålinger vil reduseres (Bothe et al. 2007).

Figur 1.4: Illustrerer hvilke påvirkning NO og N2O samt andre gasser påvirker drivhuseffekten (Bothe et al.

2007).

1.5 Bradyrhizobium

1.5.1 Fylogeni, morfologi og metabolisme

Bradyrhizobium er en fakultativ anaerob, gram negativ, α-proteobacteria som kan leve fritt i jorden, eller danne et nitrogenfikserende symbioseforhold med belgvekster (Willey et al.

2008). Cellene er formet som korte staver og er bevegelige ved en polar eller subpolar flagelle (Jordan 1982). Bradyrhizobium tilhører orden Rhizobiales, sammen med slektene: Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer (tidligere kjent som Sinorhizobium), Allorhizobium og Azorhizobium (Sawada et al. 2003).

Disse bakteriene viser en stor diversitet, både geografisk og taksonomisk (Saeki et al. 2010).

Basert på DNA-DNA hybridiseringsforsøk ble det vist at bakterier som danner noduler i belgvekster kan deles inn i to grupper. De bakteriene som vokser raskt og er syreproduserende: Rhizobium, Agrobacterium, Allorhizobium, Ensifer og Mesorhizobium og de andre bakteriene som er saktevoksende og ikke-syre produserende er Bradyrhizobium (Jordan 1982). Denne inndelingen er fortsatt gjeldene. Til dags dato er det identifisert ni

Bradyrhizobium arter, og disse er: Bradyrhizobium canariense, Bradyrhizobium denitrificans (tidligere kjent som Blastobacter denitrificans), Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium iriomotense, Braadyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium jicamae, Bradyrhizobium liaoningense, Bradyrhizobium pachyrhizi og Bradyrhizobium yuanmingense.

Som frittlevende celler i et oksygenrikt miljø vil Bradyrhizobium få energi gjennom aerob respirasjon. Dersom mengde oksygen i omgivelsene reduseres kan bakterien gå over til anaerob respirasjon, med denitrifikasjon (Bedmar et al. 2005). Denne egenskapen er ikke stort utbredt blant rizobia og til nå er det kun B. japonicum og A. caulinodans som har blitt klassifisert som ekte denitrifiserende bakterier.

1.5.2 Denitrifikasjons genene hos Bradyrhizobium japonicum

Hos samtlige av Bradyrhizobium stammene som er blitt undersøkt er genene som koder for denitrifikasjonsreduktasene lokalisert i kromosomet (Kaneko et al. 2002). Genene som er knyttet til denitrifikasjon hos Bradyrhizobium japonicum er identifisert som: napEDABC (involvert i nitrat reduktase), nirK (Involvert i nitritt reduktase), norCBQD (involvert i nitrogenmonooksid reduktase) og nosRZDFYLX (involvert i dinitrogenokside reduktase) (figur 1.6) og koder for de respektive for enzymene: nitrat-, nitritt-, nitric oxide- og nitrous oxide reduktase (Bedmar et al. 2005).

Under denitrifikasjon overføres elektroner fra NADH dehydrogenase og sukksinat dehydrogenase til ubiquinon som genererer ubiqunol. Elektronene fraktes fra ubiqunol til respiratorisk nitrat reduktase eller reduktasen for nitritt, nitrogenmonookside og dinitrogenokside gjennom cytokrom bc1. B. japonicum har tre løslige c-type cytokromer C550,

C552 og C555 kodet av genene cycA, cycB og cycC. Cytokrom C550 kodes av genet cycA og er involvert i elektronoverføringen til nirK fra blant annet cytokrom bc1 (Bueno et al. 2008).

Transkripsjon av de genene som koder for nitrogenoksid reduktasene reguleres av proteiner som tilhører cyclic AMP reseptor protein (CRP) og fumarat og nitrat reduktase regulatoren (FNR). Transkripsjon av genene nir, nor og nos promotor region avhenger av FixLJ og FixK2

genene som danner den regulatoriske kaskaden FixLJ-FixK2. FixLJ er et to-komponent reguleringssystem som består av en heme basert sensor kinase FixL og regulatoren FixJ som kontrollerer FixK₂. Proteinet FixK₂ fungerer som en aktivator for transkripsjon til flere gener involvert i anaerob og aerob metabolisme. FixK2 tilhører den oksygensensitive

proteinfamilien FNR (fumarat og nitrat reduktase regulator) og CRP (syklisk AMP reseptor transkripsjonsregulator) (Mesa et al. 2004). Når oksygenkonsentrasjonen i miljøet rundt cellen avtar aktiveres uttrykkelsen av FixLJ og FixK2. FixK2 aktiverer nnrR som koder for FNR/CRP regulatoren NnrR. Studier tyder på at nitrogenoksid mediert induksjon av genene nap, nir og nor avhenger av NnrR. Induksjon av norCBQD promotoren er fullstendig avskaffet ved fravær av nnrR genet (Bedmar et al. 2005).

Figur 1.5 Organisering av denitrifikasjonsgenene hos Bradyrhizobium japonicum.

Operonet napEDABC koder for enzymet periplasmatisk nitrat reduktase (NAP) som reduserer nitrat til nitritt. NAP enzymet oksiderer quinol som vil tillate cellen å vokse under oksygenbegrensede forhold (Delgado et al. 2003). Operonet som koder for NAP (Figur 1.5) er satt sammen av fem ulike gener: napA koder for MGD (molybdopterin guanine-dinucleotide cofactor). napB koder for en elektron-transfer subenhet, dihaem cytochrome c, napC koder for en memebranbunden c-type tetrahem cytocrome. napE koder for et transmembran protein, med ukjent funksjon. napD genet koder for et løselig protein som spiller en rolle i modningen av napA (Delgado et al. 2003).

nirK genet koder for syntetiseringen av kobber - inneholdende nitritt reduktase NIR. Det er ansvarlig for en en-elektron reduksjonen av nitritt (NO2-

), til den første gass intermediaten i

denitrifikasjonen, nitrogenmonooksid (NO). NIR enzymet kodes av kun ett enkelt gen (Bedmar et al. 2005). I B. japonicum er det funnet to ulike NIR enzymer med ulike redoks aktive sentere, enzym som inneholder c- og d1-type haem, og et annet som har Cu som det redoks-aktive transisjons metall. Til nå er det ikke funnet en organisme som har hatt begge disse enzymene. NIR er et løselig protein som i foldet tilstand blir fraktet til pereiplasma gjennom et tvilling-argenin translokeringssystem (TAT).

norCBQD operonet koder for c-type nitric oksid reduktase og står for en to-elektron reduksjon av nitogenmonooksid (NO) til lystgass (N2O). I reaksjonen dannes det ett N-N bånd. Nor-operonet inneholder et kluster av fire ulike gener (Bedmar et al. 2005), med norC og norB som koder for cytocrome c-inneholdende subenhet II og cytocrom b-inneholdende subenhet I av cNor. norQ koder for et protein med et ATP/GTP bindende motiv, mens norD er av ukjent funksjon (Mesa et al. 2002).

Operonet nosRZDFYLX koder blant annet for den siste reduktasen i denitrifikasjonstrinnet, dinitrogenoksid reduktase som kodes av syv gener. nosR koder for et intergrert membranprotein som består av seks transmembrane helixer. Genet koder også for en C- terminal cytoplasmisk domene som inneholder to cystein klustere (Bedmar et al. 2005).

2. MATERIELL 2.1 Bakteriekulturer

Tabell 2.1: Oversikt over Bradyrhizobium stammene som ble benyttet i denne oppgaven. Stammene ble isolert ved to ulike metoder og utført av (Wolde-meskel et al. 2004b). Plantefrø ble sådd i jord som var blitt samlet inn fra 14 ulike lokasjoner. Etter vekst i drivhus ble noduler fra plantene samlet inn og stammene ble isolert. Denne metoden ble utført på Awassa College of Agriculture og geografisk opphav er derav merket med Awassa ACA. I den andre metoden ble stammer isolert fra noduler som var blitt gravd opp fra planter ute i naturen i den sørlige delen av Etiopia. Det geografiske opphavet beskriver plantens lokasjon. For en nærmere geografisk beskrivelse se figur 3.1.

Strain nr. Vertsplante 16S rDNA sekvens Geografisk opphav

29c F. albida B. liaoningense RFC

62a V. unguiculata Bradyrhizobium sp. Dilla 64a V. unguiculata B. yuanmingense Nazret 64b V. unguiculata B. yuanmingense Nazret 64c V. unguiculata B. yuanmingense Nazret 65c V. unguiculata B. yuanmingense Nazret

70c P. vulgaris B. liaoningense Akaki

79a E. brucei B. liaoningense Awassa ACA

79b1 E. brucei Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 79b3 E. brucei Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 79c2 E. brucei Bradyrhizobium sp. Awassa ACA

86b2 C. cajan B. liaoningense Awassa ACA

86d2 C. cajan Bradyrhizobium sp. Awassa ACA

87b1 M. ferruginea B. elkani Awassa ACA

87b3 M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 87h M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 87j1 M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 87j2 M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 87L M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 87m M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 87n M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Awassa ACA 92b A. gummifera Bradyrhizobium sp. Awassa ACA

92c A. gummifera B. japonicum Awassa ACA

92d A. gummifera B. japonicum Awassa ACA

92e A. gummifera Bradyrhizobium sp. Awassa ACA

94a F. albida B. elkani RFC

96c A. saligna Bradyrhizobium sp. Wondogene 96d A. saligna Bradyrhizobium sp. Wondogene

97a A. saligna B. japonicum Wondogene

101b A. saligna B. liaoningense Leku

101c A. saligna Bradyrhizobium sp. Leku

101e A. saligna Bradyrhizobium sp. Leku 104a A. saligna Bradyrhizobium sp. Bule 104b A. saligna Bradyrhizobium sp. Bule 104c1 A. saligna Bradyrhizobium sp. Bule 104c2 A. saligna Bradyrhizobium sp. Bule 104d A. saligna Bradyrhizobium sp. Bule 107a M. ferruginea Bradyrhizobium sp. Dilla

107e M. ferruginea B. elkani Dilla

Tabell 2.2: Andre organismer som ble benyttet

Stamme Kilde

Escherichia coli TOP10 Invitrogen

2.2 Laboratorieutstyr og maskiner

Tabell 2.3: Oversikt over utstyr og maskiner som ble benyttet

Utstyr Modell Produsent

Autoklav SX - 500E TOMY

Bordsentrufuge Minispin Eppendorf

Celleknuser FastPrep ® - 24 M. P. Biomedicals

Elektroforesekar Mini Sub® Cell GT BioRad

Filter Glass mikrofiber filter 25mm Whatman

Fluorescensmikroskop Leica DMRE Leica

Geldokumentasjon GelDoc BioRad

Kjøleskap sentrifuge 3500 Kubota

Magneter Triangulars 25 x 8mm VWR

Magnetrører Komet Variomag

Membranfilter Cyclopore track etced membrane

25mm

Whatman

Mikrobølgeovn Whirlpool

PCR maskin GeneAmp* PCR system 2700 A&B

pH - meter

Pipetter Finnpipetter (0,5-10 ul, 10-100 ul, 100-1000 ul, 1-5 ml)

Thermo Scientific

Robotarm GC injector 80 Agilent Technologies

RT-PCR Step One™ Plus A&B

Robot - sampler 7890A GC systems Agilent Technologies

Spektrofotometer 1 ND-1000 Nanodrop

Spektrofotometer 2 UV-1800 Shimadzu

Spektrofotometer 3 WPA Spectrowave Biochrom

Strømforskyning-gelelektroforese Power Pac 300 BioRad Vakuum filtreringsoppsettet Vacuum filtration manifold Millipore®

Vannbad F34 Julabo

Varmeblokk esco Provocell®

Vekt Sartorius

Vortex Labnet Int. Corp.

Qubit Qubit® Fluorometric Quantitation Invitrogen

2.3 Programvarer

Tabell 2.4: Oversikt over programvarene som ble benyttet

Dataprogram Produsent Bruksområdet

BioEdit Tom Hall Sekvenseringssøk

EZ Chrom Elite Agilent Technologies Aktivere GC

Nanodrop ND-1000 3.3.1. Thermo Fisher Scientific Kvantifisere nukleinsyrer

Python Python Software Foundation Kommandere robot

Serial Cloner Serial Basics Sekvenssammenstilling

UVProbe photometric Shimadzu Måle nitritt

2.4 Kit

Tabell 2.5: Oversikt over kittene som ble benyttet

Kit Bruksområdet Produktnummer

Power SYBR® Green PCR Master Mix RT-PCR 4367659

The Original TA Cloning® Kit pCR®2.1 vector Kloning 45-0046 BigDye® Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit Sekvensering 4337455

Qubit® dsDNA HS Assay Kit Kvantifisering Q32851

Qubit® RNA Assay Kit DNA/RNA Q32852

2.5 Proteiner og enzymer T4 DNA ligase

Taq DNA polymerase med 10x reaksjonsbuffer 2.6 Primere

Tabell2. 6: Oversikt over de ulike primersekvensene som ble benyttet i denne studien.

Gen Primer sekvens PCR

produkt

Tm

nirK¹_1 Fremover GGATGCTTCAGATGTTCACCCGCA 1117 bp 54

nirK_2 Revers CCTTGTCGCGTCTAGTTGGTGTTG

norCB_1² Fremover GCCGGACCCAGTAGAACATAGCGAGC 1683 bp 58

norCB_2 Revers CTACGGCGGCTCGGCTTTTTTCTTCG

nosZ_GH-F³ Fremover GGGTCAGACCAAGGAGGCGGA 261 bp 54

nosZ_GH-R Revers TGGCCTGCTTGACCGCATCG

nosZ ZF⁴ Fremover CGYTGTTCMTCGACAGCCAG 700 bp 55

nosZ ZR Revers CATGTGCAGNGCRTGGCAGAA

16S 27_F⁵ Fremover AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1465 bp 57

16S 1492_R Revers GGTTACCTTGTTACGACTT

1 og ² (Sameshima-Saito et al. 2006)

3 Heen. G. 2012

4 (Kloos et al. 2001)

5 (Lane 1991)

2.7 Dyrkningsmedier, buffere og løsninger 2.7.1 Dyrkningsmedier

YMB - Yeast-extract Mannitol Broth (Somasegaran & Hoben 1994) Mannitol 10 g

K₂HPO₄ 0.5g MgSO4 . 7H2O 0.2 g NaCI 0.1g

Gjær ekstrakt 0.5 g dH₂O opp til 1 liter

LB medium Tryptone 10 g Gjær ekstrakt 5 g NaCl 10 g

dH2O opp til 1 liter.

LB agar

Tilsett 12 g agar til flytende medium.

3.7.2 Buffere og løsninger Kloroform–isoamyl alkohol (24:1)

Bland 96 ml kloroform med 4ml isoamylalkohol.

50 % glyserol 29 mL 87 % glyserol 21 mL MQ-vann

Løsningen ble autoklavert ved 121 °C i 15 min og oppbevart ved romtemperatur.

1 x TE buffer 10mM Tris pH 8 1mM EDTA 50 x TAE

242 g 2 M Trizma®-base 57.1 ml 2 M Iseddik

100 ml 0.5 M EDTA (pH 8,0) dH2O opp til 1 liter.

Celite 10 % Celite 0.1 % TE buffer EDTA 125 mM

2.474 g EDTA (1M = 372.24 g/mol) ble løst i til sammen 100 ml MQ-vann. Løsningen ble sterilfiltrert og oppbevart ved romtemperatur.

Fargereagens – nitrittmåling Løsning A

20 g Aminobenzen sulfonamide 50 ml Ortofosforisk syre (85 %)

Tilsett Ortofosforisk syre (85 %) til 150 ml H2O og tilsett Aminobenzene sulfonamiden.

Juster volumet til 250 ml med H2O.

Løsning B

2 g N-(1-naphtyl)-1,2-diaminoethane dihydrochloride 250 ml H2O

Bland løsning A og B 1:1 før bruk. Beskytt løsningen mot sollys og oppbevar den ved 4 °C.

Monteringsløsning 5 ml 1xPBS

5 ml Glycerol

10 µl 10% parafenylendiamin (PPD) 3M Natrium Acetat

24.609 g Natrium Acetat (1M = 82,03 g/mol) ble løst i til sammen 100 mL MQ-vann og pH ble justert til 5,2. Løsningen ble sterilfiltrert og oppbevart ved romtemperatur.

New wash buffer 20 ml 100mM Tris HCl pH 7.5 100 µl 1M EDTA pH 8

20 ml 2M NaCl 59.9 ml 100% ethanol dH2O opp til 100 ml Solution K

50 ml 100 mM Tris HCl pH 8 2 ml 1M EDTA

5 ml 1M NaCl 1 g Sarkosyl

dH2O opp til 100 ml

2.8 Kjemikalieliste

Tabell 2.7: Alfabetisk oversikt med kjemisk formel og leverandør for de kjemikalier som ble benyttet i dette arbeidet.

Navn Kjemisk formel Leverandør

Agarose Invitrogen

Aminobenzenesulfonamide Merc

Ampicillin Sigma

Celite

di-Kaliumhydrogenfosfat K₂HPO₄ Merck

EDTA C₁₀H₁₆N₂O₈ Sigma

Etanol C2H5OH ARCUS

Etidium Bromide EtBr Sigma

Glycerol C3H8O2 Merck

Gjær ekstrakt Merck

Iseddik CH3COOH Merck

Isoamylalkohol (CH3)2CHCH2CH2OH Merck

Kaliumklorid KCl Merck

Kloroform CHCl3 Sigma

Magnesiumsulfat MgSO₄ Sigma

Mannitol C6H14O6 Merck

Natriumacetat NaC₂H₃O₂·₃H₂O Merck

Natriumklorid NaCl Merck

Ortofosforisk syre H₃PO₄ Merck

Parafenylendiamin (PPD) C₆H₄(NH₂)₂ Sigma

Sarkosyl C₁₅H₂₈NNaO₃ Sigma

Tris base C₄H₁₁NO₃ Sigma

Tris-HCl C4H11NO3 x HCl Sigma

Trizma® base NH₂C(CH₂OH)₃ Sigma

Tryptone Sigma

3. METODER

3.1 Isolering og rendyrking av Bradyrhizobium stammer

Stammene som ble benyttet i denne oppgaven ble isolert fra rotnoduler av belgevekster i Etiopia (Wolde-meskel et al. 2004a).

Isolering av Bradyrhizobium ble utført på to ulike måter. Den ene metoden kalles ”trapping”

(=”fangst”). Den innebærer at frø fra plantene F. albida, A. tortilis og A. seyal ble samlet inn i den sørlige delen av Etiopia og dyrket in vitro i innsamlede jordprøver fra 14 ulike lokasjoner (Figur 3.1). Dyrkningen ble utført på Awassa College of Agriculture (ACA). Plantespirene ble plassert i et drivhus og høstet etter 12 uker. Hos de plantene som viste nodulering ble nodulene fjernet og oppbevart i en silica gel som senere ble isolert for rhizobia. Silica gel vil absorbere fukt og forhindres en eventuell forråtnelse av nodulene under oppbevaringsprosessen. Silica gelen vil også hindre en invasjon av mikroorganismer fra eventuelle jordrester som kan forstyrre den senere isoleringsprosessen. I den andre metoden ble det gravd frem noduler fra utvalgte planter i naturen hvor det ble isolert bakterier direkte fra disse nodulene. En oversikt over de ulike lokasjonene der de ulike nodulene og jordprøvene ble innsamlet vises i figur 3.1.

Før isolering av bakteriene ble nodulene overflatesterilisert i 3 % NaOCl i 4 minutter og deretter renset med sterilisert vann. Nodulene ble knust og stryket ut på en petriskål med YMA. Petriskålene ble inkubert ved 28 °C i opptil 14 dager. De petriskålene som viste kolonier ble stryket over på nye skåler med ulike mediakomposisjoner. Det ble benyttet YMA med Bromothymol blue (BTB), YMA med Congo red (CR) og pepton glucose agar med bromocrysol purple (BCP) som vil gi en fargereaksjon hos noen organismer. Resultatene fra disse skålene ble brukt for å identifisere og isolere rhizobia. For å kategorisere isolatene ble kulturene studert med hensyn på ekstracellulært polysakkarid, endring av pH i mediet samt kolonistørrelse og farge (Wolde-meskel et al. 2004a).

De bakteriestammene som ble arbeidet med i denne oppgaven er oppgitt i tabell 2.1.

Figur 3.1 Oversikt over lokasjoner i Etiopia hvor noduler og jordprøver ble isolert. Ufylte sirkler representerer jordprøvene, mens de fylte sirklene er der frøene ble innsamlet. Numrene representerer lokasjonene: 1 Akaki, 2 Debrezeit, 3 Nazret, 4 Meki, 5 Enseno, 6 Abernosa, 7 Arsinegele, 8 Chofa, 9 Awassa, 10 Wondogenet, 11 Leku, 12 Dilla, 13 Bule, 14 Surupa, 15 Yavelo, 16 Mega (Wolde-meskel et al. 2004a).

3.2 Oppbevaring av Bradyrhizobium stammer

For hver av de 39 bakteriekulturene (tabell 1) ble det laget frysestock fra den eksponentielle vekstfasen. Frysestocken ble laget ved å tilsette 50 % glycerol med en sluttkonsentrasjon på 15 % i hver av bakteriekulturene. Kulturene ble oppbevart i -80 °C fryser.

3.3 Dyrkning av Bradyrhizobium

Bradyrhizobium ble dyrket opp i Yeast Mannitol Broth (YMB) (mediekomposisjon se 2.7.1) i et oppvarmet vannbad ved 28 °C. YMB mediet ble justert ned til pH 6.8 (+/- 0.2) ved å tilsette HCl. For å opprettholde et aerobt miljø i oppdyrkningen av stammene og unngå aggregering foregikk inkubasjonen under røring ved 700 rpm. Autoklaverte medisinflasker med YMB og magnetstaver ble inokulert med Bradyrhizobium stammer og flaskeåpningen dekket med aluminiumsfolie. Flaskene ble plassert i et vannbad hvor en magnetplate med 15 rørepunkter var nedsenket (ca 6 cm under vann). For senere transkripsjonsanalyser er det viktig at inokulumet ikke blir utsatt for et anoksisk miljø slik at cellene ikke begynner å transkribere