Facultat de Ciències
Memòria del Treball de Fi de Grau
Anàlisi de la morfologia i migració cel·lular en cèl·lules de tumors cerebrals malignes.
Patricia Katherine Prado Peralta Grau de Bioquímica
Any acadèmic 2013-14
DNI de l’alumne: 49611411C
Treball tutelat per Priam Villalonga Smith
Departament de Biologia Fonamental i Ciències de la Salut
SÍ, s’autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació
Paraules clau del treball: Càncer, Glioblastoma multiforme, morfologia, motilitat, invasió
2
3
Continguts
1. Introducció ... 5
1.1 Tumors cerebrals malignes ... 5
1.2 Presentació clínica dels gliomes ... 6
1.3 Biologia Molecular del GBM ... 6
1.3.1 Receptors amb activitat tirosina quinasa ... 7
1.3.2 Migració cel·lular ... 10
1.4 Estratègies terapèutiques davant els GBMs. ... 11
2. Objectius ... 12
3. Material i mètodes ... 12
3.1 Model experimental ... 12
3.2 Condicions de cultiu i manteniment de les línies cel·lulars ... 13
3.3 Compostos químics ... 13
3.4 Assaig de motilitat e invasió cel·lular ... 13
3.5 Anàlisis de la morfologia i regulació del citoesquelet ... 14
3.6 Anàlisi estadístic de les dades ... 15
4 Resultats ... 15
4.1 Assaig de Wound Healing aplicat a línies cel·lulars LN229 i T98G ... 15
4.2 Modulació de les vies de senyalització implicades en la motilitat ... 16
4.2.1 Via de senyalització dels Receptors Tirosina quinasa ... 16
4.2.2 Vies MAPK i PI3K/Akt ... 19
4.3 Impacte de la modulació en morfologia i citoesquelet ... 21
4.3.1 Via dels Receptors tirosina quinasa ... 22
4.3.2 Via de les MAPK i PI3K/Akt ... 24
5 Discussió ... 25
6 Conclusions ... 27
7 Bibliografia ... 27
4
Resum
Els gliomes malignes són els tumors cerebrals primaris més comuns en adults i es caracteritzen per la seva elevada agressivitat i el seu mal pronòstic. Dins d’aquest grup de neoplàsies, el grau més alt de malignitat correspon al Glioblastoma Multiforme (GBM), considerat fora de l’abast de les teràpies actuals. La resistència als tractaments citotòxics i la resecció després de la cirurgia respon a l’acumulació gradual d’alteracions genètiques que condueixen cap a la formació d’aquests tumors.
Diversos estudis han demostrat la importància del receptors tirosina quinasa (RTK) en la gliomagènesi, suggerint que la progressió maligna dels gliomes respon en gran part a una activació anormal de la senyalització d’aquests receptors. La desregulació en la senyalització dels RTKs, que es pot donar tant per amplificació gènica, sobreexpressió o mutacions, suposa l’activació constitutiva de les vies MAPK i PI3K/Akt. En aquest context, l’objectiu d’aquest treball ha estat analitzar la influència d’aquests vies sobre els canvis en la motilitat i la morfologia de les línies cel·lulars LN229 i T98G mitjançant la utilització d’inhibidors específics d’aquestes vies. Així doncs, s’han dut a terme assajos de motilitat i de tinció del citoesquelet d’actina. L’anàlisi de les dades obtingudes, ens ha permès concloure que la inhibició des les vies RTK–MAPK–PI3K/Akt produeix una reducció de la motilitat i una important reorganització de citoesquelet cel·lular.
Abstract
Malignant gliomas are the most common primary brain tumors in adults and characterized by their high aggressiveness and its poor prognosis. Highest grade of malignance in this group of tumors corresponds to Glioblastoma Multiforme (GBM), which is considered outside the scope of current therapies. Resistance to cytotoxic therapies and surgical resection is due to the gradual accumulation of many genetic defects. Several studies have demonstrated the importance of the receptor tyrosine kinases (RTK) in gliomagenesis, suggesting that the progression of malignant gliomas responds to an abnormal activation of the signaling of these receptors. Deregulated RTK signaling can occur via gene amplification, overexpression or mutations and this leads to constitutive activation of MAPK and PI3K/Akt pathways. In this context, the aim of this study was analyzing the influence of these pathways on changes in motility and morphology of the cell lines LN229 and T98G by using specific inhibitors of these pathways. Therefore, motility assays and staining of the actin cytoskeleton were performed. We conclude that inhibition of RTK-MAPK-PI3K/Akt pathways results in a decrease of the cell motility and also produce a significant reorganization of the cellular cytoskeleton.
5
1. Introducció
1.1 Tumors cerebrals malignes
Les neoplàsies cerebrals són un grup molt heterogeni i complex que provenen de diversos llinatges cel·lulars. Entre aquestes, els gliomes són el tipus més comú de tumors cerebrals primaris i representen més del 50% de tots els tumors del sistema nerviós central (SNC) en adults [1].
Patològicament els gliomes han estat definits com tumors que mostren una evidència histològica, immunohistoquímica i ultraestructural de diferenciació glial. De manera que aquests tumors poden presentar característiques histològiques de astròcit (astrocitoma), oligodrentròcit (oligodendroglioma) o cèl·lula ependimal (ependimoma) [2] . Dins d’aquests grups els astrocitomes representen entre un 60% i un 70% de tots els casos de gliomes (Figura 1) [1].
Referent a la seva classificació la més utilitzada és la de l’Organització Mundial de la Salut (OMS), que va ser publicada per primera vegada l’any 1979 i ha estat revisada en diverses ocasions, i actualment es troba vigent la quarta edició publicada l’any 2007. Aquesta classificació es fonamenta en diversos criteris histopatològics, com la presència o no d’atípia nuclear, mitosis, angiogènesi i necrosi . Basant- se en aquest criteris es fa una gradació del astrocitomes, en una escala de I a IV, que reflexa el seu grau de malignitat (Figura 2) [3]. Els tumors de Grau I són biològicament benignes, amb baix potencial proliferatiu i amb possibilitat de curació mitjançant resecció quirúrgica i corresponen als astrocitomes pilocítics. El Grau II correspon als astrocitomes difusos, són tumors malignes de baix grau i amb capacitat d’infiltració, però a pesar de la seva baixa activitat proliferativa poden reaparèixer després de la extirpació quirúrgica i progressar cap a estadis més malignes. Els astrocitomes anaplàsics constitueixen el Grau II, histològicament es caracteritzen per presentar atípia nuclear i una alta activitat mitòtica, generalment aquest tipus de tumor condueix a la mort del pacient en pocs anys. Finalment, la OMS assigna el Grau IV al glioblastoma multiforme (GBM), que representa el tumor més maligne[3, 4]. Els GBMs es caracteritzen per ser mitóticament molt actius, amb una elevada capacitat de penetració i propensos generar necrosi, amb elevada resistència a l’apoptosi, una gran inestabilitat genòmica i amb la capacitat per formar nous vasos. Aquests tumors representen entre el 12 i el 15% de totes les neoplàsies intracraneals i entre en 50 i el 60% dels tumors astrocítics (Figura 1) [5].
51%
2% 7%
6%
8%
6%
11% 9%
Indència gliomes
Glioblastoma
Astrocitoma anaplàsic Astrocitoma difós Astrocitoma policitic Oligodrendroglioma Epindimoma Altres gliomes Altres astrocitomas
Figura 1. Incidència dels diferents tipus de gliomes
6
A diferència d’altres tumors, els gliomes rarament metastatitzen fora del SNC, de manera que el grau del tumor és el principal determinant del seu pronòstic. Les prediccions de resposta al tractament i de supervivència del pacients afectats per aquest tipus de tumor, es basen en aquests criteris histopatològics de classificació juntament amb criteris clínics i moleculars[2]. La supervivència estimada de pacients amb astrocitomes de Grau II és de 5 a 15 anys , pels que presenten astrocitomes de Grau III és d’uns 3 anys i pels pacients amb GBM, la supervivència mitja està entre 9 i 12 mesos.
1.2 Presentació clínica dels gliomes
Les teràpies utilitzades en el tractament d’altres tumors sòlids, com el càncer de mama, pulmó, o pròstata, resulten ineficaces en el tractament de GBM, posant de manifest la complexitat biològica i origen cel·lular d’aquesta neoplàsia [2]. Els glioblastomes presenten una elevada heterogeneïtat cel·lular, que els hi confereix la denominació multiforme, a més es caracteritzen per ser difussivament infiltrants , pobrament diferenciats, molt agressius i neurològicament destructius [6]
Segons la seva presentació clínica s’han descrit dos tipus de GBM: primaris i secundaris (Figura 3) [7].
Els GBM primaris o de novo suposen la majoria de casos de GBM en pacients d’edat avançada, i es caracteritzen per ésser tumors molt agressius i altament invasius, que apareixen sense evidències histològiques prèvies . Els GBM secundaris presenten una història clínica diferent als primaris, ja que generalment es presenten pacients menors de 45 anys que inicialment han patit un glioma de baix grau, i que ha progressat fins arribar a grau IV [2, 7]. Aproximadament el 60% dels gliomes de Grau II es transformen en tumors de Grau III i IV en un període entre 5 i 10 anys des del diagnòstic inicial [3].
Malgrat que els GBM primaris i secundaris presentin històries clíniques diferents són morfològica i clínicament indistingibles, proporcionant una pista important per entendre les vies involucrades en la gliomagènesi [8].
1.3 Biologia Molecular del GBM
L’augment en el grau de malignitat dels gliomes suposa un augment en la seva agressivitat tumoral que es veu reflectida per un increment en la cel·lularitat i en l’activitat mitòtica [9]. A nivell molecular la gliomagènesi va associada a una acumulació gradual d’alteracions genètiques que afecten a les vies de senyalització encarregades de modular la proliferació , la supervivència cel·lular (apoptosis i necrosis), la invasió i l’angiogènesi [10]. A la figura 3 s’indiquen les alteracions moleculars més freqüentes en el tumors d’origen glial.
Astrocitoma de
baix grau Glioblastoma
Multiforme Astrocitoma
anaplàstic Teixit
Normal
Figura 2. Via de progressió des del teixit normal cap a un glioma de grau II, passant per un de grau III i finalment arribant al grau IV (GBM). Extret i modificat de http://www.clevelandclinicmeded.com
7
Dins la heterogeneïtat molecular dels GBM cal destacar l’ activació anormal de les vies de senyalització dels receptor tirosina quinasa, ja que existeix una cooperativitat intrínseca entre aquestes vies de senyalització i la desregulació de les vies d’aturada del cicle cel·lular, i que explicar la patogènesi molecular dels gliomes malignes [11].
1.3.1 Receptors amb activitat tirosina quinasa
La hiperactivació dels receptors tirosina quinasa (RTKs) és una característica comú dels GBM, principalment del receptor del factor de creixement derivat de plaquetes (PDGFR) i del receptors del factor de creixement epidèrmica (EGFR). Els RTKs constitueixen una família d’uns 20 membres, els quals es caracteritzen per presentar un domini extracel·lular d’unió al lligant, un domini transmembrana simple, i un domini intracel·lular citoplasmàtic amb activitat tirosina quinasa intrínseca [7] .
La desregulació de la senyalització dels RTKs és conseqüència de l’adquisició de mutacions que tenen com a conseqüència la seva activació constitutiva. La sobreexpressió del PDGF està associada a la del seu lligand PDGF i és una alteració comú en astrocitomes de baix grau, associat a la pèrdua de funció del supressor tumoral p53 [11]. La senyal mitogènica de PDGFR sembla ésser un esdeveniment iniciador de la progressió dels precursors neuronals o cèl·lules glials diferenciades cap a astrocitomes de baix grau i/o oligodendrogliomes. De manera que alteracions en PDGF/R s’observen més comunament en GBM secundaris [12].
Per altra banda, les alteracions del EGFR són característiques del astrocitomes d’ alt grau i per tant dels glioblastomes multiformes, la majoria de les amplificacions gèniques estan relacionades amb aquest receptor. Diversos estudis han demostrat que aproximadament el 50% dels GBMs expressen nivells elevats de EGFR, i només un petit percentatge dels astrocitomes anaplàstics mostren aquesta alteració. De manera que la sobreexpressió d’aquest receptor es considera un esdeveniment tardà en
Figura 3. Alteracions moleculars més freqüentes en el diferents graus de glioma. Extret i modificat de http://www.nature.com.
8
la gliomagènesi i s’observa sobretot en GBMs primaris [13]. Un altre fet rellevant, és que en aproximadament el 40% dels glioblastomes amb EGFR amplificat també es troba mutat. La mutació d’aquest receptor ve donada per una deleció dels exons del 2 al 7 i dóna lloc a un receptor conegut com ΔEGFR o EGFRvIII, el qual no pot unir el seu lligand, ja que presenta un domini extracel·lular truncat però constitutivament fosforilat i actiu, i que no és susceptible a la degradació per endocitosis. Aquest receptor mutat també s’ha detectat en càncers de pulmó, mama, i pròstata, però no en teixit normals [4, 11].En els gliomes també s’ha identificat una senyalització aberrant de HGF (Hepatocyte Growth Factor) i del seu receptor Met, un altre receptor amb activitat tirosina quinasa [14]. La sobreexpressió d’aquest RTK està directament associada al creixement invasiu dels tumors sobretot està lligada a gliomes d’alt grau [15].
Aquesta hiperactivació del RTKs, en especial del EGFR, ja sigui per la seva amplificació i/o mutació té com a conseqüència l’estimulació de l’ activació vies de senyalització intracel·lular com Raf/MEK/ERK i PI3K/Akt que són en darrer terme les responsables del fenotip maligne de les cèl·lules gliomals [16].
Via Ras/Raf/MEK/ERK
La via de les MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) es activada per un varietat de estímuls cel·lulars i està implicada en la regulació processos cel·lulars com la proliferació, diferenciació, desenvolupament i tumorigènesi [4]. Els membres de la família de les MAPK estan estructuralment relacionades però són activades per estímuls extracel·lulars diferents, donant lloc a cascades de senyalització diverses. Malgrat aquesta diversitat, s’ha identificat una via MAPK conservada universalment, coneguda com Ras/Raf/MEK/p42/44MAPK i que resulta estimulada per diversos receptors de factors de creixement incloent els PDGFR, EGFR i altres RTKs [11]. En aquesta via la unió del lligant al receptor estimula l’activació de Ras, una proteïna G monomèrica, i aquesta activa a Raf que estimula la fosforilación de MEK (Mitogen-activated protein kinase kinase) [17]. MEK una vegada activa estimula la fosforilació i, per tant, l’activació de la MAP quinasa, també coneguda como ERK.
ERK es pot translocar al nucli i regular la transcripció de factors de creixement modulant la expressió de diversos gens [11].
S’han identificat formes mutades o constitutivament actives de Ras en aproximadament el 50% de tots els tumors metastàtics. En gliomes concretament no s’han identificat mutacions específiques que afectin a Ras però s’han documentat nivells elevats d’aquesta proteïna G en astrocitomes d’alt grau, que s’associen amb creixement incontrolat d’aquest tumors [18].
Figura 4. Principals alteracions genètiques dels RTKs en els gliomes. Extret i modificat de http://dx.doi.org/10.5772/5435.
9
Via PI3K/Akt
L’activació dels receptors tirosina quinasa a través de la unió als seus lligants permet el reclutament de PI3K (Fosfatidilinositol 3-quinasa) el qual fosforila a PIP2 (Fosfatidilinositol-4,5-bifosfat) convertint-lo en PIP3, el qual activarà molècules efectores com Akt [9]. Akt una vegada actiu fosforila e inhibeix proteïnes proapoptòtiques com Bad, promovent la supervivència cel·lular, i estimula la síntesis proteica a través de la via mTOR [11]. Una de les possibles explicacions del increment en la supervivència cel·lular i del mal pronòstic del pacients amb GBM, es basa en que aproximadament el 80% de tots els GBMs expressen Akt en forma activa [19] .
L’activitat de la via PI3K/Akt està regulada pel supressor tumoral PTEN ( Phosphate and tensin homology) és un proteïna amb activitat 3’fosfoinositol i que regula de forma negativa PI3K a través de la desfosforilació de fosfatidilinositols-2,4,5 trifosfats (PIP3) i fosfatidilinositol-3,4 difosfat. La seva funció és regular la migració i proliferació cel·lular mitjançant la regulació de la quinasa serina/treonina Akt [9].Suggerint que la pèrdua de funció de PTEN és un dels prerequisits del desenvolupament del GBMs, i el seu gen alterat entre el 15-40% dels casos de GBMs primaris i rarament en els secundaris[11].
Un altre aspecte a destacar, és que l’activació de PI3K/Akt no només actua com una senyal de supervivència sinó que també participa en la motilitat e infiltració tumoral. Això es sustenta en què en cèl·lules de glioblastoma humà el EGFR estimula transcripcionalment al factor de creixement endotelial vascular (VEGF) a través d’una via dependent de PI3K, a l’hora estimulada per mutacions en PTEN [20] . L’activitat de VEGF es centra en l’estimulació de l’angiogènesi i està involucrat en l’augment d’edema cerebral i en la proteòlisis de las proteïnes de las matriu extracel·lular[20].
Figura 5. Activació de les vies Ras/Raf/MEK/MAPK i de la via PI3K/Akt. Extret i modificada de http://www.landesbioscience.com.
10
En definitiva, tant la via de les MAPK com la via PI3K/Akt constitueixen els principals mediadors de la senyalització dels RTKs, i estan directament relacionades amb l’increment de la proliferació, de la resistència a l’apoptosi i de una major invasió cel·lular característiques d’aquests tumors.1.3.2 Migració cel·lular
Els gliomes es caracteritzen per presentar una disseminació distal, ja que tenen la capacitat de infiltrar-se a través de la membrana basal dels vasos sanguinis o a través dels tractes de matèria blanca, que fa que puguin localitzar-se a una distància considerable de la massa tumoral principal [21]. La migració cel·lular, i en particular la migració de les cèl·lules de glioma, és un procés molt complex que implica moltes característiques biològiques. La migració cel·lular migració és el resultat de la combinació de l’adhesió, motilitat e invasió, tres processos biològics independents però extremadament coordinats[1] .
Un component fonamental en la migració cel·lular d’aquests tumors és l’adhesió a components de la matriu extracel·lular (MEC) que va acompanyada d’una modificació de la composició molecular d’aquesta. L’ adhesió cel·lular és el resultat de les habilitats d’aquestes cèl·lules per interaccionar amb components específics de la MEC i de molècules d’adhesió que permeten les adhesions cèl·lula- cèl·lula [22]. Aquest procés està potenciat per la secreció, per part de les cèl·lules tumorals, de tota una sèrie de components que modifiquen la MEC i que faciliten aquesta motilitat. La pròpia motilitat cel·lular implica una reorganització del citoesquelet de actina per mitjà de modificacions en les interaccions entre integrines i components de la MEC [23] .
Els canvis en el citoesquelet i en el comportament cel·lular estan regulats per senyals extracel·lulars que són induïdes per diferents receptors, i que convergeixen en un grup de GTPases monomèriques de la família Rho [16].Entre els membres d’aquesta família s’inclou a Rho, Rac i Cdc2, i estan involucrades en multitud de processos cel·lulars com la progressió del cicle cel·lular, el creixement, la reorganització del citoesquelet, i la motilitat cel·lular [5]. Per una banda, l’activació de la proteïna Rho s’ associa amb la formació de complexes d’adhesió focal i fibres d’estrès d’actina, i aquesta acció es realitza a través de l’activació de ROCK, que fosforila a MLC i desencadena la formació d’aquestes estructures [5, 24]. Per altra banda, Rac estimula la polimerització d’actina en la perifèria cel·lular, regulant la formació d’extensions tipus Lamelipodi o plecs a la membrana (Membrene Ruffles) i activant la PAK (p21 Activated Kinasa). La proteïna Cdc2 (Cell Division Control protein 42 Homolog) actua induint la polimerització d’actina formant Fil·lipodis, a través de l’activació de proteïnes de la família de WASp. De manera que, les proteïnes Rac i Cdc2 estan directament relacionades amb el control de la motilitat cel·lular[24] Un nivells elevats de Rac i Cdc2 s’associen amb un fenotip a elevada motilitat i tendència a la invasió, mentre que un augment en l’activitat de Rho duu cap a un fenotip més adherit al substrat al estimular la contractilitat de l’actina miosina i les adhesions focals [5]
.
L’elevada mobilitat de les cèl·lules tumorals s’explica pel fet de què les vies que estimulen la senyalització a través de Rac i Cdc2 es troben hiperactivades .11 1.4 Estratègies terapèutiques davant els GBMs.
El tractament actual dels GBMs es basa en una cirurgia lo més àmplia possible, combinada amb radioteràpia i quimioteràpia concomitant i adjuvant amb temozolomida (agent alquilant)[9]. La capacitat d’aquests tumors per infiltrar el parènquima cerebral i migrar a zones més allunyades, limita les possibilitats d’una resecció quirúrgica completa així com el tractament amb radio/quimioteràpia, per la qual cosa malgrat els avanços en aquestes tècniques la supervivència dels pacients no ha millorat.
El mal pronòstic dels gliomes i la seva recurrència i resistència als tractament actuals impliquen la necessitat de trobar noves molècules que permetin millorar el tractament, a més d’ augmentar la supervivència i la qualitat de vida dels pacients. Tot això ha fet que es plantegi que un tractament efectiu implica una major comprensió de les vies de senyalització que dirigeixen la invasió dels gliomes, i de la identificació dels efectors crítics d’aquestes vies [25]. Hi ha tota una sèrie d’estudis en que es fan servir molècules petites que permeten la inhibició de dianes específiques:
Agent Diana
Erlotinib (Tarceva)
Inhibidor activitat TK d’EGFR
Imatinib (Gleevec)Inhibidor activitat TK de PDGFR
Sunitinib (Sutent)
Inhibidor activitat TK de PDGFR i VEGFR
SU11274Inhibidor activitat TK de Met
UO126
Inhibidor activitat de MEK
LY294002
Inhibidor activitat de PI3K
Figura 7. Implicació de Rho, Rac i Cdc42 en la regulació del citoesquelet. Extreta i modificada de http://www.mit.edu.
12
2. Objectius
La heterogeneïtat dels Glioblastomes i el seu gran nombre d’alteracions genètiques fan que aquests tumors estiguin considerats fora de l’abast de les estratègies terapèutiques conegudes. Partint de l’idea de la interferència en les vies moleculars afectades per les alteracions genètiques com a nova estratègia terapèutica, en el present treball es pretén dur a terme un anàlisi detallat de l’adquisició i regulació del fenotip altament invasiu característic de les cèl·lules de GBM, mitjançant la modulació de les vies de senyalització anteriorment esmentades.
Com a primer pas es determinarà la capacitat migratòria de dues línies cel·lulars de glioblastoma humà . Amb aquest objectiu, es posarà a punt el mètode Wound Healing aplicat a les dues línies cel·lulars amb les quals es treballarà. Un vegada establertes les condicions de l’assaig es procedirà a analitzar l’impacte de la modulació de les vies de senyalització intracel·lular implicades en la motilitat cel·lular, tractant les cèl·lules amb els compostos esmentats anteriorment. Per altra banda, considerant que un aspecte important en el fenotip migratori de les cèl·lules tumorals és la remodelació del citoesquelet, es pretén correlacionar els resultats obtinguts en l’anàlisi de la motilitat amb canvis en la morfologia i arquitectura cel·lular, en condicions basals i en resposta a els mateixos moduladors utilitzats en l’assaig de motilitat.
Tenint en compte que malgrat dels esforços destinats a la recerca d’aquests tumors tan agressius, encara manca molta informació relativa al mecanismes moleculars que determinen la seva elevada invasivitat. El propòsit d’aquest treball està emmarcat en el context de l’estudi de noves dianes terapèutiques susceptibles de interferència farmacològica, considerant-la una estratègia atractiva destinada a augmentar l’efecte citotòxics de la radio i quimioteràpia i aconseguir reduir la invasió cel·lular característica d’aquests tumors.
3. Material i mètodes
3.1 Model experimental
En la realització d’aquest treball s’han utilitzat dues línies cel·lulars de glioblastoma humà concretament les línies LN229 i T98G.
La línia cel·lular LN229 és una línia adherent, que deriva d’una pacient d’ètnia blanca de 60 anys diagnosticat de Glioblastoma multiforme (GBM) [26]
.
Les cèl·lules d’aquesta línia presenten una morfologia epitelial, van dividint-se fins arribar a formar una monocapa. Molecularment aquesta línia cel·lular presenta la proteïna p53 mutada, a més de possibles delecions en els gens que codifiquen pels supressors tumorals p16 i p14ARF.La línia cel·lular T98G és una línia que creix en adherència i que prové d’un pacient caucàsic de 61 anys diagnosticada de GBM[27] . Les cèl·lules d’aquesta línia presenten una morfologia fibroblàstica i es van dividint fins a formar una monocapa. Molecularment es caracteritzen per presentar la proteïna p53 mutada i el promotor MGMT hipermetilat.
13 3.2 Condicions de cultiu i manteniment de les línies cel·lulars
Les cèl·lules han estat mantingudes amb medi de cultiu DMEM (Dulcobecco’s Modified Eagle Medium) suplementat amb un 10% de sèrum fetal boví (Sigma) i amb un 1% dels antibiòtics penicil·lina-estreptomicina (Sigma). Les línies han estat cultivades en subconfluència en plaques petri de 100 mm en un incubador a 37ºC en una atmosfera de 5% de CO2 i 95% de humitat relativa.
El mantenint de les línies s’ha fet seguint els següents passos:
1. Aspiar el medi de cultiu i rentar amb 2 ml de PBS1x (Phosphate Buffered Saline) , per afavorir l’acció de la peptidasa.
2. Descartar el PBS1x i a continuació afegir 1 ml de tripsina i deixar a l’incubador entre 4-5 min.
Degut a què són cèl·lules que s’adhereixen fortament a la placa el temps d’acció de la peptidasa és més prolongat que en altres línies cel·lulars.
3. Colpejar suaument la placa i resuspendre el volum amb una pipeta per ajudar a desenganxar les cèl·lules.
4. Afegir medi de cultiu per inhibir la tripsina. Sembrar les cèl·lules a diverses plaques per expandir i mantenir el cultiu.
3.3 Compostos químics
En els diversos assaigs en que s’han fet servir les dues línies de glioblastoma humans, les cèl·lules han estat tractades amb els següents compostos:
Compost Concentració stock
Erlotinib 10 mM
Imatinib 100 mM
Sunitinib 20 mM
UO126 25 mM
SU11274 10 mM
LY294002 25 mM
Tots aquest compostos es conserven a una temperatura de -20 ºC. En els tractaments s’han utilitzat a una concentració de 10µM afegint-los directament al medi de cultiu.
3.4 Assaig de motilitat e invasió cel·lular
L’anàlisi de la motilitat de les dues línies cel·lulars s’ha realitzat mitjançant la tècnica Wound Healing, un assaig de motilitat en dos dimensions. S’ha posat a punt aquest mètode adaptant-lo a les línies LN229 i T98G i s’han seguit els següents passos:
1. Desenganxar les cèl·lules de les plaques de petri 100 mm, seguint els passos de tripsinització anteriorment esmentats.
2. Plaquejar 4x105 cèl·lules en plaques de 6 pous, en un volum de 2 ml de medi de cultiu.
14
3. Deixar les plaques a l’incubador durant 4 hores, temps necessari perquè les cèl·luless’adhereixen.
4. Aspirar el medi de cultiu i realitzar les ferides amb una punta estèril. Es realitza una ferida en sentit vertical i dues en sentit horitzontal, intentant fer la mateixa pressió en tots el punts però obtenir uniformitat en l’amplària de les ferides.
5. Rentar amb PBS1x per eliminar les cèl·lules que s’han desferrat.
6. Preparar els diferents tractaments amb medi de cultiu i afegir-lo als pous, amb molt suavitat per conservar les ferides. Cada un dels pous de la placa representen una condició de tractament, on un d’ells representa la condició control, que no porta tractament.
Per a la determinació del ràtio de motilitat o gap-clousure s’han realitzat fotografies de les ferides a temps 0 i 24h mitjançant un microscopi de contrast de fase. Les imatges es capturen en 4 zones diferents de cada condició. Els assajos s’han realitzat per triplicat amb les dues línies cel·lulars, obtenint un total de 12 imatges per condició de tractament.
3.5 Anàlisis de la morfologia i regulació del citoesquelet
L’anàlisi de la morfologia de les dues línies cel·lulars s’ha realitzat mitjançant immunofluorescència.
La preparació de les cèl·lules per dur a terme aquesta tècnica és consta dels següents passos:
1. Depositar a cada pou d’una placa de 6 pous, dos cobreobjectes rodons de vidre.
2. Plaquejar 30.000 cèl·lules per pou, afegir 2 ml de medi de cultiu i deixar la placa al incubador fins al dia següent (entre 15-18h).
3. Comprovar que les cèl·lules s’han adherit als cobreobjectes i aspirar el medi amb cura de no tocar els cobreobjectes on estan les cèl·lules.
4. Afegir novament medi de cultiu amb els diferents tractaments.
5. Deixar la placa a l’incubador 24h.
Fotografies de les ferides a temps 0 i 24h
Cultiu de cèl·lules en monocapa confluent
Ferida a la superfície de la monocapa
0h
24 h
Figura 8. Esquema representatiu de l’assaig de motilitat mitjançant la tècnica Wound Healing . Modificat de la web nature.com.
15
Finalitzat el temps de tractament de les línies cel·lulars es realitzen les etapes de fixació, permeabilització e incubació amb els marcadors, seguint els següents passos:1. Aspirar el medi de cultiu i rentar dos cops amb PBS1x fred. Eliminar el PBS1x.
2. Fixar les cèl·lules amb paraformaldehid 4% (v/v) durant 30 min a temperatura ambient.
3. Descartar el fixador i rentar dos cops amb PBS1x.
4. Permeabilitzar les cèl·lules amb Tritó X-100 0.2% (v/v) durant 20 min a temperatura ambient.
5. Descartar la solució permeabilitzant i rentar dos cops amb PBS1x.
6. Incubar les cèl·lules amb marcadors (50 µl per cobreobjectes) i deixar a l’incubador durant 1 h. La solució dels marcadors conté DAPI (1:500) i Faloïdina (1:250) preparats amb BSA al 0.5%.
7. Rentar els cobreobjectes submergint-los en PBS1x, deu cops.
8. Muntar els cobreobjectes amb Dako Flourescent (medi de muntatge) damunt portaobjectes de vidre.
La fluorescència emesa per les mostres s’ha visualitzat mitjançant el microscopi confocal d’ escaneig espectral per làser TCS SPC (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanya). Les imatges s’han captat a 400 Hz de velocitat i a una resolució de 2048 per 2048 bytes.
3.6 Anàlisi estadístic de les dades
L’anàlisi estadístic de les dades s’ha realitzat utilitzant el programa
Microsoft Excel . Aixímateix, les diferències estadístics entre les mitges dels diferents grups s’han obtingut mitjançant la prova t-Student on la rellevància de les diferències ve donada pel valor p, considerant que:
p > 0.05 Diferència no significativa (N.S) p < 0.05 Diferència significativa (*) p < 0.01 Diferència molt significativa (**) p < 0.001 Diferència extremadament significativa (***)
4 Resultats
4.1 Assaig de Wound Healing aplicat a línies cel·lulars LN229 i T98G
Per la determinació de la capacitat migratòria de les línies cel·lulars de glioma LN229 i T98G, es va dur a terme la posta a punt del mètode Wound Healing. Es van plaquejar 2x105, 4x105 i 6x105 cèl·lules d’ambdues línies a diferents pous d’una placa, una vegada adherides es van fer les ferides i es van realitzar fotografies de les ferides a temps 0, 16 i 24h.
16
LN229
T98G
Es pot observar com l’amplària de les ferides va disminuint com més llarg és el temps de captura de la imatge i que aquest tancament és més accentuat com major es el nombre de cèl·lules que s’han plaquejat. Les imatges corresponents al nombre més baix de cèl·lules plaquejades mostren una ferida un poc difusa que no arriba a tancar ni al temps més llarg. Per altra banda, quan s’ augmenta la quantitat de cèl·lules plaquejades les ferides són més uniformes i arriben a tancar a 24h en el cas de 4x105 cèl·lules i a 16h en el cas de 6x105 cèl·lules ja que a temps més llarg resulta difícil identificar la zona on s’ha fet la ferida (Figura 9).
L’objectiu de l’assaig és que la ferida arribi a tancar quasi completament sempre que sigui possible trobar la zona on s’ha fet la fotografia a les 0h, de manera que seria viable tant plaquejar 4x105 cèl·lules i establir com a temps de tancament de ferida 24h, com plaquejar 6x105 i que el tancament de ferida fos 16h. Tenint en compte el número de cèl·lules necessàries per dur a terme els assajos i els horaris de realització d’aquests, s’estableix que les condicions òptimes per dur a terme l’anàlisi de la motilitat mitjançant la tècnica Wound Healing amb les línies cel·lulars LN229 i T98G, són plaquejar 4x105 cèl·lules per pou i establir com a temps de tancament de ferida les 24h.
4.2 Modulació de les vies de senyalització implicades en la motilitat
Amb l’objectiu de l’analitzar els efectes de la modulació de determinades vies de senyalització sobre la motilitat cel·lular en cèl·lules de glioma, es va tractar les línies cel·lulars LN229 i T98G amb Erlotinib, Imatinib, Sunitinib, SU11274, UO126 i LY294002, compostos inhibidors de dianes específiques.
Via de senyalització dels Receptors Tirosina quinasa 4.2.1
Per determinar l’efecte de la inhibició dels RTKs sobre la motilitat cel·lular es van dur a terme assajos Wound Healing amb cèl·lules LN229 i T98G en condicions control i tractades amb compostos inhibidors d’aquests receptor. En aquests assajos s’han utilitzat els compostos : Erlotinib que té com a daina d’acció l’EGFR, Imatinib que té com a diana d’acció el PDGFR, Sunitibin que té com a diana d’acció el PDGFR i VEGFR i SU11274 que té com a diana d’acció a Met.
0h
Figura 9. Anàlisi de la capacitat migratòria de les línies LN229 i T98G pel mètode Wound Healing. Micrografies de contrast de fase representatives de les cèl·lules LN229 i T98G, corresponents a 2x105, 4x105 i 6x105 cèl·lules (esquerra a dreta) captades a 0, 16 i 24h després de realitzar les ferides pel mètode Wound Healing descrit a l’apartat de Material i Mètodes.
0h
16h
24h
17 LN229
LN229 Control Erlotinib Imatinib Sunitinib SU11274
Camps fotogràfics 4 4 4 4 4
Mitja de cèl·lules contades 415 203 235 240 189
Experiments independents 3 3 3 3 3
Total cèl·lules analitzades 4980 2436 2820 2880 2268
A
SU11274 Sunitinib
Imatinib Erlotinib
Control 0h
24h
B
C
Figura 10. Modulació de la senyalització dels RTKs. (A) Micrografies de contrast de fase representatives de cèl·lules LN229 sense tractament i tractades amb 10µM d’ Erlotinib, Imatinib, Sunitinib,SU11274 (d’esquerra a dreta) a 0 i 24h després de realitzar les ferides pel mètode Wound Healing descrit a l’apartat de Material i Mètodes. (B) Tabulació de les dades obtingudes de l’anàlisi de les micrografies de Wound Healing. (C) Gràfica representant de la mitjana de motilitat expressada en percentatge ( ±SD) de 3 experiments amb rèpliques de 4 camps fotogràfics per experiment. Les diferències són significatives respecte al control a partir de p<0.05*, molt significatives a partir de p<0.01** i extremadament significatives a partir de p<0.001***.
18 T98G
T98G Control Erlotinib Imatinib Sunitinib SU11274
Camps fotogràfics 4 4 4 4 4
Mitja de cèl·lules contades 552 250 182 156 136
Experiments independents 3 3 3 3 3
Total cèl·lules analitzades 6624 3000 2184 1872 1632 SU11274 Sunitinib
Control Erlotinib Imatinib
0h
24h
A
B
C
Figura 11. Modulació de la senyalització dels RTKs. (A) Micrografies de contrast de fase representatives de cèl·lules T98G sense tractament i tractades amb 10µM d’ Erlotinib, Imatinib, Sunitinib,SU11274 (d’esquerra a dreta) a 0 i 24h després de realitzar les ferides pel mètode Wound Healing descrit a l’apartat de Material i Mètodes. (B) Tabulació de les dades obtingudes de l’anàlisi de les micrografies de Wound Healing. (C) Gràfica representant de la mitjana de motilitat expressada en percentatge ±SD de 3 experiments amb rèpliques de 4 camps fotogràfics per experiment. Les diferències són significatives respecte al control a partir de p<0.05*, molt significatives a partir de p<0.01** i extremadament significatives a partir de p<0.001***.
19
Observant les imatges de les ferides es pot observar com la inhibició d’aquests receptors es tradueix en un reducció significativa del tancament de la ferida (Figura 10A i Figura 11A). Els assajos es van realitzar per triplicat i en cada un d’ells es van capturar imatges de quatre camps diferents per cada condició. A la taula es pot observar la disminució del nombre de cèl·lules contades en els assajos amb tractament (Figura 10B i Figura 11B). Aquest diferències reflecteixen l’efecte dels inhibidors de RTKs sobre la motilitat cel·lular d’aquestes dues línies.Les cèl·lules LN229 tractades amb els compostos experimenten una disminució de de la seva motilitat d’ entre un 40% i un 50% respecte a la condició control (Figura 10C). Per la seva banda, les cèl·lules T98G experimenten reducció de la motilitat més brusca, reduint-se entre un 50% i un 70%
respecte les cèl·lules que no han estat tractades amb cap inhibidor (Figura 11C). Aquestes dades posen de manifest la importància de les vies de senyalització dels RTK en la motilitat de les cèl·lules de glioma
Vies MAPK i PI3K/Akt 4.2.2
Havent demostrat la importància dels RTKs damunt la motilitat cel·lular, es pretén analitzar com varia aquest paràmetre quan s’inhibeix la via de les MAPK i la via de PI3K/Akt, els principals mediadors de la senyalització dels RTKs. Amb aquest objectiu es van realitzar assajos Wound Healing amb les cèl·lules LN229 i T98G en condicions control i tractades amb compostos inhibidors d’aquetes vies. Es van utilitzar el compostos: UO126 que té com a diana d’acció MEK, i LY294002 que té com a diana d’acció PI3K.
LN229
LN229 Control UO126 LY294002
Camps fotogràfics 4 4 4
Mitja de cèl·lules contades 415 197 183
Experiments independents 3 3 3
Total cèl·lules analitzades 4980 2364 2196
A
LY294002 UO126
Control
0h
24h
B
20 T98G
T98G Control UO126 LY294002
Camps fotogràfics 4 4 4
Mitja de cèl·lules contades 552 231 160
Experiments independents 3 3 3
Total cèl·lules analitzades 6624 2772 1920
C
Figura 12. Modulació de la senyalització de les vies MAPK i PI3K/Akt. (A) Micrografies de contrast de fase representatives de cèl·lules LN229 sense tractament i tractades amb 10µM de UO126 i LY294002 (d’esquerra a dreta) a 0 i 24h després de realitzar les ferides pel mètode Wound Healing descrit a l’apartat de Material i Mètodes. (B) Tabulació de les dades obtingudes de l’anàlisi de les micrografies de Wound Healing. (C) Gràfica representant de la mitjana de motilitat expressada en percentatge (±SD) de 3 experiments amb rèpliques de 4 camps fotogràfics per experiment. Les diferències són significatives respecte al control a partir de p<0.05*, molt significatives a partir de p<0.01** i extremadament significatives a partir de p<0.001***.
A
LY294002 U0126
Control
24 h
0h
B
21
Observant les imatges de les ferides a temps 0h i 24h es pot observar com el tancament de les ferides és menor quan es tracta les cèl·lules amb els inhibidors (Figura 12A i Figura 13A). A la taula queda reflectida la reducció del nombre de cèl·lules contades en condicions de tractament respecte la condició control (Figura 12B i Figura 13B). Aquest disminució és conseqüència de l’efecte dels inhibidors de MEK i PI3K sobre la motilitat cel·lular tant en cèl·lules LN229 com en cèl·lules T98G. La línia cel·lular LN229 presenta una reducció de la motilitat del 50% quan s’inhibeix MEK i del 65%quan s’inhibeix PI3K. Per la seva banda, la línia T98G també una reducció de la motilitat del 50% quan s’inhibeix MEK però del 70% quan s’inhibeix PI3K. Aquest resultat reforcen la importàncies d’aquestes vies de transducció de senyal en l’adquisició del fenotip invasiu característic de les de GBM humà.
4.3 Impacte de la modulació en morfologia i citoesquelet
Una vegada establerts els canvis en la motilitat cel·lular de cèl·lules LN229 i T98G en resposta al tractament amb inhibidors, es pretén correlacionar aquest resultats amb canvis en la morfologia de les dues línies cel·lulars utilitzant el mateix panell de compostos. Amb aquest propòsit s’han dut a terme assajos d’immunofluorescència utilitzant els marcadors fluorescents Faloïdina-TRICT i DAPI. La Faloïdina-TRICT té la capacitat d’unir-se específicament als microtúbuls d’actina i DAPI és un marcador nuclear.
C
Figura 13. Modulació de la senyalització de les vies MAPK i PI3K/Akt. (A) Micrografies de contrast de fase representatives de cèl·lules T98G sense tractament i tractades amb 10µM de UO126 i LY294002 (d’esquerra a dreta) a 0 i 24h després de realitzar les ferides pel mètode Wound Healing descrit a l’apartat de Material i Mètodes. (B) Tabulació de les dades obtingudes de l’anàlisi de les micrografies de Wound Healing. (C) Gràfica representant de la mitjana de motilitat expressada en percentatge (±SD) de 3 experiments amb rèpliques de 4 camps fotogràfics per experiment. Les diferències són significatives respecte al control a partir de p<0.05*, molt significatives a partir de p<0.01** i extremadament significatives a partir de p<0.001***.
22
Via dels Receptors tirosina quinasa4.3.1
Com a primer pas es va determinar l’efecte de la inhibició dels RTKs sobre la morfologia cel·lular utilitzant els compostos que interfereixen en la senyalització d’aquests receptors: Erlotinib, Imatinib, Sunitinib i SU11274.
LN229
Control ErlotinibImatinibSunitinib
DAPI
Faloïdina-TRITC Merge
SU1127 4
Figura 14. Canvis morfològics derivats de la modulació de la senyalització dels RTKs. Imatges obtingudes per microscòpia confocal de cèl·lules LN229 sense tractament i tractades amb 10µM d’ Erlotinib, Imatinib, Sunitinib i SU11274 (de dalt a baix ) després de realitzar el protocol de immunofluorescència descrit a l’apartat de Material i Mètodes. Les imatges mostres tinció d’actina amb el marcador Faloïdina- TRICT (esquerra), tinció del nucli cel·lular amb el marcador DAPI (centre) i la tinció de actina i nucli (dreta).
23
T98GLes imatges corresponents a la condició control mostren la morfologia típica d’aquestes línies cel·lulars. Les cèl·lules LN229 mostren una morfologia epitelial, presentant una forma allargada i fina (Figura 14), i que és característica d’aquesta línia cel·lular. Per altra banda, les T98G tenen una morfologia fibroblàstica, no tan llargades ni fines com les LN229 (Figura 15) i poden presentar formes més diverses.
Es pot observar que quan aquestes són tractades amb inhibidors específics dels RTKs perden seva morfologia característica. La línia LN229 perd la forma allargada i adquireix formes més arrodonides i
ControlErlotinibImatinibSunitinib
Merge DAPI
Faloïdina-TRITC
SU11274
Figura 15. Canvis morfològics derivats de la modulació de la senyalització dels RTKs. Imatges obtingudes per microscòpia confocal de cèl·lules T98G sense tractament i tractades amb 10µM d’
Erlotinib, Imatinib, Sunitinib i SU11274 (de dalt a baix) després de realitzar el protocol de immunofluorescència descrit a l’apartat de Material i Mètodes. Les imatges mostres tinció d’actina amb el marcador Faloïdina- TRICT (esquerra), tinció del nucli cel·lular amb el marcador DAPI (centre) i la tinció de actina i nucli (dreta).
24
amples, fet que suggereix que la inhibició d’aquests receptors va acompanyada d’una reorganització del citoesquelet d’actina (Figura 14). Aquests canvis també s’ observen en les cèl·lules T98G que perden totalment la forma de fibroblast (Figura 15). La tinció d’actina permet veure variacions en la polimerització d’actina en la perifèria cel·lular i s’observa que les cèl·lules tractades es presenten com cèl·lules més grans i ben adherides al substrat, presentant un major nombre de fibres d’estrès.Via de les MAPK i PI3K/Akt 4.3.2
De la mateixa manera que en l’anàlisi de la motilitat, una vegada observat l’efecte de la modulació dels RTKS sobre la morfologia cel·lular, es va procedir a analitzar com varia aquest paràmetre quan s’inhibeix la via de les MAPK i la via de PI3K/Akt. Es van realitzar assajos d’immunofluorescència amb els inhibidors UO126 i LY294002.
LN229
Control UO126LY294002
DAPI
Faloïdina-TRITC Merge
Figura 16. Canvis morfològics derivats de la modulació de la senyalització de les vies MAPK i PI3K/Akt.
Imatges obtingudes per microscòpia confocal de cèl·lules LN229 sense tractament i tractades amb 10µM de UO126 i LY294002 després de realitzar el protocol de immunofluorescència descrit a l’apartat de Material i Mètodes. Les imatges mostres tinció d’actina amb el marcador Faloïdina- TRICT (esquerra), tinció del nucli cel·lular amb el marcador DAPI (centre) i la tinció de actina i nucli (dreta).
25
T98GEn las imatges es pot observar com el tractament amb aquest compostos també va associat a un canvi de morfologia tant en la línia LN229 com en la línia T98G (Figura 16 i 17). Malgrat les diferències respecte el control s’ha de dir que la variació morfològica no és tan accentuada com en el tractament amb inhibidors de RTKs, sobretot en el cas del tractament amb l’inhibidor LY294002, ja que tot hi ha canvis les cèl·lules conserven bastant bé la seva morfologia característica.
5 Discussió
Molts d’estudis entorn els GBMs es centren en la idea de què la millora de la efectivitat dels tractaments davant aquest tipus de càncer passa per un coneixement més profund dels mecanismes responsables de l’adquisició del fenotip altament invasiu de les seves cèl·lules . L’objectiu del present treball ha estat estudiar com determinats compostos podem induir una reducció en la motilitat e alteració en la morfologia d’aquestes cèl·lules inhibint determinades vies de senyalització.
Com s’ha comentat en la introducció, l’activació constitutiva dels RTKs és una de les alteracions genètiques més característiques dels GBM i suposa la desregulació de vies de senyalització directament relacionades amb el control de la proliferació, resistència a l’apoptosi e invasió cel·lular.
La senyalització mitjançada pels RTKs està associada a un augment en la motilitat de les cèl·lules de ControlUO126LY294002
Merge DAPI
Faloïdina-TRITC
Figura 17. Canvis morfològics derivats de la modulació de la senyalització de les vies MAPK i PI3K/Akt.
Imatges obtingudes per microscòpia confocal de cèl·lules T98G sense tractament i tractades amb 10µM de UO126 i LY294002 després de realitzar el protocol de immunofluorescència descrit a l’apartat de Material i Mètodes. Les imatges mostres tinció d’actina amb el marcador Faloïdina- TRICT (esquerra), tinció del nucli cel·lular amb el marcador DAPI (centre) i la tinció de actina i nucli (dreta).
26
glioma [28], fet que s’ha pogut constatar amb la observació d’una reducció en la motilitat de les línies LN229 i T98G quan són tractades amb compostos que tenen com a diana d’acció aquest tipus receptor. La inhibició de la senyalització aberrant dels RTKs amb petites molècules que interfereixen selectivament en l’activitat tirosina intrínseca, evitant la seva autofosforilació i la transducció de senyal [29] . Això explica perquè les cèl·lules LN229 i T98G veuen la seva motilitat significativament reduïda quan són tractades amb inhibidors específics EGFR, PDGFR,VEGFR i Met.La senyalització dels RTKs és una diana de modulació a tres nivells principalment, ja que es pot actuar inhibint els propis receptors com les vies MAPK i PI3K/Akt que són els principals efectors de la seva senyalització. L’apreciació de l’efecte de la modulació en aquest vies passa per actuar damunt dels punts crítics d’aquestes, como és el cas de MEK que és l’encarregada d’activar a ERK que estimula la transcripció de tota una sèrie factors de creixement i contribueix a la pèrdua de control de la proliferació cel·lular[30]. La supervivència de les cèl·lules de GBM també es veu afavorida per la inhibició de senyals proapoptòtiques i l’increment de la síntesis proteica processos cel·lulars lligats a l’activació de PI3K,que té com a principal molècula efectora de Akt [19]. Tant les cèl·lules LN229 com les T98G han vist reduïda la seva motilitat com a conseqüència de tractament amb inhibidors específics de MEK i PI3K.
L’adquisició del fenotip migrador característic de les cèl·lules de GBMS respon tant a la desregulació d’aquestes vies de senyalització directament relacionades amb la motilitat cel·lular com als canvis que es donen en la morfologia de les cèl·lules en resposta a la modulació d’aquestes vies. Sent les proteïnes Rho els principals reguladors del citoesquelet i que actuen controlant els processos cel·lulars que requereixen d’alteracions dinàmiques del citoesquelet per afavorir l’avanç de les cèl·lules. L’activitat dels RTKs i, especialment la senyalització mediada per EGFR, és de gran importància per assegurar l’equilibri entre l’activitat de Rho i Rac, i així afavorir l’adquisició del fenotip fluid caracteritzat per una elevada motilitat e invasió [31]. Això explica perquè, tot i que no s’han utilitzat inhibidors específics de proteïnes Rho, el tractament amb els compostos utilitzats en els diferents assajos provoca una major rigidesa del citoesquelet d’actina tant en cèl·lules LN229 com T98G, induint la formació de fibres d’estrès i adhesions focals i que es correlaciona amb la inhibició de la seva motilitat e invasió.
Totes aquests observacions ens permès veure la importància dels efectes mediats pels RTKs sobre la motilitat, morfologia i adhesió de cèl·lules de glioma, i analitzar el paper de les vies de senyalització MAPK i P13K/Akt damunt els mateixos.
27
6 Conclusions
1. La inhibició dels RTKs condueix a una reducció de la motilitat de les línies LN229 i T98G.
2. La disminució en la motilitat també es veu associada a la inhibició de les vies MAPK i PI3K/Akt .
3. Els canvis morfològics produïts per la inhibició dels RTKS i les vies MAPK i PI3K/Akt reflecteixen la seva associació amb les vies regulades per les proteïnes Rho.
Per la qual cosa concloem que es tracta de vies de senyalització susceptibles a ser diana de futures estratègies terapèutiques aplicades al tractament els GBMs.
7 Bibliografia
1. Lefranc, F., J. Brotchi, and R. Kiss, Possible future issues in the treatment of glioblastomas: special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells to apoptosis. J Clin Oncol, 2005. 23(10): p. 2411-22.
2. Maher, E.A., et al., Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev, 2001. 15(11): p. 1311-33.
3. Louis, D.N., et al., The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol, 2007. 114(2): p. 97-109.
4. Furnari, F.B., et al., Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev, 2007. 21(21): p. 2683-710.
5. Zohrabian, V.M., et al., Rho/ROCK and MAPK signaling pathways are involved in glioblastoma cell migration and proliferation. Anticancer Res, 2009. 29(1): p. 119-23.
6. Purow, B. and D. Schiff, Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass? Nat Rev Neurol, 2009. 5(8): p. 419-26.
7. Ohgaki, H., Genetic pathways to glioblastomas. Neuropathology, 2005. 25(1): p. 1-7.
8. Ohgaki, H. and P. Kleihues, Genetic alterations and signaling pathways in the evolution of gliomas. Cancer Sci, 2009. 100(12): p. 2235-41.
9. Planells, R.V., Anàlisi "ex vivo" de mecanismes d'inducció d'apoptosi i resistència al tractement en gliomes malignes, in Facultat de Medicina. 2011 Universitat de Barcelona.
10. Huse, J.T. and E.C. Holland, Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nat Rev Cancer, 2010. 10(5): p.
319-31.
11. Kapoor, G.S. and D.M. O'Rourke, Receptor tyrosine kinase signaling in gliomagenesis: pathobiology and therapeutic approaches. Cancer Biol Ther, 2003.
2(4): p. 330-42.
12. Joshi, A.D., et al., Evaluation of tyrosine kinase inhibitor combinations for glioblastoma therapy. PLoS One, 2012. 7(10): p. e44372.
13. Olar, A. and K.D. Aldape, Using the molecular classification of glioblastoma to
inform personalized treatment. J Pathol, 2014. 232(2): p. 165-77.
28 14. Joo, K.M., et al., MET signaling regulates glioblastoma stem cells. Cancer Res, 2012.
72(15): p. 3828-38.
15. Boccaccio, C. and P.M. Comoglio, The MET oncogene in glioblastoma stem cells:
implications as a diagnostic marker and a therapeutic target. Cancer Res, 2013.
73(11): p. 3193-9.
