Effekter av miljøgifter i sediment på flerbørstemark Hediste diversicolor

på flerbørstemark Hediste diversicolor

Silje Kile

Masteroppgave i toksikologi, ved Biologisk Institutt.

UNIVERSITETET I OSLO

15.05.09

TAKK!

Denne Master of Science- avhandlingen ble utført ved Norsk Institutt for

Vannforskning, NIVA i tidsrommert 2007-2009. Intern veileder var Ketil Hylland og ekstern veileder var Merete Grung (NIVA).

Først vil jeg takke alle de tålmodige sjelene på NIVA for opplæring og da spesielt Oscar Fogelberg. Jeg vil også takke Eirin Sva Stomperudhaugen og Tor Fredrik Holt for opplæring av CEA og TOSC.

Ketil Hylland har vært min veileder gjennom denne tiden, som virkelig har hatt sine

”ups and downs” og da selvfølgelig mest mot innlevering (”long time, no see?”). Du har vært helt fantastisk å ha som veileder, tålmodigere og triveligere sjel skal man leite lenge etter!

Jeg har også hatt en tredje ”veileder”, Kenneth Macrae. Kenny, du gjorde alle de lange dagene i kalde, fuktige og mørke bløtbunnshallen på Solbergstrand artige. Og takk for alt du har lært meg gjennom perioden!

Og så er det jo bare å nevne i fleng, alle dere som er rundt meg hver dag, og holder ut: Takk Linda, for alle middagene og for korrekturlesing av oppgaven, takk Elin for all statistikkopplæringen, takk Truls for fremdeles å være der og støtte meg selv om vi gjorde det slutt, takk alle på lesesalen for mye fantastisk tokslærdom, takk Einar som passet på at progresjonen gikk som den skulle.

Og for all del, takk min kjære mamma og pappa, som alltid har vært der.

Og til dere jeg glemt, takk og beklager, jeg leverer på overtid…

Innholdsfortegnelse

Oppsummering………6.

1. Introduksjon……….7

2. Bakgrunn………11

2.1.Sediment ”sink or source”………11

2.2.Aktuelle miljøgifter……….12

2.2.1. Polyaromatiske hydrokarboner………...12

2.2.2. Polyklorerte bifenyler………12

2.2.3. Tinnorganiske forbindelser………13

2.2.4. Metaller………13

2.3.Forsøksorganismen og nøkkelarten Hediste diversicolor……….15

2.4.Biomarkører………15

2.5.Cellular Energy Allocation………..16

2.6.Total Oxyradical Scavenging Capacity………17

3. Materialer og metoder……….19

3.1.Innsamling av sediment………19

3.2.Forsøksorganismene……….19

3.2.1. Flerbørstemarken Hediste diversicolor og fjæremarken Arenicola marina…19 3.3.Fordeling av mark og sediment i akvarier………...20

3.4.Forsøksoppsett………...20

3.5.Prøvetakning………22

3.5.1. Prøvetakning av Hediste diversicolor………..22

3.5.2. Prøvetakning av Arenicola marina………23

3.6.Kjemisk analyse av sediment og A. marina………..23

3.7.Kjemisk analyse av sediment og A. marina………..26

3.7.1. Polysykliske aromatiske hydrokarboner i A. marina………..26

3.7.2. Polysykliske aromatiske hydrokarboner i sedimenter………26

3.7.3. Polyklorerte bifenyler i A. marina……….27

3.7.4. Polyklorerte bifenyler i sedimenter………27

3.7.5. Tinnorganiske forbindelser i sedimenter………28

3.7.6. Metaller i sedimenter………...28

3.7.7. Metaller i A. marina……….28

3.8.Kornfordeling og totalt innhold av karbon ……….28

3.9.Cellular Energy Allocation……….29

3.9.1. Homogenisering………29

3.9.2. Energi forbrukt………..30

3.9.3. Energi tilgjengelig……….31

3.9.4. Beregning av CEA………...34

3.9.5. Beregning av endring over tid………...34

3.10. Total Oxyradical Scavenging Capacity………....35

3.10.1. Homogenisering……… ……36

3.10.2. Fortynning……… ……36

3.10.3. TOSC analysen……….36

3.10.4. Proteinanalyse……… ……37

3.11. Beregning av overlevelse og biomasseforandring……….38

3.12. Statistiske analyser………...38

4. Resultater………..40

4.1.Unnvikelsesadferd, dødelighet og biomasseforandring……….40

4.1.1. Unnvikelsesadferd……….40

4.1.2. Dødelighet……….41

4.1.3. Biomasseendring………...42

4.2.Cellular Energy Allocation………...43

4.2.1. Energi forbrukt………..43

4.2.2. Energi tilgjengelig……….46

4.2.3. Cellular energy allocation……….54

4.3.Total Oxyradical Scavenging Capacity………....55

5. Diskusjon………...56

5.1.Unnvikelsesadferd, dødelighet og biomasseforandring………56

5.2.Cellular Energy Allocation………..57

5.2.1. Energi forbrukt……….57

5.2.2. Energi tilgjengelig………57

5.2.3. CEA……….59

5.3.Total Oxyradical Scavenging Capacity………...59

5.4.Eksperimentelt design ……….59

6. Konklusjon………61

7. Kildeliste………62

8. Vedlegg………..69

8.1.Markfordelingsvekter………..69

8.2.Liste over kjemikalier………..70

Oppsummering

Grenlandsfjorden er svært forurenset, mye grunnet store utslipp av miljøgifter fra magnesiumfabrikken på Herøya. Når det skal vurderes om sedimentet i deler av Grenlandsfjorden bør dekkes til med rent sediment er det viktig å gjøre nok testing av for å begrense kostnadene til oppryddingen. Biomarkører er en viktig del av

toksisitetstestingen. Hediste diversicolor er en sedimentlevende nøkkelart som har stor spreding i hele nordvest Europa. Denne studien brukte H. diversicolor for å utføre toksisitetstesting av forurenset sediment, med analysemetodene ”cellular energy allocation” (CEA) og total oxyradical scavenging capacity” (TOSC). CEA er et mål på organismens netto energibudsjett, bestående av tilgjengelig energi (Ea) og forbrukt energi (Ec). TOSC kvantifiserer et vevs evne til å binde opp -og

ufarliggjøre- frie radikaler. Begge disse metodene vil gi informasjon om markens helse. Studiet varte i 8 uker, med prøvetakningspunkt etter 1, 2, 4 og 8 uker, for å se om det var mulig å finne effekter over tid. Det bestod av fire behandlinger, referanse sediment fra Elle og Solbergstrand og forurenset sediment fra Grenlandsfjorden. Det ble studert to replikater av sedimentet fra Grenlandsfjorden. Unnvikelsesadferd, biomasseendring, og dødelighet ble målt. CEA analysene ga mange varierende og signifikante forskjeller mellom behandling og uke, den mest interessante oppdagelsen var at det var store forskjeller mellom mark behandlet med de to

referansesedimentene og mellom mark eksponert for de to forurensede sedimentene.

Det var ingen signifikante forskjeller å finne med hensyn på TOSC.

1. Introduksjon

Verdens mest produktive marine økosystemer finnes i estuarier, og samtidig ligger det et stort miljøpress på akkurat disse økosystemene i form av miljøgifter (Chapman and Wang 2001). Sediment kan være et lager for forurensninger som kommer

gjennom avløp, overflatevann og utslipp fra industrien (Du, Mu et al. 2008; Borretzen and Salbu 2009), i tillegg til luftbårne forurensninger (Langedal and Ottesen 1998).

Sammen med den industrielle revolusjon, ble menneskelig aktivitet og landbruk forandret dramatisk. Metallindustri og økt befolkningsvekst resulterte i store mengder avfall som ultimat endte i sedimentene (Du, Mu et al. 2008). Forurenset sediment vil også fungere som en kilde til forurensning (Moreira, Lima et al. 2006) blant annet fra ett trofisk nivå til det neste i form av prosessene bioakkumulering og

biomagnifisering. Bioakkumulering kan defineres som opptak – (utskillese + omdanning) (Pers.komm.Hylland 2007). Biomagnifisering er en prosess hvor konsentrasjonen av en substans er høyere enn konsentrasjonen i organismens diett (Ruus, Berge et al. 2006). Bioturberende arter som Hediste diversicolor forandre sedimentets fysiske og kjemiske egenskaper og kan føre til ”frigivelse” av miljøgifter bundet til sedimentpartikler (Aller 1992; Madsen, Forbes et al. 1997; Gunnarsson, Hollertz et al. 1999).

For tiden vurderer Statens forurensningstilsyn, SFT, om bunnen i deler av

Grenlandsfjorden skal dekkes til med rent sediment, for å hindre miljøgifter bundet til sedimentpartikler i å bli spredd (Olsen 2006). Store deler av Grenlandsfjorden er regulert av kostholdsråd og omsetningsforbud på grunn av høye nivåer av miljøgifter.

Blant miljøgiftene det fokuseres på, er polyklorerte bifenyler (PCBer),

polyaromatiske hydrokarboner (PAHer) og ikke-essensielle metaller, som kvikksølv (Hg), kadmium (Cd) og bly (Pb) I en rapport NIVA har skrevet om emnet (Helland, Olsen et al. 2004) antar de at hovedkildene til miljøgiftene er blant andre industri, kommunalt avløp og avrenning fra tette byområder, forurenset grunn og deponier. På Herøya, nær Porsgrunn, har Norsk Hydro forvaltet en magnesiumfabrikk fra 1951 til 2001 (Ruus, Berge et al. 2006). Magnesiumfabrikken har vært ansvarlig for store utslipp av svært toksiske miljøgifter som polyklorerte dibenzo-p-dioxiner (PCDDer)

og dibenzofuraner (PCDFer). Under produksjonen av magnesium ble omtrent 95% av produksjonsbiproduktene PCDD og PCDF sluppet ut i Friefjorden (Knutzen and Oehme 1989).

Figur 1Kart som viser kostholdsregulerte områder i Grenlandsfjorden.

Hentet fra www.miljostatus.no

For å evaluere effektene av forurenset sediment, må det gjennomføres

toksisitetstesting av sedimentet. Toksisitetstestingen av sediment bør ikke bare bestå av kjemiske analyser, men også biologisk testing for å kunne avgjøre faktiske effekter på mennesker, dyr og planter (Martin-Diaz, DelValls et al. 2008). Biologisk testing kan gi svar på miljøgiftens biotilgjengelighet, om miljøgiften(e) akkumuleres i

testorganismen og eventuelt om det finnes interaksjoner mellom ulike miljøgifter som vil virke inn på både biotilgjengelighet og bioakkumulering (McCauley, DeGraeve et al. 2000).

Flerbørstemarken Hediste diversicolor er en av de vanligste kystlevende

flerbørstemarkartene i nordvest Europa (Dales 1950). Som forsøksorganisme er H.

diversicolor enkel og billig å samle, tar liten plass og er økologisk relevant for toksisitetstester på sediment. I tillegg til at flere flerbørstemarker er kjent som

”forurensningsindikatorer” på grunn av sin følsomhet overfor miljøgifter

(Pocklington and Wells 1992), består dietten til mange fisk og vadefugler av H.

diversicolor (Wanink and Zwarts 1993; Laffaille, Pétillon et al. 2005). Når en fisk eller vadefugl spiser et stort antall børstemark, vil persistente miljøgifter hope seg opp i rovdyret, en prosess som kalles biomagnifisering (Verweij, Booij et al. 2004).

På denne måten vil mange flerbørstemark som i utgangspunktet kun har en lav

konsentrasjon av miljøgifter, gi neste trofiske nivå en samlet høyere konsentrasjon av miljøgift. Siden mennesket er på toppen av næringskjeden, vil vi potensielt få i oss høye konsentrasjoner av miljøgifter ved å spise fisk som befinner seg høyt oppe i næringskjeden, som for eksempel makrell (Bayarri, Baldassarri et al. 2001).

Flere har tidligere brukt biomarkører i H. diversicolor for å finne subletale effekter av toksikanter (Ait Alla, Mouneyrac et al. 2006; Sun and Zhou 2008; Solé, Kopecka- Pilarczyk et al. 2009). Det finnes mange definisjoner på biomarkør, Grethe Braastad (2000) ved SFT har definert biomarkør som en “biokjemisk, fysiologisk eller

morfologisk respons fra levende organismer på forurensningseksponering eller effekt og som kan forutsi fremtidig skade eller være en skadelig effekt i seg selv. Den er målbar i et biologisk system eller en biologisk prøve.” “Cellular energy allocation”

(CEA) er en metode som ble utviklet som en biomarkør for å vurdere effekten toksisk stress har på en organismes energibudsjett (DeCoen and Janssen 1997). CEA er en differanse mellom organismens tilgjengelig energi (Ea) og energi den forbruker (Ec).

“Total oxyradical scavenging capacity” (TOSC) er en annen biomarkør for oksidativt stress. Dette er en forholdsvis ny metode for å beregne hvor effektivt

antioksidantforsvaret til organismen binder opp radikaler (Winston, Regoli et al.

1998).

Dette studiet hadde til formål å sammenlikne effekten de ulike behandlingene (sediment fra Elle, Solbergstrand, Grenland 1 og Grenland 2) hadde på

flerbørstemarken H. diversicolor, ved å måle TOSC og CEA. To andre delmål besto i

å klarlegge om de ulike behandlingene hadde forskjellig innvirkning på

nedgravningstiden til H. diversicolor (unnvikelsesadferd), og om de forskjellige behandlingene ville påvirke biomassen til forsøksorganismen. Vekten til

testorganismene ble målt ved forsøkets start og igjen ved prøvetakning, ved uke 1, 2, 4 og 8.

Prosjektet hadde følgende nullhypoteser:

 Forurenset sediment påvirker ikke adferden til Hediste diversicolor

 Forurenset sediment påvirker ikke biomassen til Hediste diversicolor

 Forurenset sediment påvirker ikke de ulike komponentene i tilgjengelig energi, protein, fettstoff og karbohydrat, i Hediste diversicolor

 Forurenset sediment påvirker ikke den cellulære respirasjonen til Hediste diversicolor

 Forurenset sediment påvirker ikke “cellular energy allocation” i Hediste diversicolor

 Forurenset sediment påvirker ikke “total oxyradical scavenging capacity” i Hediste diversicolor

2. Bakgrunn

2.1 Sediment, “sink or source”

Sediment stammer naturlig fra organisk materiale og erosjon av mineraler fra oppstrømsområder og i elver. Menneskeskapte, antropogene, kilder til miljøgifter i sediment er som tidligere nevnt, industri, kommunalt avløp og avrenning fra tette byområder, forurenset grunn og deponier. En fjord som Grenlandsfjorden har en form gjør at sedimentene lukkes inne i et basseng, siden fjorden er dyp med grunne

fjordutløp (SFT 2008). Organisk materiale i sedimenter gjør det til et næringsrikt habitat for et stort biologisk mangfold. Den store biodiversiteten skyldes blant annet gradientene i habitatene rundt sediment, gradienter mellom saltvann, brakkvann og ferskvann, og mellom tørt og vått (SedNet 2004).

Sediment har lenge blitt ansett som en lagringsplass for miljøgifter som

polyaromatiske hydrokarboner, PAHer, og polyklorerte bifenyler, PCBer (Karlsson, Sundberg et al. 2008). I senere tid har man forstått at sedimenter og kan være en kilde til utlekking av miljøgifter (Moreira, Lima et al. 2006). Utlekking avhenger blant annet av de kjemiske egenskapene til miljøgiftene og hvor sterkt de er bundet til sedimentpartiklene. Hydrofobe miljøgifter som PCB og PAH vil bindes til partikler.

På grunn av et stort overflateområde og hul struktur binder sot PAHer sterkere enn organisk karbon og har en svært lav desorpsjonsrate (Amy Oen 2006). Andre kilder til spredning av miljøgifter er opptak av organismer, oppvirvling av sediment av bunnlevende dyr og skipstrafikk (SFT 2008).

Toksisitetstester i laboratorium kan utføres på rent sediment som er kunstig

forurenset med miljøgifter, eller på et sediment som er hentet fra et forurenset sted.

2.2 Aktuelle miljøgifter

I Grenlandsområdet er PAHer, PCBer, tinnforbindelser og ikke-essensielle metaller som kadmium, bly og kvikksølv et problem. Felles for alle disse miljøgiftene er at de er svært persistente og har en stor spredning, noen av dem er fettløselige og

bioakkumuleres.

2.2.1 Polyaromatiske hydrokarboner, PAHer

Polyaromatiske hydrokarboner dannes naturlig fra ufullstendige forbrenninger av organisk materiale og blant antropogene kilder er aluminiumsverk og

forbrenningsmotorer bidragsytere til forurensningen (Gschwend and Hites 1981).

PAHer bevist kreftfremkallende og dannes i forbrenningsreaksjoner. PAHer metaboliseres i H. diversicolor, men akkumuleres også i markens fettstoffer (Christensen, Andersen et al. 2002). Augenfelt og Andreson et al. (1982) fant en økning i PAH konsentrasjon på 4-6 ganger høyere enn sedimentkonsentrasjonen i flerbørstemarken Abarenicola pacifica, etter eksponering i to uker.

2.2.2 Polyklorerte bifenyler

Polyklorerte bifenyler er kjemisk stabile forbindelser med mange ønskede egenskaper som lav elektrisk ledningsevne, liten brennbarhet og høy varmeresistens. Disse egenskapene har gjort PCB til et hyppig brukt kjøle- og isolasjonsmiddel. PCBer er fettløselige forbindelser som bioakkumuleres og biomagnifiseres. SFT klassifiserer dem som ”meget helse- og miljøskadelig” (SFT ; Shields 2006). PCB er kjent for sine immunotoksiske egenskaper (Duffy, Li et al. 2005), og for å være potensielt

kreftfremkallende for mennesker, klassifisert som 2A karsinogen av International Agency for Research on Cancer (IARC) (Shields 2006).

2.2.3 Tinnorganiske forbindelser

Tinnorganiske forbindelser, eller såkalte organotiner består av mono-,di- og tributyltinn og mono-, di- og trifenyltinn. Tributyltinn, TBT, var tidligere en svært

populær antigrobehandling på båter (Lespes, Marcic et al. 2009) og har derfor stor spredning. Trifenyltinn er også et biocid og brukes aktivt i agrikultur og er derfor også å finne i sedimenter (Bancon-Montigny, Lespes et al. 1999). Triorganotiner har også blitt brukt som fungicid, insekticid og som sprøytemiddel mot flott og midd (Kannan and Lee 1996). Fytoplankton eksponert for trifenyltinn ble hindret

respirasjon og fotosyntese (Mooney and Patching 1995). Avhengig av temperatur har trifenyltinn en halveringstid mellom 8 og 150 dager (Yen, Tsai et al. 2001).

Tributyltinn ble funnet å være mer stabil med en halveringstid mellom 15 uker og flere år (Marcic, Le Hecho et al. 2006).

2.2.4 Metaller

Spormetaller er essensielle for at mange av de biokjemiske mekanismene en organisme er avhengig av skal fungere, fra DNA transkripsjon til stabile proteiner.

Når det blir for høy konsentrasjon av spormetaller, vil de bli toksiske ved å for eksempel danne frie radikaler (Bury, Walker et al. 2003). Fisk tar opp metaller gjennom føde og over gjellene. Når fisk tar inn kobber vil det akkumuleres i lever hvor ceruloplasminsyntese skjer. Ceruloplasmin vil, i tillegg til Cu-albumin, fraktes rundt i blodet som kobberlager (Harris 2000). For laks (Salmo salasar) er 1–15 mg kg

-1 kroppsvekt toksisk dose, og parameterne på kobbertoksisitet er nedgang i vekst, overlevelse eller reproduksjon (Clearwater, Farag et al. 2002).

Kadmium (Cd), bly (Pb) og kvikksølv (Hg) er ikke-essensielle metaller og har den betegnelsen fordi de ikke har noen kjent biologisk funksjon (Neathery and Miller 1975; Alloway 1995). Konsentrasjon av ikke-essensielle metaller i sediment er vanligvis mellom tre og fem størrelsesordener høyere enn i overliggende vannmasser, og av denne grunn vil sedimentlevende arter være særlig viktig med hensyn på biotilgjengelighet og bioakkumulering (Bryan and Langston 1992). Kadmium, bly og kvikksølv i uorganisk form har svært lav biotilgjengelighet, og er derfor lite toksisk (Neathery and Miller 1975; Vig, Megharaj et al. 2003). Organiske former av de ikke- essensielle metallene er derimot toksiske, fordi de er biotilgjengelige og fordi

organismer stort sett mangler homeostatiske kontrollmekanismer, som utskillelse, av disse (Cotzias, Selleck et al. 1961; Neathery and Miller 1975).

Kadmium finnes i orer hvor man finner sink og følger på som biprodukt ved sinkutvinning.. Andre kilder til kadmium er gjødsel, industriavfall og kloakkslam som ultimat ender i sedimenter (Alloway 1995). Biotilgjengelighet av Cd er komplekst og avhenger av flere faktorer, blant andre sediment type og

partikkelstørrelse. Biotilgjengelighet og effekt av kadmium ble undersøkt for tre arter, reke (Palaemonetes pugio), flerbørstemark (Neris virens) og blåskjell (Mytilus

edulis) som ble eksponert for Cd-behandlet sediment i 14 dager. Rekene viste store effekter på respirasjon, og alle testorganismene foruten flerbørstemarken akkumulerte kadmium (Rule and Alden 1990). Kadmium biomagnifiseres fra virvelløse dyr til fisk (Croteau, Luoma et al. 2005).

Kvikksølv er svært giftig både for miljø og menneskers helse (SFT).

Biotilgjengelighet av kvikksølv bestemmes i aller største grad av metallets tilstandsform, hvor metyl-Hg er svært biotilgjengelig. Metylert kvikksølv biomagnifiseres, og konsentrasjonen av metylkvikksølv i fisk overstiger i flere områder maksimalkonsentrasjon av kvikksølv for menneskemat (Morel, Kraepiel et al. 1998).

Bly bioakkumuleres i fisk. Toksiske effekter av bly i fisk (eksperiment utført på regnbueørret Salmo gairdneri) er forstyrrelse av mekanismer som regulerer

ionebalansen, deriblant forstyrrelse av kalsiumionbalansen og innblanding i Na⁺ og Cl^- regulering (Rogers, Richards et al. 2003; Rogers and Wood 2004; Rogers, Patel et al. 2005). Fiskeegg er spesielt følsomme for blyeksponering (Davies, Goettl Jr et al.

1976).

2.3 Forsøksorganismen og nøkkelarten Hediste diversicolor

Hediste diversicolor er en god forsøksorganisme på mange måter. For det første er den relevant i forhold til studier på effekter av sedimentforurensninger, siden den er en sedimentlevende art som ernærer seg av sedimentet. Den har lenge blitt beskrevet som predator og åtseleter, men kan og bedrive “deposit” og “suspention feeding”

(Riisgard 1991).

Økologisk har H. diversicolor en stor spredning og er ansett som en nøkkelart som bytte for andre organismer (Garcia-Alonso, Muller et al. 2008), blant andre fisk og vadefugler. Arten er også lett å samle og siden den tar liten plass, vil man kunne bruke mange organismer som vil resultere i høyere statistisk teststyrke. De kan holdes i laboratorium og er følsomme for overfor miljøgifter (Pocklington and Wells 1992).

Arten er også en velbrukt testorganisme fordi den har høy toleransegrense når det gjelder variasjon i salinitet og temperatur (Hickman C.P Jr 1997).

Et interessant aspekt ved forurenset sediment er om det vil ha noen virkning på adferden til organismer som har sediment som habitat. Unnvikelsesadferd hos invertebrater har blitt dokumentert i flere artikler (McGreer 1979; Mohlenberg and Kiorboe 1983). Om dyrene vegrer seg for å grave seg ned vil de være mer utsatt for predatorer og bølger (Mohlenberg and Kiorboe 1983). H. diversicolor er en

interessant art å teste unnvikelsesadferd, siden den lever i sedimentet.

2.4 Biomarkører

Opprydning i forurensede sedimenter er en kostbar prosess, og ikke alle forurensede havbunner verken kan eller trenger å bli ryddet opp i. Miljøgifter som ikke er

biotilgjengelige, gjør lite skade. For å kunne lokalisere hvor opprydning er mest kritisk, har det blitt utviklet et verktøy for å identifisere signifikant forurenset sediment og for å gjøre opprydningsprosessen mest mulig effektiv, og ikke minst kostnadseffektiv (Martin-Diaz, DelValls et al. 2008).

Biomarkører brukes for å finne subletale effekter av forurensninger og regnes som et

”tidlig” varsel, siden effekter på molekylnivå skjer på et terskelnivå som er mindre toksisk enn de nivåene som kan oppdages på art, populasjon eller samfunn (Won, Raisuddin et al. 2007). Biomarkører kan brukes i laboratorium eller in situ.

Laboratoriestudier er praktiske og lette å kontrollere, men samtidig forsvinner mye av den naturlige variabiliteten i eksponering som følger med i in situ biomarkører

(Adams, Greeley et al. 2000).

2.5 Cellular Energy Allocation

Det er dyrt og tidskrevende å få resultater fra veldig lange eksponeringstider, og det bør være et mål for toksisitetstester at resultatene kan innhentes raskt og at de kan overføres til populasjonsnivå. Metoder som er på økosystemnivå vil ofte kunne finne effekter som ikke kommer frem på organisme eller populasjonsnivå, men til gjengjeld kan de være dyre (Suter 1992).

Flere metoder som har som mål å koble effekter under organismenivå til

populasjonsnivå har blitt utviklet, blant andre “scope for growt” som går ut på å måle absorbert energi, for eksempel med fôringsrate, og så trekke fra forbrukt og utskilt energi (Warren and Davies 1967). Et stort minus ved metoden er at den er

tidskrevende og vanskelig anvendbar i rutinevurdering av miljøpåvirkning (DeCoen and Janssen 1997).

CEA kalkuleres ved hjelp av differansen av to komponenter, energi tilgjengelig (Ea) og energi forbrukt (Ec). Ea regnes ut ved å måle og addere totalt innhold av proteiner, fettstoffer og karbohydrater i organismen. Ec bestemmes ved å måle

elektrontransportsystem (ETS) aktiviteten på mitokondrienivå, det vil si, cellulær respirasjon. Foruten å se på hele CEA, så er det og interessant å se hvordan de ulike parameterne forandres individuelt (DeCoen and Janssen 1997).

Resultatene i artikkelen til De Coen og Janssen (1997) viser at effektnivåene til et 96 timers CEA studie er sammenliknbart med effektnivåene i et

langttidspopulasjonsstudie, med populasjonsnivå som endepunkt. Det har derfor blitt foreslått at en korttids CEA analyse kan være en nyttig metode for å forutse

langtidseffekter av på populasjonsnivå (DeCoen and Janssen 1997).

2.6 Total Oxyradical Scavenging Capacity

“Reactive oxygen species” (ROS) dannes i aerobe organismer som en konsekvens av kobling av oksidativ fosforylering av adenosindifosfat (ADP) med reduksjon av fire elektroner av molekylært oksygen til vann (Halliwell 1978). ROS skader

mitokondriene, hvor de dannes, og kan også forandre funksjonen til proteiner,

fettstoffer og DNA ved å binde seg og derved forandre strukturen (Zang, Maass et al.

2007).

Miljøgifter kan øke den intracellulære formasjonen av ROS på mange måter, for eksempel gjennom Fentonreaksjonen (Winston, Feierman et al. 1984) eller redoksresirkulering av organiske forbindelser, som parakvat og kinoner (Kappus 1986). Redoksresirkulering er en prosess hvor visse molekyler kan reduseres til et korresponderende fritt radikal. Det frie radikalet vil raskt donere elektronet til oksygen og slik danne radikalet superoksidanion, O2•-. Tilbake står den opprinnelige organiske forbindelsen som på nytt blir redusert til et fritt radikal (figur?)(Kappus 1986).

For å unngå massiv skade av ROS har aerobe organismer evolvert et

antioksidantforsvar, med både generelle antioksidanter som vitamin E, betakaroten, askorbinsyre, urinsyre og glutation, og spesielt tilpassede enzymer som

superoksidismutase, katalase og glutation peroksidase.

Mange studier på oksidativt stress er bygget på enslige og spesifikke antioksidanters respons på stress (Halliwell 1978), mens senere forskning har vist at antioksidanter i virkeligheten “samarbeider” og oppnår slik bedre resultat enn single antioksidanter (Wayner, Burton et al. 1987).

“Total oxyradical scavenging capacity ” er en metode for å måle en organismes potensielle antioksidantforsvar. Ved omtrent 36º C gjennomgår 2,2’ – azobis – amidinopropane (ABAP) homolyse til peroksidradikaler. Peroksidradikalene vil oksidere α – keto – γ – methiolbutyric acid (KMBA) til etylengass som kan måles kvantitativt i en gasskromatograf. Jo mindre etylengass som blir laget, jo større antioksidantforsvar i vevet. Metoden er testet opp mot fluorescens- og

oksygenelektrode baserte analyser, og har vist seg å være pålitelig for å kvantifisere potensialet for fjerning av ROS (Winston, Regoli et al. 1998).

3. Materialer og metoder

3.1 Innsamling av sediment

8. mars 2007 ble det samlet inn referansesediment ved hjelp av forskningsfartøyet

”Trygve Braarud”, som tilhører Universitetet i Oslo. Til innsamlingen ble det brukt en 0,1 m² van Veen grabb og sedimentet ble overført til store plastbakker hvor det ble blandet. Referansesedimentet som ble brukt til kontrollgruppen ble samlet inn fra to steder i ytre Oslofjord, Elle (N 59º 39,115 Ø 10º 37,266) og Solbergstrand (N 59º 35,920 Ø 10º 38,142) på henholdsvis 98 og 214 meters dyp. Det forurensede sedimentet ble samlet inn fra Grenlandsfjorden av Morten Schaaning og Hans Christer Nilsson, NIVA. For å teste for lokale fordelinger av miljøgifter i

sedimentene fra Grenland, ble det samlet inn to bakker som gjennom hele forsøket ble behandlet som to individuelle behandlinger.

3.2 Forsøksorganismene

3.2.1 Flerbørstemark Hediste diversicolor og fjæremark Arenicola

Flerbørstemark av arten Hediste diversicolor ble sanket i Rambergbukta i Moss. H.

diversicolor lever i fjæra og ble samlet inn ved å spa opp sediment ved lavvann for så å plukke marken forsiktig ut for hånd. Marken ble så fraktet til NIVAs

forskningsstasjon på Solbergstrand hvor de ble lagt i akvarier som inneholdt

referansesediment og hadde vanngjennomstrømning. Der akklimatiserte de seg noen uker før forsøket startet. Det ble samlet inn omtrent 800 individer.

Arenicola marina ble kjøpt og transportert fra Seabait’s farm i Lynemouth, England hvor de ble oppdrettet.

3.3 Fordeling av mark og sediment i akvarier

Sedimentet ble homogenisert med en sementblander og målt opp (1 liter) før det ble tilsatt akvariene. Før tilsetting ble alle akvariene merket med behandling (A

Solbergstrand, B Elle, C og D Grenlandsfjorden), tidspunkt for prøvetakning (uke 1, 2, 4 og 8) og replikatnummer (1, 2, 3 og 4). Etter tilsetting fikk akvariene stå et par uker med vanngjennomstrømning og uten mark slik at sedimentet ble sedimentert ned.

Eksponeringen startet den 11. juni 2007. Markene ble delt inn i tre størrelser på øyemål, veid individuelt og plassert i tilfeldige kar. Det ble plassert mellom fem og ti marker i hvert akvarium og det ble gjort forsøk på å ha en blanding av de tre

markstørrelsene i hvert akvarium. Markene ble raskt og forsiktig tørket på papir, før de ble veid i et glass med sjøvann. Dag null ble åtte marker (nullprøver) frosset ned individuelt i cryorør i flytende nitrogen (-196 ºC). Det ble også målt

nedgravningstider for alle akvariene, hvor tiden ble tatt fra alle markene ble tilsatt i karet til alle hadde gravd seg ned.

A. marina ble plassert i egne kar, med samme ytre forhold. Det ble tilsatt en mark per kar á fire kar.

3.4 Forsøksoppsett

64 akvarier, hvorav 32 inneholdt forurenset sediment og 32 akvarier inneholdt rent sediment, ble plassert tilfeldig i forhold til hverandre i en åpen kasse med omtrent 20 cm høye kanter. Over akvariene var det en tank med sjøvann pumpet opp fra 60 meters dyp, som forsynte akvariene med vann gjennom plastslanger. Alt vannet som marken var i kontakt med under eksponering og prøvetakning, kom fra den samme hovedtanken. For å sikre en stabil temperatur i akvariene, var utløpet i kassen forhøyet slik at halve høyden til akvariene sto under vann.

Figur 2 Akvarieoppsett. Akvariene sto i en åpen kasse, og ble forsynt med vann fra 60m dyp. Utløpet var forhøyet slik at akvariene sto i vann

Akvariene var laget av gjennomsiktig plast med ytre dimensjoner på 15 cm x 15 cm x 25 cm. Det var festet på to skillevegger mellom langveggene i akvariene for å lede vannet over sedimentoverflaten og dermed unngå anoksiske forhold for markene.

Akvariene var dekket med gjennomsiktige plastlokk med hull til vannslange. Hullet i lokket var i motsatt ende av utgangshullet til vannet, som befant seg høyt oppe på kortveggen.

Figur 3 Akvariedesign. Hvert akvarium var utstyrt med to skillevegger for å sikre vannstrøm over sedimentoverflaten.

I eksperimentperioden ble målinger for temperatur og salinitet logget hver dag, til samme tidspunkt, i en hovedtank med konstant vanntilførsel. Gjennomsnittet for temperatur og salinitet var henholdsvis 8,34 ºC og 34,03 psu (practical salinity unit). Temperaturen varierte mellom 7,5 ºC og 9,2 ºC, og saliniteten varierte mellom 32,9 psu og 34,5 psu.

3.5 Prøvetakning

3.5.1 Prøvetakning av Hediste diversicolor

For å avgjøre om tiden hadde innvirkning på resultatene, ble det tatt prøver etter 1, 2, 4 og 8 uker, i tillegg til nullprøvene som ble tatt ut ved forsøkets start.

Sedimentet ble tynnet med sjøvann og silt i en sil med en med 1 mm store hull for å ikke miste de minste markene. Silen ble senket ned i store plastdunker fylt med sjøvann. Markene ble overført til vannfylte begerglass. Siden sediment var uønsket i analysene, sto forsøksorganismene noen timer i vannet for å gå seg tomme.

Begerglassene ble plassert i bakker med vann for å bevare lik temperatur. De ble så veid på samme vis som ved fordelingen, lagt enkeltvis i cryorør og så sjokkfryst i flytende nitrogen. Samme dag ble markene overført til en fryser på -80 ºC.

3.5.2 Prøvetakning av Arenicola marina

Siden denne forsøksorganismen kun skulle bli brukt i et bioakkumuleringsforsøk, ble det tatt ut fire individer ved dag null og fire i uke åtte (siste prøvetakningsdag).

Fjæremarken ble forsøkt tømt for sediment ved å sprute saltvann gjennom tarmen, veid og lagret ved -40 ºC til de ble analysert ved NIVA.

Sedimentprøver ble sendt til NIVA for kjemisk analyse ved dag null.

3.6 Kjemisk analyse av sediment og Arenicola marina (bioakkumulering)

Sediment og fjæremark ble analysert av NIVA, fremgangsmåte som følger:

Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) i biologisk materiale

Det biologiske materialet ble homogenisert, tilsatt internstandarder og forsåpet. PAH ble ekstrahert med n-pentan og tørket over natriumsulfat. Ekstraksjonsvolumet ble redusert, og ekstraktene ble renset ved GPC. Om nødvendig ble prøvene videre renset ved DMF-fordeling og eluering i silica-kolonner. Ekstraktene ble analysert ved hjelp av GC/MS i SIM, og konsentrasjonen av de ulike PAH-forbindelsene i standardløsningene var fra 5-1000 ng/µl. GC var utstyrt med en 30 m kolonne med et materiale bestående av 5% phenyl polysiloxane (0,25 mm i.d. og 0,25 µm filmtykkelse), og inlet var splitless. Den initielle kolonnetemperaturen var 60C, som etter 2 minutter ble høynet til 250C med en hastighet på 7C/min og deretter høynet til 310C med en hastighet på 15C/min. Injektortemperaturen var 300C, temperaturen i overføringen var 280C, og temperaturen i ionekilden var 230C.

Gjennomstrømningshastigheten var på 1,2 ml/min. Kvantifisering av individuelle komponenter ble utført ved å benytte interne standarder.

Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) i sedimenter

Sedimentet ble homogenisert og tilsatt internstandarder. PAH ble ekstrahert med DCM:sykloheksan (1:1) ved bruk av ASE ved en temperatur på 100C og trykk på 2000 psi. Videre rensing og analyse av ekstraktene er som beskrevet for PAH i biologisk materiale.

Polyklorerte bifenyler (PCBer) i biologisk materiale

Det biologiske materialet ble homogenisert og tilsatt internstandarder. PCB ble ekstrahert to ganger med sykloheksan:aceton (4:3) ved bruk av ultralyd i 3 min.

Ekstraktene ble vasket med saltvann (0,5%). Ekstraksjonsvolumet ble redusert, og ekstraktene ble renset ved GPC. Ekstraktene ble syrebehandlet med konsentrert svovelsyre og deretter analysert ved GC/EC. Konsentrasjonen av de ulike PCB- forbindelsene i standardløsningene var fra 2-1000 ng/µl. GC var utstyrt med en 60 m kolonne med et materiale bestående av 5% phenyl polysiloxane (0,25 mm i.d. og 0,25 µm filmtykkelse), og inlet var splitless. Den initielle kolonnetemperaturen var på 90C, som etter to minutter ble høynet til 180C i en hastighet på 10C/min, høynet til 270C med en hastighet på 2C/min og etter 1 min høynet til 310C med en hastighet på 20C/min. Injektortemperaturen var på 255C, detektortemperaturen på 285C gjennomstrømningshastigheten var på 1 ml/min. Kvantifisering av individuelle komponenter ble utført ved å benytte interne standarder.

Polyklorerte bifenyler (PCBer) i sedimenter

Sedimentet ble homogenisert og tilsatt internstandarder. PCB ble ekstrahert med DCM:sykloheksan (1:1) ved bruk av ASE ved en temperatur på 100C og trykk på 2000 psi. Videre rensing og analyse av ekstraktene er som beskrevet for PCB i biologisk materiale.

Tinnorganiske forbindelser i sedimenter

Homogent sediment ble tilsatt intern standard og de tinnorganiske forbindelsene ble ekstrahert ut fra sedimentet med saltsyre og kompleksert i en løsning av tropolone i etylacetat og heksan. De komplekserte forbindelsene ble etylert i en vandig løsning ved pH 4-5 og ekstrahert over i heksan. Ekstraktet ble renset på silica kolonne og analysert med GC/MS i SIM. Konsentrasjonen av de ulike tinnorganiske

forbindelsene i standardene var 1,5 – 4500 pg/µl. Den analytiske kolonnen var 30 m med 5 % phenyl polysiloxne (0,25 mm i.d. og 0,25 µm filmtykkelse), og injeksjonen var pulsed splitless. Den initielle kolonnetemperaturen var 50°C og ble økt til 290°C over flere trinn i løpet av 20 min. Kvantifiseringen av de individuelle komponentene ble utført ved å benytte en intern standard.

Forkortelser:

ASE: Accelerated Solvent Extraction DMF: Dimethylformamide

DCM: Dichloromethane

GPC: Gel Permeation Chromatography PAH: Polycyclic aromatic hydrocarbons PCB: Polychloronated biphenyls

SIM: Single Ion Monitoring

3.7 Kjemisk analyse av sediment og Arenicola marina (bioakkumulering)

3.7.1 Polysykliske aromatiske hydrokarboner A. marina

Median Nullprøver Elle Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2

PA-B 0,5 0,5 0,5 2,2 3,3

ANT-B 0,5 0,5 0,5 1,4 2,3

FLU-B 6,5 1,7 1,7 3,3 5

PYR-B 11 4,6 2,8 6 10

BAA-B 0,5 1 1,3 3,5 5,5

BKF-B 0,5 0,5 0,5 2,2 3,6

BEP-B 6,3 3,4 2,3 3,9 7,2

BAP-B 0,5 0,5 0,5 2,4 5,1

PER-B 0,5 0,5 1 1,1 1,4

ICDP-B 0,5 0,5 1,1 1,2 2,7

DBA3A-B 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

BGHIP-B 0,5 1,9 1,9 1,6 2,7

Sum PAH 30,7 17,6 12,1 38,7 66,7

Tabell 1PAH i A. marina. Alle verdier er medianverdier. Det er et forholdsvis høyt nivå av PAHer i nullprøvene. Grenland 2 har høyest bioakkumulering.

3.7.2 Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) i sedimenter

Median Elle Solbergstr

and Grenlan

d 1 Grenland 2

NAP 26 33 460 560

ACNLE 5,25 7,1 110 130

ACNE 7,1 6,3 39 44

FLE 15 12 130 150

PA 131,5 81 1100 1300

ANT 32,5 20 610 650

FLU 235 200 1600 1800

PYR 225 180 2100 2200

9BBJF 150 270 2500 2300

9CHR 86,5 97 1900 2000

BAA 91,5 87 1500 1500

BKF 55,5 100 800 720

BEP 110 180 1600 1500

BAP 83 100 1200 1000

PER 36 80 370 370

ICDP 75 270 800 730

DBA3A 13,5 40 260 240

BGHIP 115 250 900 840 Sum

PAH 1504 1999 18095 18058

Tabell 2 PAH i sediment. Alle verdier er medianverdier av tre målinger.

Solbergstrand har det laveste innholdet av PAH. De forurensede sedimentene har mellom 9 og 12 ganger mer PAH enn

referansesedimentene.

3.7.3 Polyklorerte biphenyler (PCBs) i A. marina

Median Nullprøve Elle Solbergstrand Grenland

1 Grenland 2

CB28-B 0 0 0 0 0

CB52-B 0 0 0 0 0

CB101-B 0 0 0 1,1 0,88

CB118-B 0 0 0 0 0

CB153-B 0 0 0 1 1

CB138-B 0 0 0 0,8 0

CB180-B 0 0 0 0 0

Sum PCB 0 0 0 2,9 1,88

Tabell 3 PCB i A. marina. Alle verdiene er medianverdier. Grenland 1 har høyest verdi. Ingen bioakkumulering av PCB i nullprøvene eller

referansesedimentene.

3.7.4 Polyklorerte bifenyler (PCBs) i sedimenter

Median Elle

Solbergstran

d Grenland 1 Grenland 2

CB28 0 0 0 0

CB52 0 0 0 0

CB101 0 0,5 0 0

CB118 0,695 2,3 0 0

CB153 0 0,74 0 0

CB138 0,53 0,87 0 0

CB180-

Sm 0 0 0 0

CB209-

Sm 0 0 700 680

Sum PCB 1,89 4,4 700 680

Tabell 4 PCB i sedimenter. Alle verdier er medianverdier. Svært lite innhold av PCB i referansesediment. Høyt innhold av PCB 209 i Grenland

1 og 2.

3.7.5 Tinnorganiske forbindelser i sedimenter

MedianElle Solbergstran

d Grenland 1 Grenland 2

MBT 2,5 14 4,8 2,5

DBT 2,5 2,5 11 2,5

TBT 12 6,8 21 12

MFT 2,5 2,5 2,5 2,5 DFT 2,5 2,5 2,5 2,5 TFT 3,8 2,5 2,5 2,5

Tabell 5 Organotiner i sedimenter. Medianverdier av tre målinger.

3.7.6 Metaller i sediment

Median Elle Solbergstr

and Grenland

1 Grenland

2

Kadmium 0,1 0,1 2,5 2,3

Kobber 24,4 35,7 58,8 54,7

Kvikksølv 0,205 0,24 3,11 3,68

Bly 38 66,1 145 159

Tabell 6 Metaller i sediment. Medianverdier av tre målinger. Benevningen er i µg/g

3.7.7 Metaller i A. marina

Median Nullprøve Elle Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2 Kadmium 0,077 0,048 0,048 0,032 0,046

Kobber 1,95 0,62 0,71 0,55 0,64

Kvikksølv 0,08 0,036 0,031 0,028 0,032

Bly 1,365 0,41 0,46 0,39 0,6

Tabell 7 Metaller i A. marina. Medianverdier av tre målinger. Benevningen er i µg/g.

3.8 Kornfordeling og totalt innhold av karbon (TOC)

Kornfordelingen og TOC ble gjort på NIVA med fremgangsmåte som beskrevet i Grung og Ruus et al.(2009).

“Determination of total organic content (TOC) and particle distribution of the sediment was performed in eight and four aliquots taken from this sediment (approx. 50 g) respectively. The organic content of the sediment was determined after

combustion at 1800 _C in a Carlo Erba 1106 elemental analyser (Thermo Electron Corp., Milan, Italy). TOC was determined by acidification to remove inorganic carbon and reanalyses of the remaining total carbon. Particle size distribution in the sediment was measured using sieving and a Sedigraph for particles smaller than 63 mm.”

Fraksjon Elle Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2

>0,063mm 56,54 3,12 9,893801275 9,78 0,063 - 0,032 1,09 1,45 4,951332664 4,51 0,032 - 0,016 3,7 3,4 14,86301452 18,49 0,016 - 0,008 6,08 8,74 17,12919429 28,83 0,008 - 0,004 7,17 11,64 18,05730588 10,39 0,004 - 0,002 7,17 15,98 11,25876657 6,78 0,002 - 0,001 6,52 17,43 8,555580613 5,88

<0,001 11,73 38,23 15,29100419 15,35 TOC µg C/mg

tørrstoff 12,6 21,7 40,8 45,3

Tabell 8 Oversikt over kornstørrelsene og TOC i de ulike behandlingene. Tallene er medianverdier mellom to resultater.

3.9 Cellular Energy Allocation

For å få oversikt over hvordan de ulike behandlingene har hatt innvirkning på den enkelte marks energibudsjett, har analysemetoden Cellular Energy Allocation (CEA) (DeCoen 1999) blitt brukt. Prinsippet bak denne metoden er å finne tilgjengelig energi ved å måle total mengde proteiner, karbohydrater og fettstoffer, og finne forbrukt energi ved å måle respirasjon. Alle kjemikalier brukt i CEA analysen kom fra Sigma – Aldrich, med mindre annet er nevnt (se detaljer i vedlegg).

3.9.1 Homogenisering

Prøver ble tatt opp fra -80 ºC fryser og lagt til tining på is. Så ble de fordelt til hver sine merkede homogeniseringsrør, tilsatt homogeniseringsbuffer (0,4 M MgSO4, 15

% polyvinylpyrrolidone (PVP) og 0,2 % (w/v) Triton X – 100 i 0,1 M Trizma

HCl/base buffer pH 7,5 v/25 ºC). For å få nok homogenat til de fire forskjellige analysene ble hver prøve fortynnet 11 ganger med homogeniseringsbuffer i forhold til markvekten. Siden CEA skulle måles individuelt for hver mark ble hver mark ble homogenisert for seg.

En pistill festet til en drill på et stativ ble ført opp og ned ti ganger i hvert homogeniseringsrør for å sikre at prøven var tilstrekkelig homogen.

Homogenisringsrøret sto i en kolbe med isvann under homogeniseringen, og for å hindre overføring av markvev mellom prøvene ble pistillen tørket nøye og skylt med destillert vann mellom hver prøve. For å bevare elektrontransportaktiviteten (ETS -aktiviteten) ble alt arbeid med prøver gjort på is eller i isvann, og alle løsninger som ble brukt var kalde (Gomez, Torres et al. 1996).

Etter homogeniseringen ble homogenatet ført over til tre merkede eppendorfrør; 200 μL for analyse av lipider, 300 μL for analyse av proteiner og karbohydrater og resten ble brukt til ETS analyser. Alle prøvene ble godt blandet med en vortexer før

fordelingen. Eppendorfrørene med prøve til karbohydrat, protein og fettstoffer ble stående på is, mens en ren og tørr mikrotiterplate med flat bunn ble klargjort for respirasjonsanalysen.

3.9.2 Energi forbrukt

Ved å måle ETS-aktiviteten på mitokondrienivå vil man få et mål på energiforbruket.

ETS-aktiviteten ble målt i følge prosedyren til King og Packard (1975) med modifikasjoner som beskrevet av De Coen og Janssen (1997).

I hver brønn ble det tilsatt 50 μL prøvehomogenat, 100 μL buffered substrate solution (BSS: 0,1 M Trizma HCl/base buffer pH 7,5 v/25 ºC, 0,3 % Triton X – 100), 50 μL NAD(P)H løsning (1,17 mM NADH og 250 μM NADPH) og reaksjonen ble startet ved tilsetting av 100 μL 2-(4-iodophenyl)-3(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride (INT: 4 mg/mL) (se vedlegg for platelayout). For å unngå bobler ble det brukt baklengspipettering hvor det trekkes opp mer volum enn det som trengs, for så å trykke ut korrekt volum. Det ble laget fire replikater for hver prøve. Platen ble ristet

i plateleseren som var innstilt på kinetisk analyse hvor absorbansen ble målt hvert 15.

sekund i ti minutter ved 20 ºC og med bølgelengden 490 nm.

Referanseprøve ble laget av homogenatrester fra fire prøver som ble blandet godt, fordelt i eppendorfrør, frosset og tatt opp før hver analyse.

3.9.3 Energi tilgjengelig

I hver analyserunde ble det laget en standardrekke av på forhånd tillagede standarder for både protein og karbohydrater. Gammaglobulin fra kveg (fra Bio-Rad) ble løst i ionefritt vann og fortynnet til konsentrasjonen til den høyeste standarden, 1,47

mg/mL. Deretter ble det pipettert ut 200 μL i eppendorfrør som ble lagret ved -80 ºC.

Den samme prosedyren ble gjentatt ved tillagning av karbohydratstandard. Glykogen fra kveglever (Sigma-Aldrich) ble løst i 1 mL ionefritt vann og fortynnet til 1,5 mg/mL, før løsningen ble fordelt i eppendorfrør med 360 μL karbohydratstandard i hver og frosset ned. Det ble også laget referanseprøver etter samme beskrivelse som referanseprøvene laget til ETS analysene (kapittel 3.9.2). Referanseprøvene ble behandlet på nøyaktig samme måte som prøvene og kommer til å omtales som prøve videre i dette kapittelet.

Analysemetoden for totalt innhold av proteiner bygger på metode utviklet av O.H.

Lowry, et al. (1951) mens analysen for totalt innhold av karbohydrater følger metode beskrevet av W. De Coen og C. Janssen (1997).

Varmeplaten ble slått på 60 ºC mens prøver og standarder tinte på is. Etter prøvene hadde tint ble de blandet godt med en vortexer, tilsatt 100 μL 15% trichloroacetic acid (TCA), blandet igjen og sentrifugert ved 13000 runder per minutt (rpm) i fem minutter. Supernatanten ble overført til nye eppendorfrør. Pelleten ble vasket på nytt med 100 μL 5% TCA, blandet og sentrifugert ved 13000 rpm i fem minutter. Den nye supernatanten ble pipettert opp og overført til supernatanten fra første

sentrifugeringsrunde.

Videre ble pelleten brukt til analyse av proteininnhold og supernatanten til analyse av karbohydratinnhold.

500 μL lutløsning ble tilsatt pelleten før den ble blandet godt med vortexer og satt på varmeplate i 30 minutter. Da pelleten var løst, ble den blandet og nøytralisert med 300 μL saltsyreløsning. Av proteinstandarden ble det laget en standardrekke, hvor standardene hadde følgende konsentrasjoner av gammaglobulin: 0 mg/mL, 0,092 mg/mL, 0,184 mg/mL, 0,368 mg/mL, 0,735 mg/mL og 1,477 mg/mL.

Standardrekken ble laget ved å fortynne 50 % med destillert vann mellom hvert steg fra standard seks til standard to.

I hver brønn i mikrotiterplaten ble det pipettert i 10 μL blank/standard/prøve, 25 μL reagens A (basisk kobbertartratløsning, Bio-Rad) og 200 μL reagens B (fortynnet folinreagens, Bio-Rad). Det ble laget tre replikater av hver blank/standard/prøve. Alle reagensene hadde romtemperatur. Platen ble mikset forsiktig for hånd og inkubert i 15 minutter før absorbansen ble lest ved 750 nm.

En standardrekke for karbohydrater ble laget av karbohydratstandarden og destillert vann. Fremgangsmåten var den samme som for proteinstandardrekken og standardene hadde følgende konsentrasjon av glykogen: 0 mg/mL, 0,188 mg/mL, 0,375 mg/mL, 0,75 mg/mL og 1,5 mg/mL.

Det ble laget triplikater med 50 μL blank/standard/prøve (se vedlegg for platelayout), og i alle brønnene ble det pipettert 50 μL fenol og 200 μL svovelsyre, i nøyaktig den rekkefølgen. Mikrotiterplaten ble inkubert i avtrekkskap i 30 minutter før

absorbansen ble målt ved 490 nm. .

Fettstoffer

Totalt innhold av fettstoffer ble analysert i følge prinsippene til Bligh og Dyer (1959).

Alt arbeidet i denne analysen ble utført i avtrekkskap.

Ved tillagning av standard ble tripalmitin benyttet. Tripalmitin ble løst i kloroform og fortynnet til løsningen hadde en konsentrasjon på 3 mg/mL. Kloroform har særdeles volatile egenskaper og for å unngå at standarden fikk en høyere konsentrasjon på

grunn av fordampning, ble løsningen oppbevart på flaske med tett lokk i -20 ºC. Den ble også veid etter bruk og før neste bruk, for å sikre at det ikke hadde fordampet store mengder kloroform.

Prøver ble tint på is, tilsatt 500 μL kloroform og blandet godt. Deretter ble de tilsatt 500 μL metanol og 250 μL destillert vann, blandet med vortexer og sentrifugert ved 13000 rpm i fem minutter. Etter sentrifugering hadde løsningen fått to faser, en upolar kloroformfase hvor fettstoffeneet var løst og en polar fase på toppen. 100 μL av bunnfasen ble pipettert ut i et glassrør hvor det på forhånd var pipettert i 500 μL svovelsyre. For å unngå sotpartikler i prøvene ble all pipettering og blanding av prøver gjort svært forsiktig. Pipetteringen ble forsøkt gjort uten å sprute dråper på innsiden av glasset, og løsningene ble blandet sammen ved å pipettere opp og ned innholdet tre ganger. Standardrekken ble laget ved å ha følgende volumer av standard i svovelsyre i et totalvolum på 500 μL: 0 μL, 6,26 μL, 12,5 μL, 50 μL og 100 μL.

Glassrør med standarder og prøver ble forsiktig satt i et begerglass og ført raskt inn i ovn på 200 ºC. Etter 15 minutter ble de tatt ut og satt til avkjøling i avtrekkskap. Da prøvene var avkjølt ble de fortynnet med en mL destillert vann. Vannet ble tilsatt svært forsiktig for å unngå voldsomme utbrudd som kan komme når vann tilsettes sterk syre. Det ble brukt verneutstyr som nitrilhansker og labfrakk i tillegg til at fortynningen ble utført i avtrekkskap.

200 μL blank/standard/prøve ble pipettert i en mikrotiterplate og absorbansen målt ved 340 nm. Hver prøve og standard hadde fire replikater.

3.9.4 Beregning av CEA

Den cellulærere respirasjonsraten ble bestemt ved hjelp av ETS dataene. Basert på teorien om at for hver 2 μmol formazan som blir laget i elektronstransportsystemet, går det med ett μmol 02. Kvantiteten av O2 konsumert per dyr transformeres til energetiske ekvivalenter ved å bruke spesifikke oksyentalpiske ekvivalenter for en gjennomsnittlig fettstoff-, karbohydrat- og proteinblanding på 484 kJ/ mol O2

(Gnaiger 1983). Mengden formazan som ble laget ble kalkulert fra følgende formel:

ε= 15900/M.cm

De ulike energireservefraksjonene ble transformert til energetiske ekvivalenter ved å bruke energi fra forbrenning (Gnaiger 1983):

Tabell 9 Energiinnhold fra forbrenning for protein, glykogen og fettstoff.

Energireservefraksjon Energiinnhold fra forbrenning (mJ/mg)

Protein 24000

Glykogen 17500

Fettstoff 39500

Energi tilgjengelig ble kalkulert ved å integrere forandringen i proteiner, karbohydrater og fettstoffer over eksponeringsperioden. Det totale netto energibudsjettet ble kalkulert som følger:

CEA (mJ / g org) = (∫ Ea . dt - ∫ Ec∙dt) / t

3.9.5 Beregning av endring over tid

I tillegg til utregning av totalt innhold av tilgjengelig energi (som en helhet og splittet opp i totalt innhold av protein, karbohydrat, fettstoffer) og forbrukt energi, ble det regnet ut en endring over tid for alle de nevnte variablene. Median for 0-prøver, uke 1,2 og 4 ble regnet ut og brukt til å finne differansen mellom et

prøvetakningstidspunkt, t, og det neste, t+1 (mediant-enkeltobservasjont+1). Figurene som viser endring over tid egner seg ikke for statistikk, men er derimot en fin måte å illustrere trendene i figurene som viser totalt innhold av proteiner, karbohydrater, fettstoffer, Ea og Ec.

3.10 Total Oxyradical Scavenging Capacity (TOSC)

Total oxyradical scavenging capacity (TOSC) er en metode for å måle

antioksidantpotensialet til biologisk vev (Winston, Regoli et al. 1998). Tradisjonelt har studier på oksidativt stress bygget på analyser av spesifikke antioksidanter, men det er foreslått at antioksidanter virker bedre sammen enn enkeltvis (Wayner, Burton et al. 1987). Derfor er det nødvendig å ta alle antioksidantene i vevet med i

beregningen når et vevs evne til å binde opp frie radikaler skal kvantifiseres.

Ved termal homolyse av 2,2’ – azobis – amidinopropane (ABAP) vil

peroksyradikaler dannes. Peroksyradikalene oksiderer α – keto – γ – methiolbutyric acid (KMBA) til etylengass som kan måles kvantitativt ved hjelp av en

gasskromatograf. TOSC analysen kombinerer levende vev med systemet beskrevet ovenfor, og ser hvordan vevets antioksidanter påvirker mengden etylen ved å binde seg til peroksyradikaler. En kontroll uten vev gjør det mulig å regne ut TOSC - differansen mellom kontroll og prøve. Analysen inkluderer og en positiv kontroll, GSH. Mengde etylen registreres som kurver i et dataprogram.

Kvantifisering av TOSC:

TOSC = 100 – (∫ SA / ∫ CA x 100)

hvor integralet av SA er arealet under kurven definert av prøven og integralet av CA er definert av kontrollen. Kalkulasjonen er et tall mellom 0 og 100, hvor 0 vil si at det er ingen oppbinding av radikaler.

3.10.1 Homogenisering

Prøvene ble opparbeidet etter metoden beskrevet i kapittel 3.9.1 med noen

modifikasjoner: Alt arbeidet ble gjort på is med kald buffer. I denne analysen ble ikke markene homogenisert enkeltvis, derimot ble alle individene i hvert kar (foruten to til CEA) homogenisert sammen. Det ble tilsatt fire mL kaliumfosfatbuffer for hvert gram markvev. Homogenatet ble overført til sentrifugerør og sentrifugert på 20 000 rpm (50 000 g mener jeg) i to timer. I utgangspunktet skulle det blitt analysert for flere radikaler og derfor ble supernatanten pipettert i åtte eppendorfrør; et til

proteinkvantifisering (50 μL), seks til analyse av radikaler (100 μL) og ett samlerør for å senere ha mulighet til å lage referanseprøve og fortynningsrekke. De forberedte TOSC – prøvene ble lagret ved -80 ºC. Det ble derimot besluttet å kun fokusere på ett radikal - peroksyradikalet.

3.10.2 Fortynning

For å unngå at prøvene skulle ha lavere TOSC enn kontrollen eller høyere enn den positive kontrollen, ble det gjort et fortynningsforsøk med 5, 10, 20, 50 og 100 ganger fortynning av markhomogenat. For å få bredde i fortynningsprøven ble det valgt homogenat fra to ulike behandlinger.

3.10.3 TOSC analysen

De forberedte prøvene ble tint på is og fortynnet til korrekt fortynning (50 x) og kjemikaliene ble veid ut og fortynnet til riktig konsentrasjon (se tabell). Alle løsninger og prøver sto hele tiden på is og alle fortynninger ble gjort med TOSC – buffer (100 mM KH2PO4, pH 7,4, 2,5 % NaCl), bortsett fra fortynning av KMBA som ble gjort med destillert vann.

Tabell 10 Innhold i de ulike glassene til TOSC analyse.

Kjemikalie /

Glass Kontrol

l GSH Prøve

Buffer 800μL 730μL 700μL

GSH (15mM) 0 70μL 0

Prøve 0 0 100μL

KMBA (2mM) 100μL 100μL 100μL ABAP (200mM) 100μL 100μL 100μL

I forkant av analysen ble det laget en referanseprøve av tre prøver. Prøvene ble blandet og fortynnet 50 ganger før de ble overført til eppendorfrør og frosset ned.

I hver analyserunde ble det analysert fire kontroller (blank), to positive kontroller (GSH), to referanseprøver (ref) og 14 prøver i følgende rekkefølge: Blank, GSH, ref, 1, 2, 3, 4, 5, blank, 6, 7, 8, 9, 10, blank, 11, 12, 13, 14, ref, GSH, blank.

Septum ble skiftet før hver analysekjøring, samtidig med at programvare og varmebad ble startet. Stoppeklokke ble startet ved tilsetting av ABAP (100 μL) og KMBA (100 μL) til første kontroll. Kontrollen ble så korket og ristet forsiktig før den ble satt i varmebad på 35 ºC. Prosedyren ble gjentatt nøyaktig hvert halve minutt til alle glassene var i varmebad. Mengden etylengass etter 12 minutter var for liten til at programmet greide å regne ut arealet under kurvene, derfor ble den første runden med gassinjisering alltid hoppet over. Gassen ble injiser i en Hewlett Packard 5890 series II gas chromatograph (GC). Etter injisering vil det alltid være igjen litt gass fra forrige prøve, derfor ble sprøyta tømt ved å trekke den opp og ned et par ganger, mens sprøyta sto i glasset. For å få helt korrekt volum på 200 μL gass, ble det trukket opp til 250 μL og så ned til 200 μL. Det ble kjørt fire runder á 12 minutter per runde.

3.10.4 Proteinanalyse

Den spesifikke TOSC – verdien ble beregnet ved å dele den eksperimentelle TOSC – verdien på mengden protein (i gram) brukt i analysen. Derfor ble prøvehomogenatet også analysert for total mengde proteiner

Standardrekke ble preparert på samme måte som beskrevet i kapittel 3.9.3, foruten at gammaglobulinet ble løst og fortynnet i 0,1 M Triz buffer, pH 8,0 i stedet for

destillert vann. Det ble og laget en referanseprøve.

10 μL blank/standard/prøve ble pipettert i en ren og tørr mikrotiterplate, før det ble tilsatt 25 μL reagens A og 200 μL reagens B. Platen ble ristet forsiktig for hånd, hvilt 15 minutter i romtemperatur og absorbansen lest ved 750 nm.

3.11 Beregning av overlevelse og biomasseforandring

Overlevelse ble beregnet ved å trekke antall mark funnet ved prøvetakningspunktet fra antallet som ble lagt i karet før ved dag en.

Endring i biomasse ble funnet ved å trekke biomasse veid ved starten (BSTART) av forsøket fra biomassen målt ved prøvetakningstidspunkt (BSLUTT). Det ble tatt høyde for dødelighet ved at BSTART ble beregnet ut fra gjennomsnittsvekta ved start

multiplisert med antall mark som ble funnet ved prøvetakningstidspunktet. BSLUTT ble funnet ved å multiplisere gjennomsnittsvekta for alle markene i ett kar med antall mark funnet ved prøvetakningstidspunktet.

3.12 Statistiske analyser

Programvaren brukt til å utføre de statistiske analysene var Statistica® (versjon 7, Statsoft Inc.). Boksplott ble laget for alle de avhengige variablene. Det er laget boksplott som viser endring over tid, fra et prøvetakningstidspunkt til det neste.

Disse figurene egner seg ikke for statistikk, men er derimot en fin måte å illustrere trender i datasettet.

I utgangspunktet skulle de uavhengige variablene tid, uke og replikat analyseres med nøstet ANOVA. Residualene ble inspisert for trender og Levene’s test ble brukt for å sjekke for homogenitet i variansen. Selv etter logtransformering av flere avhengige variabler, var det trender i residualene og Levene’s test var signifikant for flere av de uavhengige variablene. For å få en helhetlig oversikt over de statistiske analysene, ble det valgt å bruke den ikke-parametriske analysen Kruskal-Wallis på hele datasettet.

Post-hoc testing ble brukt ved å bruke multippel (”two tailed”) sammenlikning av p- verdier.

Signifikansnivå for å forkaste H0: “ingen forskjell mellom grupper” ble satt til p<0,05

4. Resultater

4.1 Unnvikelsesadferd, dødelighet og biomasseforandring

4.1.1 Unnvikelsesadferd

Det var ingen forskjell i unnvikelsesadferd (Figur 4).

Elle

Solbergstrand

Grenland 1

Grenland 2 0

10 20 30 40

Tid (min)

Figur 4. Unnvikelsesadferd beskrevet ved nedgravningstid. Median, kvartiler (boks), minimum og maksimum (linjer) er presentert.

4.1.2 Dødelighet

Det var 100% dødelighet i organismene i sedimentet fra Solbergstrand uke 8 (Figur 5). I samme uke hadde det økt med en mark i karet med sediment fra Elle. Dette kan skyldes en feil når forsøket ble startet opp og mark som skulle vært i

Solbergstrandkaret kom i Ellekaret. Det er ellers vanskelig å finne noen tendenser i dødelighet, foruten at det var en noe høyere dødelighet i uke 4

Uke 1 Uke 2 Uke 4 Uke 8 -50%

0%

50%

100% Elle

Solbergstrand Grenland 2 Grenland 1

Dødelighet

Figur 5. Dødelighet i prosent i de ulike behandlingene, beregnet mellom tid 0 og prøvetakning. Median, kvartiler (boks), minimum og maksimum (linjer) er presentert

4.1.3 Biomasseendring

Uke 1 Uke 2 Uke 4 Uke 8 -100%

-50%

0%

50% Elle

Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2

Endring i biomasse

Figur 6. Biomasseendring, kalkulert ved å finne endring i prosent mellom markvekter ved tid 0 og ved prøvetakning. Median, kvartiler (boks), minimum og maksimum (linjer) er presentert.

4.2 Cellular Energy Allocation

4.2.1 Energi forbrukt

Parameterne som presenteres er cellulær respirasjon (se Figur 7a og b) og endring i cellulær respirasjon over tid (Figur 8), fra et prøvetidspunkt til det neste. Cellulær respirasjon oppgis i kJ/g våtvekt og er et mål på hvor mye energi organismen har brukt fra dag 0 til det aktuelle prøvetakningstidspunktet. Endring i cellulær

respirasjon gir et estimat på hvor mye mer, eller mindre, organismen respirerer fra et prøvetakningstidspunkt til det neste. Merk at figur 6a har logtransformert y-akse for å få med de lave verdiene for nullprøvene. I figur 6b er det linjære akser og

nullprøvene er tatt vekk for å ha mulighet til å vise forskjell mellom de resterende behandlingene.

I uke 2 var det signifikante forskjeller (p<0,001) i den cellulære respirasjonen.

Organismer eksponert for sediment fra Elle hadde signifikant lavere cellulær

respirasjon enn mark eksponert for sediment fra Solbergstrand (p<0,001) og Grenland 1 (p=0,005). I uke 4 ble det og funnet signifikante forskjeller i cellulær respirasjon, hvor mark fra Grenland 1 hadde en signifikant (p=0,018) lavere cellulær respirasjon enn mark fra Grenland 2. I uke 8 hadde organismer fra Grenland 2 en signifikant høyere respirasjon enn organismene fra både Elle (P=0,029) og Grenland 1 (p=0,022).

Det var en del signifikante forskjeller mellom de ulike prøvetakningstidene. For mark fra Elle var det signifikante (p<0,001) forskjeller mellom flere av

prøvetakningstidspunktene. Organismer tatt ut i uke 4 og uke 8 hadde en signifikant høyere respirasjon enn 0-prøvene tatt ut ved dag 1, med en p- verdi på henholdsvis 0,016 og 0. Uke 4 og 8 hadde og høyere respirasjon enn uke 2, med p-verdi på henholdsvis 0,018 og <0,001. Organismer fra uke 1 hadde og signifikant (p=0,018) lavere respirasjon enn mark tatt ut ved uke 8.

For Solbergstrand var det lik trend; uke 2,4 og 8 hadde en signifikant (p<0,001) økning i respirasjon i forhold til 0-prøvene (p-verdi på henholdsvis 0,013, 0,047 og

<0,001). Det var også en signifikant (p=0,001) økning fra uke 1 til uke 8.

Trenden gjentok seg for Grenland 1 og 2 organismene. Organismer fra uke 8, Grenland 1 hadde signifikant (p<0,001) høyere cellulær respirasjon enn både nullprøvene (p<0,001) og uke 1 (p=0,011). I Grenland 2 hadde organismene en signifikant (p<0,001) høyere cellulær respirasjon i uke 8 enn i uke 1 og uke 2, med p- verdier på henholdsvis 0,027 og 0,001.

0 Uke 1 Uke 2 Uke 4 Uke 8 1

10 100 1000 10000

100000 Elle

Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2 0

Ec (kJ/g våtvekt)

Figur 7a Cellulær respirasjon, målt i kJ/g våtvekt. Median, kvartiler, 10- og 90 persentiler er presentert. Merk logtransformert Y-akse, for å få med verdiene for dag 0. n=4

Uke 1 Uke 2 Uke 4 Uke 8 0

50000 100000 150000 200000

250000 Elle

Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2

Ec (kJ/g våtvekt)

Figur 7b. Cellulær respirasjon, målt i kJ/g våtvekt. Median, kvartiler, 10- og 90 persentiler er presentert. n=4

I figuren under presenteres endring i cellulær respirasjon over tid. Trenden for de fleste organismer var at den cellulære respirasjonen økte fra uke 1-2 og utover.

Organismene fra kontrollsedimentet Elle hadde en mindre økning i cellulær

respirasjon og hadde til og med en avtagende respirasjon fra uke 1 til uke 2. Marken fra det andre kontrollsedimentet, Solbergstrand, hadde en forholdsvis lik utvikling, sett bort fra endringen mellom uke 1 og 2, hvor organismene hadde en større økning i cellulær respirasjon enn de resterende behandlingene. Dette var også da den eneste gruppen som ikke økte i respirasjon mellom uke 2 og 4. Endringen i den cellulære respirasjonen i mark fra Grenland 1 var relativ stabil over alle tidspunktene, bortsett fra en økning fra 4 til 8 uker. Grenland 2 hadde de høyeste respirasjonsverdiene av alle behandlingene i uke 4 og 8.

 0-1  1-2  2-4  4-8 -250000

-200000 -150000 -100000 -50000 0 50000

Elle

Solbergstrand Grenland 1 Grenland 2

Ec (kJ/g våtvekt)

Figur 8. Endring i cellulær respirasjon, målt i kJ/g våtvekt. Median, kvartiler, 10- og 90 persentiler er presentert.

4.2.2 Energi tilgjengelig

Figuren under (Figur 9) presenterer totalt proteininnhold i markene i de ulike behandlingene ved de forskjellige prøvetakningstidspunktene.