C OMUNIDADES M ICROBIANAS
EN LA D ETERMINACIÓN DE LA C ALIDAD DE A GUAS
MARGARITA GOMILA RIBAS
UIB
Universitat de les Illes BalearsDIRECTOR: Jorge Lalucat Jo
Departamento de Biología. Área de Microbiologia Universitat de les Illes Balears
Intitut Mediterrani d’Estudis Avançats (IMEDEA) (CSIC-UIB)
T E S I S D O C T O R A L
C OMUNIDADES M ICROBIANAS
EN LA D ETERMINACIÓN DE LA C ALIDAD DE A GUAS
UIB
Universitat de les Illes BalearsTesis doctoral presentada por Margarita Gomila Ribas para optar al título de Doctora en Ciencias Biológicas de la
Universitat de les Illes Balears, bajo la dirección del Dr. Jorge Lalucat Jo
Vº Bº Director de la tesis El doctorando
PROGRAMADEDOCTORADO: Microbiología ambiental y Biotecnología
DR. JORGE LALUCAT JO Catedrático de Microbiología Universitat de les Illes Balears
PALMA, MARZO 2007
MARGARITA GOMILA RIBAS
A na Carla i en Toni.
A la meva familia.
Als meus amics.
i TABLE OF CONTENTS
ACKNOWLEDGMENTS ………. 1
PREFACE ………. 7
SECTION A.HAEMODIALYSIS WATER
CHAPTER 1
General introduction ……….. 11
CHAPTER 2
Identification of culturable bacteria present in haemodialysis water
and fluid ………. 21
CHAPTER 3
A molecular microbial ecology approach to studying haemodialysis
water and fluid ………... 45
CHAPTER 4
Diversity of environmental Mycobacterium isolates from haemodialysis
water as shown by a multigene sequencing approach ……… 65
CHAPTER 5
Description of Pelomonas aquatica, sp. nov., and Pelomonas puraquae,
sp. nov., isolated from industrial and haemodialysis water ………... 95
CHAPTER 6
Description of two new Roseateles species, R. terrae sp. nov., and
R. aquatilis sp. nov., in the family Comamonadaceae ……….. 113
CHAPTER 7
Experimental biofilms formed by bacteria isolated from haemodialysis
water and effect of chlorination treatments ……… 129
SECTION B.REGENERATED WATERS
CHAPTER 8
General introduction ………... 195
CHAPTER 9
Comparative reduction of bacterial indicators, bacteriophages infecting enteric bacteria and enteroviruses in wastewater tertiary treatments
by lagooning and UV-radiation ……….. 201
GENERAL CONCLUSIONS ………. 241
REFERENCES ………... 247
Acknowledgments
1 AGRAÏMENTS
Per fi he arribat a aquest punt! Tenia tantes ganes! Arribar a escriure els agraïments era una cosa amb la que duia pensant fa molt de temps. Tinc tantes coses per agrair que de fet al llarg dels anys m’he anat fent una llista per no deixar-me ningú. Em poso a pensar i ja fa sis anys, per no dir set que estic en aquest laboratori. Crec que d’ençà en Peque ningú havia estat tant d’anys fent la tesi. Set anys en els que m’han passat moltíssimes coses i he viscut moltes experiències, que malgrat algunes no han estat del tot bones, en general m’han fet gaudir d’aquests anys. M’han donat l’oportunitat de viatjar molt i conèixer molts de llocs, de conèixer molta gent, gent de pas i gent amb les que he compartit tots aquests anys, i sobretot m’han donat l’oportunitat d’aprendre molt, i no només científicament parlant, sinó també personalment.
En primer lloc vull donar-li les gràcies al meu director de Tesi, en Jordi Lalucat.
Gran part d’aquesta tesi la pot considerar seva. He d’agrair-li moltes coses però sobretot tot el que m’ha ensenyat i la confiança que sempre, en tot moment, ha dipositat en jo, sense qüestionar-me res del que he fet, no sempre encertat. Professionalment, li he d’agrair el seu caire científic, la seva capacitat per connectar idees, per sempre veure més enllà i no quedar-se en les coses obvies, i aquesta passió per la feina que té que és contagiosa; i personalment, el seu caire humà, tenir sempre un segon per escoltar-me encara que vagi de bòlit, la paciència i trobar sempre el que dir-te en tot moment.
A n’Elena García-Valdés, tothom sempre li acaba agraint el fet de que és una
“mami”, i és ben cert. Gràcies pels suggeriments i consells que m’has donat en tot moment, i sobretot, aquestes darreres presses que m’has donat al final perquè acabés la tesi han estat l’estímul necessari per no adormir-me pel camí. Moltes gràcies per haver- me obert les portes d’aquest laboratori ben al principi quan vaig començar com alumna col·laboradora. Si no hagués estat gràcies a tu, aquesta tesi no seria aquí.
A en Rafa Bosch, a en Toni Bennassar, en Ramon Rosselló, i en Sebastià Albertí, la resta de “jefes” de l’àrea. Moltes gràcies a tots per tot, per ajudar-me sempre que he tingut qualsevol dubte o he necessitat res. Sobretot gràcies Toni pel teu ajut als
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meus inicis, que com tu ja saps varen ser difícils i amb moltes dubtes. I gràcies Ramon, per la teva ajuda tant amb la hibridació DNA-DNA, amb els meus inicis a l’ARB i amb el suport tècnic del FISH (és una llàstima que no sortís). També vull fer una menció especial a en Javier Benedí, que malgrat ja no hi és, al seu moment em va recolzar. I no em podia oblidar, de na Balbina Nogales, una altra “jefa”, però que per jo mereix estar a un lloc diferent. La meva relació amb ella malgrat sovint és professional és més de caràcter personal. Moltes gràcies per ajudar-me en tot moment, amb qualsevol dubte i circumstància, deixant de banda a vegades la teva feina. Per la paciència que has tingut, per sempre animar-me en tot i per escoltar-me.
Gràcies també a en Joan Gascó per haver-me introduït a aquest apassionant món que són les aigües de diàlisis, per les seves discussions a l’hora d’elaborar els articles i qualsevol treball, i per estar dispost en tot moment sempre que l’he necessitat. Part del meu tema de tesi, també li he d’agrair a en Pepe Gil, que ens va posar en contacte amb en Joan i em va ajudar amb l’obtenció dels aïllaments. A n’Antonio Ramirez, gràcies pel seu ajut amb el fenotip dels Micobacteris.
A tot el personal que treballa a altres instal·lacions que en algun moment he fet servir per desenvolupar la meva feina, a la gent de l’àrea de Biologia Cel·lular, a en Ferran dels Serveis Científico Tècnics de la UIB pel seu ajut amb el microscopi, als Serveis de Seqüenciació de Madrid i de la Universitat, que en tot moment m’han ajudat.
D’una manera molt especial vull donar les gràcies a tots els llocs on he estat realitzant estàncies breus al llarg de la meva tesi, a més de ser dels moments on més feina he fet de tota la meva època de doctorat, han estat de les experiències que més m’han fet aprendre, sobretot de jo mateixa: supervivència, paciència, el valor de l’amistat,...
A la gent de Microbiologia de la Universitat de Barcelona, al Joan Jofre, al Francisco Lucena, a la Maite Muniesa, a la Laura Mocé-Llivina, al Michel Montemayor, l’Ana Costan, l’Andrey Payàn, la Cristina Valdivieso, la Susana, i tot un seguit de gent que vaig conèixer allà i segur que em deixo. Moltes gràcies per haver fet la meva estada al vostre laboratori tan agradable, i és clar que, gràcies per ensenyar-me totes les tècniques per caracteritzar les aigües de depuradora.
Acknowledgments
3 També vull agrair al Prof. Botho Bowien la meva estada a l’Institut für Mikrobiologie und Genetik, Georg-August-Universität Göttingen. Vielen Dank für Ihr Hilfsmittel, Ihren Rat und wissenschaftlichen Diskussionen. Danke auch zu den Laborleuten: Gertrud Stähtlut, Caroline Holfe und Bernard Kussian. D’una manera molt especial vull donar les gràcies a en Marco, el meu àngel de la guarda en aquell país.
Pràcticament puc dir que em va salvar la vida a un moment “crític”. ¿No te parece, Marquiten? Grazie di tutto. Mille grazie per la tua compagnia quotidiana, per il tuo appoggio continuo, per avermi tenuto per mano quando ne ho avuto bisogno e per aver fatto in modo che la mia permanenza fosse cosi’ piacevole. Ti voglio bene!
Also thanks to Prof. Hilary Lappin-Scott and Dr. Sara Burton from the School of Biosciences, University of Exeter, for their help in getting me started in the world of biofilms, for their advice, their encouragement, their support and overall for their discussions. Many thanks to Peter Splatt for his technical support, to answer in all the moments all questions that I had; and on the personal aspect, for trying to obtain a smile from me in every moment. Also I wish to thank everyone in B2 lab: Natasha, Alvine, Mushtaba, Nicola, Merry, Max, Ed, Faith, for their friendship and for making me feel like at home.
El fet d’haver estat tant d’anys al laboratori m’ha donat peu a conèixer molta gent, gent de pas i gent amb la que he compartit més temps, amb els que he compartit bons i mals moments, com na Diana (la meva primera companya de “poyata” amb la que varem compartir els inicis), na Maria Barceló, en Juan Ramon, na Mercedes, na Paqui, na Caterina, en Peque, n’Aina, na Silvia Murialdo, na Bea, na Patricia, na Maria Valens, na Marcela, na Meris-Mers, na Mercè, en Joan, na Maria Magdalena, na Susana Vázquez, na Nona, en Lluis, n’Amparo, na Jocelyn, n’Ana Belen, en Roberto, na Maricel, na Vanesa, en Winfred, en Darek, na Xiomara... i d’altra gent que segur que m’estic deixant. Tots ells en menor o major mesura han estat importants en aquests anys contribuint a les rialles, als moments divertits i agradables que he passat.
Dins tota aquesta gent que he anat coneixent voldria mencionar molt especialment al grup de la “Comunitat Valenciana”. A en Fernando i n’Arantxa d’Alacant, que malgrat varem compartir poc temps, varem establir una relació personal prou forta que s’ha anat mantenint amb els anys. A n’Arantxa especialment li vull agrair
Acknowledgments
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l’ajut amb l’ARB i els seus consells amb els meus primers arbres per evitar les “ramas extrasensoriales”. Amb ells he compartit més d’un vespre de xerrameca amb el
“Baileys” i el cigarro a la mà, sense deixar cap fil sense tocar. I en Javi de València, el meu company de mostrejos, que he de reconèixer que en un primer moment vaig pensar que vaja “xulo” que ens havia tocat i varem acabar passant dos anys genials, rient com a nins. Si recordo segons quins episodis no puc aturar de riure. Tenies raó, hauries d’haver decidit “muerte” en el moment en que et vaig demanar molt correctament si em podies ajudar. Encara que tu et venjares torturant-me amb la música de “Mago de Oz”.
Quins moments que hem passat!
Finalment, un dels agraïments més especials és cap a la gent que hi ha ara al laboratori amb la que he passat pràcticament els darrers dos anys, per no dir més, i jo crec que ni ells són conscients de quan importants són per jo. Amb els que he compartit els bons i els mals moments, amb qui he anat vivint el dia a dia. No saben quan important ha estat el seu recolzament en aquest darrer temps, intentant animar-me constantment de que jo podia. Moltes gràcies a tots. A na Cèlia, una persona bona que he trigat una mica en descobrir, amb la que he tingut alguns problemes logístics al llarg d’aquest temps, però que per jo no han tingut cap importància. A en Joseph, com diuen el meu preferit dins el laboratori, per ventura és cert, però encara que tingui les seves coses és un sol d’al·lot. A na Mar, l’alegria personificada, inventora de paraules. Na Zoyla, la més silenciosa de tots que passa súper desapercebuda però és un encant, gràcies per ajudar-me en moltes coses. Na Magda, tot un cas, però una persona magnífica amb molt bon fons. Na Cris, una de les ànimes nobles del laboratori, a la que he recorregut moltes vegades perquè m’escoltés. I els nous, na Claudia una bellíssima persona i en Pau, que malgrat acaba d’arribar és un torbelli d’energia que ens ha revolucionat a tots, encara que s’ha de reconèixer que a vegades conta acudits de pena. I no puc deixar de banda dues persones molt i molt especials, crec que ses dues amigues més cabres loques que tinc, i és difícil: na Mariana i na Micaela. Gràcies Miki per aquests vespres de confidències, segueixo pensant que tens el mèrit de ser l’única persona que em fa discutir. I tu, Mariana, simplement gràcies per ser com ets, per transmetre aquesta energia que tens, per mimar-me, donar-me besos, escoltar-me, abraçar-me,.. i tot un seguit de coses que no sé com dir-te.
Acknowledgments
5 Als meus amics que vaig conèixer durant l’època que vaig fer la carrera, ja fa deu anys, que han estat a devora, i a vegades crivellant-me amb la típica pregunta de quan acabaré. En Vicent, en Gabi, en Momo, en Roberto, en Raúl, en Víctor, en Toni. I les meves amigues del “dinar de marujas” un pic al mes, n’Eva i n’Ester. A en Dani per la seva paciència davant totes les meves preguntes i la seva ajuda maquetant. A en Vaughan, realment l’artifici de que fes la tesi i m’estimulés a que seguís per aquest camí.
En David i na Cati persones claus a la meva vida de fa molts d’anys, que sempre m’han escoltat i recolzat faci el que faci. Moltes gràcies per estimar-me.
A la meva família, als meus pares, al meu padrí, la meva germana, i en Toni, que han estat en tot moment pendents de jo i del que necessitava. I sobretot a na Carla, que no arriba a l’any però cada cosa que fa em dóna un milió de satisfaccions i és una part clau de la meva vida que no em deixa caure a la locura.
A en Toni, la persona que ha estat darrera jo en els darrers tres anys, recolzant- me incondicionalment en tot, animant-me i dient-me el que valia. El meu amic i parella, pendent de jo en tot moment sense importar on estigués, aguantant els meus atacs, les meves crisis, els meus plors, nervis i mals humors. Ha estat simplement estimant-me.
Molta part de la tesis és teva. Gràcies.
Cada un de vosaltres té una part d’aquesta tesi.
A tots moltes gràcies!!!
L’elaboració d’aquesta tesi ha estat possible gràcies a una beca FPI del “Ministerio de Educación y Ciencia” associada a projecte (REN2002-04035-C03-01) durant el període 2003-2007.
Preface
7 PRÓLOGO
En 1977, Bradley estableció cuatro categorías para agrupar las distintas infecciones relacionadas con el agua. Las dos que tienen una mayor incidencia en nuestro entorno son aquellas en las que el agua es únicamente el vehículo de transmisión (“water-borne infections”) y las infecciones causadas por microorganismos propios del hábitat acuático (“water-based infections”). El primer grupo comprende los microorganismos entéricos que llegan a las aguas por contaminación fecal y la transmisión se da por la ingestión del agua contaminada. En estos casos la transmisión depende de varios factores, como son: la concentración de patógenos presentes, su capacidad de supervivencia en las aguas, la dosis infecciosa del patógeno en particular, y la ingestión por los individuos susceptibles. El control de estas infecciones se consigue mediante la monitorización y mejora de la calidad microbiológica de las aguas. En el segundo grupo los patógenos desarrollan una parte de su ciclo vital en el agua, y pueden ser ingeridos, pero la infección puede provenir también por contacto o por inhalación. En este grupo se incluyen algunas especies de Mycobacterium, Pseudomonas, Legionella, Staphylococcus, etc. (Dufour, 1986). Algunos de los microorganismos potencialmente patógenos, no producen directamente una infección, sino que su acción se basa en la producción de toxinas, como las cianotoxinas de algunas cianobacterias, las endotoxinas, los esfingolípidos, u otros componentes celulares. De aquí se deduce la necesidad de un control de la calidad microbiológica del agua, y los niveles microbianos tolerables dependerán del uso que se vaya a hacer de estas aguas. La metodología analítica también dependerá del tipo de agua y de los microorganismos que se pretenda controlar.
En el estudio de las aguas, podemos aplicar un amplio espectro de metodologías según nuestras necesidades. Desde el análisis microbiológico convencional del agua, que incluye la detección y análisis de indicadores fecales de contaminación (coliformes totales y fecales, enterococos, colifagos, Escherichia coli, clostridios sulfito reductores, etc.), y detección de otros patógenos como enterovirus o parásitos intestinales (Acanthamoeba, Cryptosporidium o Giardia), se puede pasar a otros métodos más avanzados. Se incluyen aquí, no sólo los métodos moleculares (amplificación de los
Preface
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ácidos nucleicos, hibridación por sondas, o polimorfismo del ADN), sino también métodos rápidos y automatizados (kits diagnósticos, biosensores, recuentos de viables, etc.) y los métodos inmunológicos (anticuerpos monoclonales y recombinantes, enzimoinmunoanálisis, radioinmunoanálisis, etc.).
Las metodologías clásicas empleadas en microbiología suponen el cultivo de los microorganismos para su identificación, pero en algunos casos, nos encontramos con bacterias presentes en ese hábitat que no son capaces de crecer en los medios de cultivo que utilizamos, se trata de las llamadas “bacterias viables pero no cultivables”. Las nuevas metodologías, basadas en técnicas moleculares nos permiten estudiar este grupo de bacterias, aunque la aplicación tiene sus ventajas y sus inconvenientes. Algunas de las bacterias que obtenemos por metodologías dependientes de cultivo no aparecen en las metodologías independientes de cultivo. Es necesario por tanto, siempre que sea posible, combinar ambas metodologías, para tener una mejor perspectiva de ese sistema.
La elección de una técnica u otra depende no sólo del tipo de agua con el que trabajamos, sino también de los objetivos planteados.
En la presente tesis se han analizado dos modelos diferentes de aguas, las aguas residuales depuradas y las aguas empleadas en una unidad de hemodiálisis hospitalaria.
En cada uno de ellos se han utilizado metodologías distintas, adaptadas a los distintos usos a los que se destinan las distintas aguas. En la primera situación se han analizado microorganismos patógenos e indicadores de contaminación fecal para evaluar los posibles usos de aguas regeneradas obtenidas en tratamientos terciarios. En el segundo caso, el objetivo era el de disponer de aguas con un elevado nivel de pureza para evitar los efectos secundarios derivados en el tratamiento de pacientes en hemodiálisis renal sustitutiva. Las dos líneas de trabajo han podido ser financiadas gracias a la concesión de los siguientes proyectos:
- Criterios microbiológicos en reutilización de aguas y biosólidos (Ministerio de Ciencia y Tecnología, proyecto REN2002-04035-CO3-01).
- Desarrollo de nuevos métodos para los análisis microbiológicos de la calidad del agua de un centro hospitalario que cubra las necesidades de un servicio de hemodiálisis (Govern Balear, Plan Balear de Investigación).
- Identificación y tipado molecular de micobacterias ambientales (Govern Balear, proyecto PRIB-2004-10319).
Preface
9 OBJETIVOS DE LA TESIS
Los objetivos establecidos a lo largo de esta tesis doctoral, para cada uno de los sistemas de estudio son:
A) Aguas de hemodiálisis
1. Monitorización microbiológica del sistema de suministro de aguas para la unidad de hemodiálisis del Hospital Son Llàtzer en Palma de Mallorca. Evaluar la carga bacteriana de las aguas.
2. Determinar la composición de la comunidad microbiana presente en el agua de hemodiálisis, por metodologías dependientes e independientes de cultivo, y la afiliación filogenética de los microorganismos.
3. Descripción de nuevas especies y desarrollo de metodologías que permitan una mejor discriminación dentro de las especies de un mismo género.
4. Seguimiento de la evolución de la diversidad biológica de la comunidad bacteriana y de la influencia sobre ésta de las desinfecciones del sistema.
5. Evaluar la formación de biopelículas en las conducciones y depósitos del circuito, así como las bacterias implicadas y la eficacia de los tratamientos de desinfección.
B) Aguas regeneradas
1. Monitorizar las aguas del tratamiento secundario y terciario de dos depuradoras con un sistema de depuración terciario diferente (EDAR Binissalem y EDAR Sòller). Evaluar la eficacia del tratamiento de depuración en cada una de ellas y compararlos.
2. Evaluar metodologías de detección de patógenos y distintos indicadores de contaminación, así como las posibles correlaciones existentes entre ellos.
Preface
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Todos los capítulos de la presente tesis doctoral han sido escritos originalmente en inglés para su publicación en revistas científicas de ámbito internacional. Por ello, cada uno de los capítulos se presenta en forma de manuscritos de dichos artículos. El nombre, los coaturores y la revista científica donde se han publicado o enviado a publicar se detallan a continuación:
Chapter 2 Gomila, M., Gascó, J., Busquets, A., Gil, J., Bernabeu, R., Buades, J.M., and Lalucat, J. Identification of culturable bacteria present in haemodialysis water and fluid. FEMS Microbiology Ecology 52: 101-114, 2005.
Chapter 3 Gomila, M., Gascó, J., Gil, J., Bernabeu, R., Iñigo, V., and Lalucat, J. A molecular microbial ecology approach to studying hemodialysis water and fluid.
Kidney International 70: 1567–1576, 2006.
Chapter 4 Gomila, M., Ramirez, A., and Lalucat, J. Diversity of environmental Mycobacterium isolates from hemodialysis water as shown by a multigene sequencing approach. Applied and Environmental Microbiology (Accepted).
Chapter 5 Gomila, M., Bowien, B., Falsen, E., Moore, E., and Lalucat, J. Description of Pelomonas aquatica, sp. nov., and Pelomonas puraquae, sp. nov., isolated from industrial and haemodialysis water. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (Accepted).
Chapter 6 Gomila, M., Bowien, B., Falsen, E., Moore, E., and Lalucat, J. Description of two new Roseateles species, R. terrae sp. nov. and R. aquatilis sp. nov., in the family Comamonadaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (Submitted).
Chapter 7 Gomila, M., Burton, S., Lappin-Scott, H., and Lalucat, J. Experimental biofilms formed by bacteria isolated from haemodialysis water and effect of chlorination treatments. In preparation.
Chapter 9 Gomila, M., Solis, J.J., David, Z., Ramon, C.,and Lalucat, J.Comparative reduction of bacterial indicators, bacteriophages infecting enteric bacteria and enteroviruses in wastewater tertiary treatments by lagooning and UV-radiation.
Journal of Applied Microbiology (Submitted).
S ECTION A.
H AEMODIALYSIS W ATER
General introduction
13 INTRODUCCIÓN GENERAL
En nuestra comunidad autónoma el número de enfermos con tratamiento sustitutivo renal es de 655, con una tasa de prevalencia de 804,3 por millón de población (datos del Registre Balear de Malalts Renals 2001). Los enfermos presentan una alta comorbilidad derivada del tratamiento por hemodiálisis, debido a la insuficiencia renal que impide eliminar los contaminantes acumulados.
La hemodiálisis es un complejo proceso de depuración de compuestos indeseables que se han ido acumulando en el organismo cuando se produce un avanzado fallo renal crónico. La función de depuración de la sangre la realiza un dializador compuesto por membranas semipermeables donde se ponen en contacto la sangre del paciente con el líquido de diálisis. El dializador actúa de filtro de paso de compuestos indeseables, como la urea, mediante procesos de difusión y convención. En circunstancias normales, el fluido se mueve sólo en una única dirección, desde el torrente sanguíneo hasta el compartimento donde esta el fluido de diálisis, aunque eventualmente, el paso en dirección contraria puede ocurrir. El fluido de diálisis es una mezcla isotónica de sales y agua, con una composición electrolítica muy similar a la del plasma. Esta preparada fuera del sistema por el monitor de hemodiálisis a partir de agua purificada y solutos proporcionados en forma de concentrados electrolíticos o sales no disueltas; el tipo de agua purificada utilizada depende del sistema de distribución de agua que posee cada unidad de diálisis. La calidad y pureza del líquido de diálisis es uno de los principales requisitos de la técnica de hemodiálisis. De hecho la presencia de contaminantes en el líquido de diálisis expone al paciente a un riesgo de acumular sustancias tóxicas, dando lugar a complicaciones tanto agudas como crónicas. Hay que tener en cuenta que cada semana, la sangre del paciente en hemodiálisis queda expuesta a 270-600 litros de agua depurada a través de la membrana semipermeable del dializador con los consiguientes riesgos para la salud (Pérez García et al., 1999;
Arvanitidou et al., 1998; Canaud et al., 1998, 2000).
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Se ha descrito recientemente que el agua utilizada durante las sesiones de diálisis puede ser la responsable de la transmisión de una gran cantidad de enfermedades infecciosas, con brotes severos (Camargo et al., 2001; Roth et al., 2000a). Desde que se ha introducido la hemodiálisis en la práctica clínica, se han publicado muchos estudios sobre la transferencia de sustancias bacterianas (como son exotoxinas, lipopolisacáridos, o peptidoglicanos) o incluso, por pequeños fragmentos de DNA bacteriano desde el dializador al torrente sanguíneo con el consiguiente efecto deletéreo que tiene para el paciente (Canaud et al., 2000; Capelli et al., 2005; Schindler et al., 2004). Estos productos bacterianos son capaces de inducir citoquinas que actuarían como activadores del sistema inmune. Los estudios clínicos muestran los beneficios a largo plazo del uso de líquido de diálisis ultrapuro. La pureza microbiológica de las aguas de hemodiálisis y los fluidos de diálisis son cruciales para la prevención de la inflamación silenciosa crónica asociada a la hemodiálisis (Lonnemann, 2000), para la reducción de la amiloidosis secundaria provocada por la hemodiálisis (Floege et al., 2001), para la supresión de reacciones pirogénicas (Pegues et al., 1992), y para mejorar el control de la anemia que acompaña una insuficiencia renal crónica (Sitter et al., 2000). Por tanto, las unidades de hemodiálisis requieren de aguas de gran calidad, con controles mucho mas rigurosos que para otros usos. Los métodos utilizados en la hemodiálisis para purificar el agua incluyen varias estrategias para eliminar los contaminantes químicos y bacterianos: ósmosis inversa, filtros de carbón activo, filtros submicrónicos, desinfección periódica (ácido peracético, formaldehído, glutaraldehído o hipoclorito sódico), entre otros.
Los estándares de calidad respecto al agua y líquido de diálisis han evolucionado en los últimos 15 años (Pérez Sheriff et al., 1989; Real Farmacopea Española, 1997a,b;
Comité AENOR, 1991a,b; AAMI, 1981) hacia nuevos parámetros de normas de calidad y a su cumplimiento y control (Lonnemann, 1998; Laurence et al., 1995; Pérez García et al., 2004). Tan importante como contar con la mejor planta de tratamiento es conseguir mantener el grado de pureza y calidad alcanzados en el agua y en el líquido de diálisis (Ouseph et al., 2002; Lindley et al., 2002), producido éste como un paso final dentro del monitor de hemodiálisis con la adición de concentrados de iones y sales. En el futuro, el objetivo es contar con un líquido de diálisis ultrapuro, con un grado de pureza similar al exigido para las soluciones empleadas en infusión intravenosa,
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15 concibiendo el líquido de diálisis como un medicamento más de los que se administra a los pacientes (Ward, 2000).
Aunque el agua utilizada en la hemodiálisis no es estéril, los niveles de bacterias y de productos derivados de bacterias han de ser suficientemente bajos. Las asociaciones renales, europea y española recomiendan valores control del agua menores de 100 ufc/ml de bacterias, y menos de 0,25 UI/ml de endotoxinas. Los valores correspondientes al fluido de hemodiálisis son 1000 ufc/ml de bacterias y 0,5 UI/ml de endotoxinas. De acuerdo con los estándares de la Asociación Americana para los Avances en la Instrumentación Médica (AAMI), los niveles máximos permitidos de bacterias viables son 200 ufc/ml y menos de 2 UI/ml de endotoxinas para el agua usada para preparar el dializado, y 2000 ufc/ml para el fluido de diálisis final. Estos números de ufc corresponden al número total de bacterias aerobias viables capaces de crecer en medio TSA, incubadas durante cinco días a una temperatura entre 30 y 35ºC, mientras que la determinación de endotoxinas se realiza mediante el test de Limulus (LAL) (EBPG, 2002; AAMI, 2004; Pérez García et al. 2004).
Los tratamientos de purificación de las aguas de los hospitales han estado inicialmente encaminados a la eliminación de compuestos químicos perjudiciales y se ha prestado menor atención a la microbiota existente, adaptada a ambientes pobres en nutrientes y fuentes de carbono. El agua depurada para hemodiálisis puede considerarse como un ambiente extremo (su contenido de carbono orgánico total, así como de N total, P total, nitratos y sulfatos, es inferior a 1 mg/l; mientras que el contenido en nitritos es inferior a 1 μg/l). A pesar de ello, microorganismos oligótrofos son capaces de crecer en estas bajas concentraciones de nutrientes, y pueden colonizar el circuito por adhesión formando biopelículas. Incluso cuando se alcanzan los niveles mínimos de bacterias y sustancias químicas en los pasos de purificación, el agua se ha de transportar a los usuarios finales dentro del hospital, y el crecimiento de bacterias oligotróficas en los sistemas de distribución puede representar un nuevo factor de riesgo a considerar.
Las tuberías, membranas, tanques y otras superficies de los sistemas de distribución son lugares favorables para la adhesión bacteriana y el crecimiento celular. Muchas de estas bacterias, que pueden utilizar trazas de nutrientes orgánicos e inorgánicos, se multiplican para formar biopelículas en las superficies interiores de los tubos y filtros.
La temperatura ambiental, el estancamiento del agua y el crecimiento de biopelículas,
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así como la liberación de las bacterias planctónicas en los sistemas de aguas puras (McFeters et al., 1993) pueden ser los responsables de la contaminación de las aguas de hemodiálisis (Singh et al., 2003). Las biopelículas son comunidades microbianas que tienen capacidad para adherirse a superficies y están constituidas por bacterias y partículas minerales embebidas en una matriz de exopolisacáridos (Capelli et al., 2000;
Harding et al., 1989, 1992). La biopelícula se convierte en un punto de concentración de nutrientes disueltos en las aguas, facilitando la multiplicación bacteriana. En estas condiciones pueden convertirse en más resistentes frente a los desinfectantes, generando un foco de anclaje y diseminación de bacterias dentro de las conducciones de agua teóricamente pura. Además, algunos géneros bacterianos pueden usar productos lisados a partir de la biomasa muerta, como fuente de energía y carbono (crecimiento críptico).
El crecimiento bacteriano y biofouling en sistemas de conducción de aguas, representa un problema potencialmente serio para las aplicaciones médicas debido a la presencia de bacterias o a sus productos en el agua purificada. Los fragmentos de bacterias generados por estas biopelículas son capaces de atravesar la membrana de diálisis y estimular una respuesta inflamatoria en los pacientes (Hoenich et al., 2003). Sin embargo, la eliminación completa de los microorganismos contaminantes se considera prácticamente imposible (Kulakov et al., 2002).
Las normas microbiológicas de control de las aguas suministradas a los hospitales consideran sólo la enumeración bacteriana mediante el recuento en medios de cultivo estándar (agar Mueller-Hinton, agar sangre, agar tríptico de soja), y no especifican cuáles deben ser las especies bacterianas presentes en este agua. Las bacterias, aunque sea en pequeñas cantidades, pueden contribuir a la baja calidad del dializado. De todos modos hay que considerar que, aunque la calidad microbiológica de este agua se determina por el número de bacterias cultivables, no todas las bacterias presentes pueden cultivarse en los medios estándares de crecimiento, particularmente cuando las muestras se toman de hábitats muy oligotróficos.
La identificación de los miembros de las comunidades bacterianas en los diferentes puntos del sistema de purificación y distribución de agua a los usuarios finales tiene una importancia crítica por muchas razones: (a) establecer el origen de la presencia bacteriana, (b) evaluar el efecto de los desinfectantes en el tratamiento y
General introduction
17 distribución de agua, y (c) la valoración precisa del riesgo asociado a la presencia de patógenos y bacterias oportunistas.
El control de la calidad microbiológica del agua de hemodiálisis debe ser rápido y preciso. Ha de poder discriminar el número y el tipo de organismos presente, así como debe aportar información acerca del origen de la posible contaminación de esas aguas.
La identificación basada exclusivamente en los cultivos es muy valiosa, pero ésta depende de las condiciones de crecimiento determinadas por el medio de cultivo, la temperatura y el tiempo de incubación. Se sabe actualmente que muchos microorganismos de los medios acuáticos entran en un estado fisiológico denominado como “viables pero no cultivables”, que impiden recuperarlos en cultivo mediante las técnicas tradicionales (Roszack et al., 1987; Connon et al., 20002; van der Linde et al., 1999). Este aspecto es particularmente importante para las bacterias patógenas, que pueden permanecer indetectables mediante los métodos de cultivo tradicionales, a pesar de mantener su viabilidad (Hurst et al., 2002; Kawai et al., 2002; Kulakov et al., 2002;
Philips et al., 1994).
Con el fin de determinar la diversidad bacteriana durante la purificación y distribución de los sistemas de suministro de agua de hemodiálisis, se plantearon una serie de trabajos que corresponden a los siguientes seis capítulos de esta tesis. Se tomaron 28 muestras de agua procedentes de cuatro puntos del sistema de distribución de aguas del Hospital de Son Llàtzer (Palma de Mallorca). Se analizaron durante un periodo de 18 meses mediante cultivo las bacterias planctónicas en el medio R2A, medio estándar, oligotrófico, especifico para la cuantificación de bacterias en aguas potables (Reasoner and Geldreich, 1985). Se identificaron las colonias a nivel de especie o género mediante el uso de análisis de restricción del DNA ribosómico amplificado (ARDRA) y secuencia parcial, o completa en algunos casos, del gen 16S rDNA (Capítulo 2). Algunos organismos, incluyendo patógenos potenciales como Afipia sp. o Legionella sp., son difíciles de aislar y cuantificar por cultivo a partir de las muestras ambientales, donde pueden subsistir en estado “viable pero no-cultivable”. Por ese motivo, en el caso de las muestras de marzo del 2003, se adoptó otra estrategia distinta a las técnicas dependientes de cultivo para complementar los resultados obtenidos, la utilización de técnicas de biología molecular para el estudio de diversidad microbiana. Se construyó una genoteca a partir del rDNA 16S total obtenido de las
Chapter 1
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muestras y se analizaron los clones obtenidos, mediante el análisis de restricción del DNA ribosómico amplificado y secuencia parcial de este gen (Capítulo 3).
El ARDRA del gen 16S rDNA y la posterior secuencia de uno o dos representantes de cada grupo nos permitió afiliar a 60 de los 238 aislamientos obtenidos con el género Mycobacterium, concretamente a especies del grupo “M. chelonae-like”
y al complejo de M. fortuitum. El análisis del gen 16S rDNA no permitía llegar a una identificación correcta a nivel de especie: M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae y M.
massiliense son cuatro especies distintas con un 100% de identidad en el gen 16S rDNA. Para evitar este sesgo se seleccionaron 20 aislados de los 60 a los que se incluyeron siete cepas de origen clínico y las 11 cepas tipo relacionadas para un análisis multigénico más detallado. Se secuenciaron fragmentos de siete genes, el 16S rDNA, ITS1, gyrB, hsp65, recA, rpoB, y sodA (un total de 2994-3174 nucleótidos). El análisis concatenado o el consenso de varios genes permitían una mejor discriminación entre las cepas (Capítulo 4).
Tres de los 238 aislamientos obtenidos, presentaban un 99,7% de identidad en el gen del 16S rDNA completo con la especie Pelomonas saccharophila, única especie descrita en este género capaz de fijar nitrógeno y de oxidar hidrógeno. Con un 98% de identidad en la secuencia del gen 16S rDNA, se pueden distinguir tres géneros distintos:
Mitsuaria, Pelomonas, y Roseateles, todos ellos también con una única especie descrita.
Para establecer de forma más clara la afiliación filogenética de nuestros aislamientos, se diseñó un estudio más detallado incluyendo las cepas tipo de cada uno de los géneros, así como otras cinco cepas sin identificar próximas a Pelomonas, que estaban depositadas en la colección sueca de cultivos tipo (CCUG). Se hizo un análisis molecular amplificando además del gen del 16S rDNA, los genes del ITS, el gen de la nitrogenasa (nifH), los genes de las distintas formas de la Rubisco (forma I roja y verde (cbbL), y forma II (cbbM)) y del gen para la hidrogenasa (hox). Se realizó también un análisis fenotípico (crecimiento a distintas temperaturas, con distintas fuentes de carbono, a distintas concentraciones de hidrógeno, API 20NE, API50CH y Biolog). Se completó la caracterización con las hibridaciones DNA-DNA y con el contenido de ácidos grasos de las distintas cepas. Este estudio nos permitió la descripción de cuatro nuevas especies: dos dentro del género Pelomonas (P. aquatica y P. puraquae), y las otras dos en el género Roseateles (R. aquatilis y R. terrae) (Capítulo 5 y Capítulo 6).
General introduction
19 Una vez identificadas las bacterias presentes, nos planteamos cuál debía ser el origen de estos microoganismos en estas aguas. Teóricamente antes de entrar el agua al anillo de distribución ésta pasaba por una serie de filtros submicrónicos y se sometía diariamente y mensualmente a un proceso de cloración (0,3 ppm y 30 ppm, respectivamente). Probablemente a lo largo de las conducciones se estaba desarrollando una biopelícula. Seleccionamos seis aislamientos característicos y comprobamos su capacidad de formar una biopelícula, además de evaluar cual era el efecto de la hipercloración (30 ppm de hipoclorito sódico) sobre estos aislamientos y la capacidad de recuperación una vez finalizado el tratamiento (Capítulo 7).
CHAPTER 2
I DENTIFICATION OF CULTURABLE BACTERIA PRESENT IN HAEMODIALYSIS WATER AND FLUID
Published in FEMS Microbiology Ecology 52: 101-114, 2005.
ABSTRACT
Water used to prepare haemodialysis fluid is not sterile, and its microbiological control is important for the prevention of haemodialysis-associated illness. Bacterial populations inhabiting a distribution system for haemodialysis water were studied over an 18 month period. 203 planktonic bacteria isolated on R2A medium were identified by restriction analysis and sequencing of 16S rDNA. A diverse bacterial community was detected, containing predominantly Gram-negatives of the Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria, as well as representatives of the genus Mycobacterium. Ecological and clinical consequences are discussed: bacteria found from the genera Novosphingobium, Pseudomonas and Sphingomonas have been described in the build- up of biofilms, and others, like Acinetobacter, Mycobacterium or Brevibacterium may represent a health-risk to patients under haemodialysis treatment.
Bacteria in haemodialysis water
23 2.1 INTRODUCTION
Several lines of evidence have accumulated showing that microbiological purity of haemodialysis water and dialysis fluid is crucial for the prevention of the silent chronic inflammation associated with haemodialysis (Lonnemann, 2000), for the reduction of secondary amyloidosis arising from haemodialysis (Floege and Ketteler, 2001), suppression of pyrogenic reactions (Pegues et al., 1992), and improved control of anaemia following chronic renal insufficiency (Sitter et al., 2000). These problems are due mainly to the presence of bacteria, endotoxins and bacteria-derived products (Canaud et al., 2000) Water used during dialysis sessions may be responsible for the transmission of an increasing number of infections, with large and severe outbreaks having been recently reported (Camargo et al., 2001; Roth and Jarvis, 2000a).
Therefore, haemodialysis units require high quality water, with much more rigorous standards than for other uses. Methods for the purification of water used in haemodialysis include various strategies to remove chemical contaminants and bacteria:
reverse osmosis, active carbon filters, sub-micron filters, regularly disinfection, etc.
Whilst the water used in haemodialysis is not sterile, the levels of bacteria and bacteria- derived products have to be sufficiently low. The Spanish and European Renal Associations recommend values of less than 100 CFU/ml, and less than 0.25 endotoxin IU/ml as water standards (EBPG, 2002; Peréz-García et al., 2004). The corresponding values for the haemodialysis fluid are 1000 CFU/ml and 0.5 endotoxin IU/ml.
According to the standards of the American Association for the Advancement of Medical Instrumentation, the maximum allowable level of viable bacteria is set at 200 CFU/ml and less than 2 endotoxin IU/ml for water used to prepare dialysate, and 2000 CFU/ml for the final dialysis fluid. Even when the low levels of bacteria and chemicals [values for total organic carbon, nitrogen, phosphorus, and sulphate have to be less than 1 mg/l (Kulakov et al., 2002)] are achieved at the purification steps, the water has to be transported to the end-users within the hospital, and the growth of oligotrophic bacteria in the distribution systems might represent a new risk factor to be considered. Despite these precautions, piping, membranes, tanks and other surfaces within the distribution system provide favourable sites for bacterial adhesion and cell growth. Most of these bacteria, which can use traces of organic and inorganic nutrients, multiply to form biofilms attached to the inner surface of the tubing or filters. Biofilm growth and
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detachment account for most of the planktonic bacteria in pure water systems (McFeters et al., 1993) and might be responsible for contamination of haemodialysis waters, which can be caused by numerous factors, including ambient temperature, stagnation and the development of biofilms (Singh et al., 2003). Bacterial growth and biofouling within these systems present potentially serious problems for medical applications because of the presence of bacteria or their products in the purified water. Bacterial fragments generated by such biofilms are able to cross the dialysis membrane and stimulate an inflammatory response in the patient (Hoenich and Levin, 2003). The complete removal of contaminating microorganisms is considered to be nearly impossible (Kulakov et al., 2002). Microbiological standards for control of water supplies in hospitals consider only bacterial enumeration by plating in standard growth media (Mueller-Hinton, Blood Agar, and Trypticase Soy Agar), and do not specify the bacterial species present in these waters. However, the potential presence of bacteria, even in low numbers, may contribute to a lower quality of the dialysate. The identification of the members of the bacterial communities at different points between water purification, distribution and the end-users is of critical importance for different reasons: i) establishing the origin of the bacteria present, ii) to evaluate the effect of disinfectants in the water treatment and distribution, and iii) to accurately assess the risk associated with the presence of pathogens and opportunistic bacteria.
In the first step towards determining the bacterial diversity within the purification and distribution systems of a haemodialysis unit, 28 samples of water, taken at four points in the water distribution system, were analysed over a period of 18 months by culturing the viable planktonic bacteria in R2A medium, a standard oligotrophic medium developed specifically for quantification of bacteria in drinking water (Reasoner and Geldreich, 1985). To characterise the bacterial community, colonies were identified at the genus or species level through an amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and a subsequent partial or almost complete sequencing, of the 16S rDNA.
Bacteria in haemodialysis water
25 2.2 MATERIALS AND METHODS
2.2.1 Water system
This study was carried out at the Hospital Son Llàtzer (Palma de Mallorca, Spain).
The community water supply is permanently chlorinated at 0.3 ppm, filtered through sand filters, decalcified, and treated by reverse osmosis. Water is stored in two reservoirs, and distributed to the haemodialysis machines after dechlorination through active carbon and sub-micron filtering through a series of filters of 5, 0.8 and 0.22 μm.
After pumping through 25 mm diameter Saenger-PVC 32-1,0 pipes (UNE norm 5311231994138) and 185 m long, the water reaches the haemodialysis monitors, passing through polysulphone filters before the haemodialysis fluid is reconstituted. At monthly intervals the water circuit is treated by chlorination, achieving levels of 30 ppm of free chlorine in all parts.
2.2.2 Sampling
Twenty-litre water samples were collected aseptically on seven occasions, from July 2002 to January 2004. This high volume was considered appropriate because a single haemodialysis session needs about 400 l of water, and the patient is potentially exposed to bacteria present in this volume. Samples were taken one day before the monthly routine disinfection, and two days after chlorination. Four sampling points were considered. Point 1 was located after the first water treatment system, which performs chlorination, particle filtering, decalcification and reverse osmosis of community water, before entering the reservoirs. Point 2 was at the outlet of the repositories accumulating the pre-treated water. Sample 3 was collected from the outlet port of the distribution ring, before entering the dialysis monitor. Sample 4 was the dialysis fluid at the dialyzer, after reconstitution. Samples were transported to the laboratory at 4ºC in less than 4 hours.
Chapter 2
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2.2.3 Viable bacterial counts
Quantitative methods were used to enumerate the total count of viable bacteria: 1 ml and 0.1 ml of the direct sample, and 0.1 ml of serial dilutions (1 to 10 in Ringer solution) were plated in duplicate on R2A medium (Reasoner and Geldreich, 1985) using the spread plate method, and incubated for 10 days at 20ºC. Samples were also plated on Mueller-Hinton and Blood Agar media, incubating for 24 hours at 35 ºC, and 10 days at 20 ºC. Plates with less than 300 colonies were counted for enumeration.
2.2.4 Bacterial isolation and identification
Colonies with different morphologies from each sample, corresponding to different sampling points and times, were selected for identification (82 in total). Also, all the colonies (156) of the most highly diluted plates from the March 2003 sampling were isolated. Isolates were checked for purity by streaking on plates of the same medium, and stored in glycerol at –70 ºC. A phenotypic identification was attempted for Gram-negatives using the API 20NE strips (Biomérieux). Isolates were presumptively identified by 16S rDNA analysis. Total DNA was extracted by lysis with sodium dodecyl sulphate (SDS)-proteinase K, and treatment with CTAB (cetyltrimethylammonium bromide). The 16S rRNA gene was amplified using the following conditions: 1 µl of DNA was amplified with primers 16f27 (5’-AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG-3’) and 16r1492 (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) [Lane, 1991]. Each PCR mixture (50 µl) contained a reaction mix of 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 200 µM of each of the four deoxynucleoside triphosphates (Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Germany), 0.5 µl forward and reverse primers, 5 µl template DNA and 1.5 U Taq DNA polymerase (Amersham Biosciences).
The reactions were performed in an Eppendorf thermocycler, with an initial denaturation step of 5 min at 94ºC, followed by 30 cycles of 1 min at 94ºC, 1 min at 55ºC and 1 min 30 sec at 72ºC. Following amplification, samples were incubated at 72 ºC for 10 min and then cooled to 4ºC. Five μl of amplified PCR products were analysed by electrophoresis on 1% agarose gels and stained with ethidium bromide.
Bacteria in haemodialysis water
27 2.2.5 Fingerprinting of the 16S RNA gene (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, ARDRA)
Ten μl of the 16S RNA gene amplicons were treated separately with 1U TaqI (4 hours at 65ºC) and 1U HaeIII (4 hours at 37ºC), according to the manufacturer’s instructions (Boehringer-Mannheim, Germany), to determine the characteristic RFLPs of each isolate. After incubation, the resulting digestion products were separated by electrophoresis on a 3% agarose gel (Nusieve 1:1 agarose MP) at 80 V followed by ethidium bromide staining. Restriction patterns were analysed visually and also using an image analysis system (Whole Band Analyzer, Bioimage) to group the patterns according to a similarity coefficient using the UPGMA method, allowing a 5% level of discrimination between the bands. Two isolates were considered members of the same phylotype when their RFLP patterns were identical.
2.2.6 Nucleotide sequence determination of the 16s RNA gene
One or two representatives of each group of RFLP patterns were sequenced to determine their partial 16S RNA nucleotide sequence. 16S RNA gene amplicons were purified using Microcon-100 concentrators (Amicon) and sequenced directly using the ABI PRISM BigDye Terminator Cycle sequencing kit, according to the manufacturer’s instructions. Sequences were read with an automatic sequence analyser (ABI PRISM 377 DNA Sequencer, PE Biosystems). The primers used for sequencing the isolates were 16f27 (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’), 16f63 (5’-CAGGCCTAACACA TGCAAGTC-3’), and 16f357 (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) [Lane, 1991;
Marchesi et al., 1998]. The first 500-700 nucleotides of the 16S rDNA were sequenced and analysed. Seven isolates were almost completely sequenced. All sequences included in this paper were submitted to GenBank, and are available under accession numbers AJ746058-AJ746164.
2.2.7 Phylogenetic analysis of the 16S RNA gene
Partial 16S rRNA sequences were compared initially with reference sequences at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) using BLAST and were subsequently aligned with
Chapter 2
28
16S rRNA reference sequences in the ARB package (http://www.arb-home.de).
Ambiguously and incorrectly aligned positions were aligned manually on the basis of conserved primary sequence and secondary structure. Phylogenetic trees were inferred by neighbor-joining with the Jukes and Cantor model to estimate evolutionary distances.
For each phylogenetic group a specific filter was used, accepting 50% minimal homology. Short sequences were added to the tree by using the parsimony insertion tool in ARB. The percentage similarity of sequences was determined with the distance matrix tool in ARB (Ludwig et al., 2004).
Isolates were assigned to a species when they clearly clustered in the same branch as the type strain of that species, and when the similarity values in the 16S rDNA sequence from the databases were 96% or higher. In other cases, the isolate was assigned to the genus affiliated to the same phylogenetic branch in which the isolate was included or to the closest described species. Accession numbers for each 16S rDNA sequenced are indicated in Table 2.1.
2.2.8 Diversity indexes
Shannon index (H = -Σpilnpi; where pi is the ratio of isolates of each phylotype) is a diversity index for statistical estimation of the bacterial diversity and was calculated as described by Hughes et al (2001) and Hill et al (2003). It correlates with richness and relative phylotype abundance. Abundance and dominance are indicated by the evenness index (E = H/lnS; where S is the number of phylotypes) and by the Simpson’s index (D
= Σpi2). Since the scale for D varies between communities according to S, the measure was standardized by dividing by Dmax, being Dmax = 1-(1/S). This provided an evenness index conceptually similar to the index derived from the Shannon function.
Phylotype richness, d, was calculated as d = (S-1)/logN (where N is the total number of colonies analysed). Rarefaction index is another approach in which the observed number of phylotypes is compared with those predicted by a computer model (Analytic rarefaction 1.3; www.uga.edu). The program estimates also the maximal phylotype richness in the community, E(S). Coverage index (C) was calculated as C=1-(n/N), n being the number of phylotypes appearing only once. The SChao1 estimator (Kemp and Aller, 2004) is calculated as SChao1=Sobs+F12/2(F2+1)-F1F2/2(F2+1)2, where Sobs is the number of phylotypes observed in the library, and F1 and F2 are the number of
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29 phylotypes occurring either one or two times. It is an estimate of the total number of phylotypes or species present.
2.3 RESULTS
2.3.1 Culturable cell counts
Cell counts on plates of R2A medium varied significantly between the sampling points. Culturable bacteria before hyperchlorination increased from the beginning of the circuit (point 1, 135 to 205 CFU/ml) to the dialysis machine (point 2, 5.7 to 175 CFU/ml; point 3, 825 to 2070 CFU/ml). A clear decrease in cell numbers was detected after the hyperchlorination treatments at points 1 (3 or less CFU/ml) and 2 (<10 to 22.5 CFU/ml), but not at point 3 (1375 to 2970 CFU/ml). In all circumstances, the counts of the haemodialysis fluid in the monitors (point 4) were lower than the maximum recommended values (1 CFU/ml was the highest value). Counts on Blood Agar or in Mueller-Hinton media were between 3 and 10 times lower. Endotoxin levels, as determined with the L.A.L. kinetic-chromogenic test (K-QCL), were below the recommended values in sample point 4 (<0.05 IU/ml), and ranged between 2.1 and 8.48 IU/ml in the other samples.
2.3.2 Identification
A phenotypic identification was attempted at the beginning of the study.
Characteristics considered were cell morphology, motility, oxidase, oxidation/fermentation test with glucose, growth on McConkey plates, growth at 20ºC, 30ºC and 42 ºC, together with commercial biochemical tests, 20NE API strips. Gram- negative, oxidase-positive non-fermenting bacteria were the predominant group detected (data not shown). The isolates were not identifiable through the current phenotypic databases, as is also the case with other clinical isolates (Drancourt et al., 2004) and, therefore, a phylogenetic identification approach was introduced.
A total of 238 isolates were studied, and 203 of them were tentatively identified through 16S rDNA sequence analysis. Eighty-two colonies were selected on R2A
Chapter 2
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medium from the different samples during the study period, due to differences in colonial morphology in each sample. Additional 156 colonies correspond to all those present on the R2A plates from the highest dilution in the March 2003 sampling, thus presumably representing the predominant species in the bacterial community. The 16S rDNA of all the isolates was amplified, treated with the restriction enzymes TaqI and HaeIII, and analysed using the BioImage programme to group the isolates. A total of 123 patterns (or phylotypes) were identified among the 238 isolates. As an example, Figure 2.1 shows the result of the ARDRA of 9 isolates from the 48 obtained in the two first samplings. A characteristic pattern was obtained for each isolate, thereby allowing their comparison. Isolates showing the same pattern with the two enzymes (lanes 1 and 2) were supposed to be representatives of the same species, which was assessed by sequencing the 16S rDNA from some of the isolates. Lanes 8 and 9, showed identical ARDRA for TaqI, but not for HaeIII, and were considered possible members of different species, representing 2 phylotypes. A dendrogram was constructed to group the 48 isolates (Fig. 2.2).
Fig. 2.1. ARDRA of the 16S rDNA digested with TaqI and HaeIII for 9 isolates selected by their colonial morphology (M: 100 bp ladder).
To evaluate the phylogenetic diversity represented by the 123 RFLP patterns detected for the 16S rDNA gene, one or two representative isolates of the most predominant RFLP pattern were sequenced. Two hundred three of the 238 isolates were identified at the genus or species level using the ARB program, as shown in Table 2.1.
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31 The other 35 isolates (14%) showed different RFLP patterns and were not studied further. The corresponding phylogenetic trees are represented in Figure 2.3. The Gram- negative bacteria detected were included in the Alpha-, Beta-, and Gammaproteobacteria, and in the phylum Flavobacteria. Gram-positives were located in the high and low G+C branches.
The most common genera in the colonies selected by their distinct morphologies were: Sphingomonas/Novosphingobium (8 sequences analysed corresponding to 16 isolates), Variovorax (4 sequences in 11 isolates), Staphylococcus (7 sequences in 7 isolates), and Bacillus (6 sequences in 6 isolates).
A different approach was adopted for the March 2003 sampling to assess the abundance of species and their phylogenetic diversity. The 156 isolates, all the colonies in the plates corresponding to the highest dilution, were analysed: 28 isolates of sample point 1, 37 of sample point 2 and 40 of sample point 3 before the hyperchlorination step, together with 6 isolates of sample point 1, and 45 of sample point 3 after the chlorination step. No colonies were detected from sampling points 2 (after chlorination) or 4 (after and before chlorination). Identification results are also indicated in Table 2.1.
Abundance for each genus or species is indicated. In the Alphaproteobacteria group, the most abundant isolates were associated with the genus Novosphingobium (17 isolates of N. stygium, corresponding to 4 different RFLP patterns). Variovorax (3 phylotypes in 6 colonies) and Acidovorax (9 colonies with 2 phylotypes), together with Wautersia (“Ralstonia”) eutropha (13 colonies with 2 RFLP patterns) and Herbaspirillum (6 colonies with 2 phylotypes), were the most abundant Betaproteobacteria. The most abundant species in the low G+C group of Gram-positives was the spore-former Bacillus cereus (7 colonies distributed in 3 phylotypes). Colonies included in the group of Mycobacterium chelonae-like organisms (Figure 2.3g) were assigned to the species M. chelonae or M. abscessus (19 colonies with 6 phylotypes), and to the complex of M.
fortuitum (35 colonies with 6 different phylotypes). These strains were predominant in the group of high G+C Gram-positives, but could not be identified at the species level due to the low discriminatory power of the 16S sequence in separating species within the group (Tortoli, 2003).
