Estudio del control por PPARs de la expresión de mioquinas en miocitos diferenciados

1 Facultad de Ciencias

Memoria del Trabajo de Fin de Grado

Estudio del control por PPARs de la expresión de mioquinas en miocitos diferenciados.

Antonio Lainez Ruiz Grado de Biología

Año académico 2014-2015

DNI de l’alumne: 43183831C

Trabajo titulado por: Ana María Rodríguez Guerrero

Departamento de Biología fundamental y Ciencias de la Salud

NO S'autoritza la Universitat a incloure el meu treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línea, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació

Palabras claves del trabajo: células musculares, PPARα, PPARβ, PPARγ, ácidos grasos de cadena larga, oleico, linoleico, aicar, PGC1α, IL6, FNDC5, IL15.

2

3

Índice
 


Resumen………4
 



Abreviaturas………...6
 









1.
Introducción………7
 









2.
Objetivos………12

 









3.
Diseño
experimental
y
métodos…...………..13
 









3.1.
Diseño
experimental...………..13

 









3.2.
Descongelación
de
las
células………...13

 









3.3.
Subcultivos
de
células
C2C12...………...13
 










3.4.
Diferenciación
de
las
células
C2C12
a
miotubos...14






 










3.5.
Tratamientos
utilizados
durante
la
diferenciación
de
las
células
C2C12..14
 


3.6.
Extracción
y
purificación
de
RNA...15





 








3.7.
Análisis
por
retrotranscripción
(RT)
seguida
de
reacción
en
cadena
de
la

 polimerasa
cuentitativa
a
tiempo
real
(RT‐qPCR)...16
 








3.8.
Análisis
estadísticos...16
 

















4.
Resultados
………...17
 










5.
Discusión
………..21
 










6.
Conclusión
………...23
 










7.
Agradecimientos
……….23
 










8.
Referencias
……….24
 










9.
Anexos
………27

 








9.1.
Anexo
1:
Protocolo
para
la
descongelación
de
las
células………..27

 








9.2.
Anexo
2:Protocolo
para
realizar
un
subcultivo
de
células
C2C12……….27

 








9.3.
Anexo
3:
Protocolo
para
la
diferenciación
de
células
C2C12
a
miotubos…….28

 








9.4.
Anexo
4:
Protocolo
para
la
extracción
y
purificación
del
RNA
en
columnas...29

 9.5. Anexo 5: Protocolo del análisis de la expresión génica por RT-qPCR…………..30


4

Resumen



 


En
 el
 músculo
 esquelético
 se
 llevan
 a
 cabo
 funciones
 importantes
 que
 influyen
 en
 el
 metabolismo
del
organismo
en
su
conjunto,
como
la
oxidación
de
ácidos
grasos
(AG)
y
glucosa
y
 la
secreción
de
unas
proteínas
señalizadoras
llamadas

mioquinas,
lo
que
permite
controlar
más
 finamente
un
gran
número
de
procesos
metabólicos
en
otros
tejidos.
Actualmente,
el
estudio
de
 distintos
 receptores
 nucleares
 y
 su
 papel
 en
 la
 oxidación
 de
 AG
 en
 células
 musculares
 y
 cómo
 pueden
 afectar
 a
 la
 expresión
 de
 determinadas
 mioquinas
 es
 de
 gran
 interés.
 Un
 caso
 interesante
sería
el
de
los
receptores
activados
por
proliferadores
de
peroxisomas
(PPARs).



 Los
PPARs
son
una
familia
de
receptores
nucleares/factores
de
transcripción
que
ejercen
 un
papel
vital
en
la
diferenciación
celular
y
en
la
homeostasis
lipídica
y
glucídica.
Su
función
se
 ve
condicionada
por
una
serie
de
co‐activadores
o
co‐represores,
los
cuales
pueden
estimular
o
 inhibir
la
función
del
receptor.
Se
sabe
que
los
PPARs
ejercen
como
reguladores
del
metabolismo
 muscular
al
ser
activados
por
AG
y
sus
derivados.



 En
el
presente
trabajo,
se
estudió
el
efecto
de
la
activación
por
agonistas
de
los
PPARα,
 PPARβ
y
PPARγ
y
de
los
ácidos
grasos
de
cadena
larga
(AGCL),
en
concreto
los
ácidos
oleico
y
 linoleico,
 sobre
 la
 expresión
 de
 determinados
 genes
 que
 codifican
 mioquinas
 o
 que
 están
 involucrados
 en
 el
 control
 de
 su
 expresión.
 Para
 ello
 se
 utilizó
 la
 línea
 celular
 de
 miocitos
 de
 ratónC2C12.
Las
células
fueron
cultivadas
y
diferenciadas,
para
posteriormente
ser
tratadas
con
 los
distintos
agonistas
de
los
PPARs
y
una
mezcla
equimolar
de
ácido
oleico
y
linoleico,
solos
o
 en
combinación
con
AICAR
(un
activador
de
la
proteína
quinasa
activada
por
AMP,
la
AMPK).
El
 RNA
de
cada
muestra
fue
extraído
y
purificado
y
posteriormente
se
determinaron
los
niveles
de
 expresión
de
los
genes
de
interés
mediante
un
proceso
de
RT‐qPCR.



 A
 partir
 de
 los
 datos
 obtenidos
 en
 este
 estudio,
 y
 teniendo
 en
 cuenta
 que
 los
 estudios
 sobre
los
PPARs
en
las
células
musculares
en
relación
con
el
control
de
mioquinas
son
bastantes
 novedosos,
podríamos
decir
que
los
PPARs
y
AGCL
tienen
efectos
destacados
en
la
expresión
de
 mioquinas,
especialmente
en
la
Interleukina
6.





Palabras
clave:

células musculares, PPARs, PPARα, PPARβ, PPARγ, ácidos grasos de cadena larga, oleico, linoleico, aicar, PGC1α, IL6, FNDC5, IL15



 



 












































5

Abstract
 


Skeletal
 muscle
 shows
 important
 functions
 that
 influence
 the
 metabolism
 of
 the
 organism
 as
 a
 whole,
 as
 the
 oxidation
 of
 fatty
 acids
 (FA)
 and
 glucose
 and
 secretion
 of
 signaling
 proteins
 called
 myokines,
 allowing
 to
 finely
 control
 a
 large
 number
 of
 metabolic
processes
in
other
tissues.
Currently,
the
study
of
various
nuclear
receptors
 and
 their
 role
 in
 the
 oxidation
 of
 FA
 in
 muscle
 cells
 and
 how
 they
 may
 affect
 the
 expression
 of
 certain
 myokines
 is
 of
 great
 interest.
 An
 interesting
 case
 would
 be
 the
 peroxisome
proliferator‐activated
receptors
(PPARs).


PPARs
 are
 a
 family
 of
 nuclear
 receptors/transcription
 factors
 that
 exert
 a
 vital
 role
 in
 cell
 differentiation
 and
 in
 lipid
 and
 carbohydrate
 homeostasis.
 Their
 function
 is
 conditioned
by
a
series
of
co‐activators
or
co‐repressors,
which
may
stimulate
or
inhibit
 transcriptional
 activity.
 PPARs
 are
 known
 to
 perform
 actions
 as
 regulators
 on
 muscle
 metabolism
when
they
are
activated
by
FA
and
their
derivatives.


In
this
work,
the
effect
of
agonist
activation
of
PPARα,
PPARβ
and
PPARγ
and
long
chain
 fatty
acids
(LCFA),
in
particular
oleic
and
linoleic
acids,
was
studied,
on
the
expression
of
 certain
genes
encoding
myokines
or
genes
involved
in
controlling
myokine
expression.


The
 C2C12
 cell
 line
 or
 murine
 myocytes
 was
 used.
 The
 cells
 were
 grown
 and
 differentiated
 to
 subsequently
 be
 treated
 with
 various
 agonists
 for
 PPARs
 and
 an
 equimolar
 mixture
 of
 oleic
 and
 linoleic
 acid
 alone
 or
 in
 combination
 with
 AICAR
 (an
 activator
 of
 AMP‐activated
 protein
 kinase,
 AMPK).
 The
 RNA
 from
 each
 sample
 was
 isolated
and
purified
and
subsequently
the
expression
level
of
the
genes
of
interest
was
 determined
by
RT‐qPCR.


From
the
data
obtained
in
this
study,
and
considering
that
the
studies
about
the
PPAR
 control
 on
 myokine
 expression
 in
 muscle
 cells
 are
 quite
 novel,
 we
 could
 say
 that
 the
 PPARs
and
LCFA
are
involved
in
the
control
of
the
expression
of
myokines,
especially
in
 the
case
of
interleukin‐6.


















































6

Abreviaturas
 


PPARs:
Receptores
activados
por
proliferadores
peroxisomales
 


PPARα:
Receptor
activado
por
proliferadores
peroxisomales
alfa
(Peroxisome
proliferator­

activated
receptor­α)

 


PPARβ:
Receptor
activado
por
proliferadores
peroxisomales
beta
(Peroxisome
proliferator­

activated
receptor­β)
 


PPARγ:
Receptor
activado
por
proliferadores
peroxisomales
ganma
(Peroxisome
proliferator–

activated
receptor­γ)

 


AG:
Ácidos
Grasos

 


AGCL:
Ácidos
grasos
de
cadena
larga
 


PGC1α:
Co‐activador
1
alfa
del
PPARγ
(Peroxisome
proliferator­activated
receptor
ganma
 coactivator
1­alpha)





IL­6:
Interleuquina
6
(Interleukin­6)
 


FNDC5:
Proteína
5
que
contiene
el
dominio
III
tipo
fibronectina
(Fibronectin
type
III
domain­

containing
protein
5),
precursora
de
la
Irisina.





IL­15:
Interleuquina
15
(interleukin­15)





AMP:
Adenosín
monofosfato
 


AMPK:
Proteína
quinasa
activada
por
AMP















































7

1.
Introducción
 



El
 músculo
 esquelético
 es
 conocido
 como
 músculo
 voluntario,
 debido
 a
 su
 capacidad
 para
 realizar
 movimientos
 conscientes.
 Las
 células
 que
 componen
 el
 músculo
 esquelético
 son
 las
 conocidas
fibras
musculares
o
miocitos
(1).
Las
fibras
musculares
son
células
muy
alargadas
que
 se
disponen
en
paralelo
formando
haces
o
láminas.
Éstas
son
multinucleadas,
encontrándose
los
 núcleos
distribuidos
en
la
periferia
celular
(1).
Las
fibras
musculares
están
delimitadas
por
una
 membrana
 (sarcolema)
 y
 contienen
 en
 su
 citoplasma
 (sarcoplasma)
 unas
 miofibrillas
 responsables
de
la
contracción
muscular.







 El
 músculo
 esquelético
 presenta
 diferentes
 funciones,
 como
 son
 la
 excitabilidad,
 contractibilidad,
elasticidad
y/o
plasticidad
entre
otras.
Para
que
todas
están
funciones
puedan
 llevarse
a
cabo,
es
de
gran
importancia
el
buen
funcionamiento
del
sistema
nervioso
(2).





El
músculo
esquelético
también
tiene
un
papel
importante
como
secretor
y
liberador
de
 unos
 péptidos
 denominados
 mioquinas.
 Éstas
 proteínas
 pueden
 desempeñar
 acciones
 autocrinas,
 paracrinas
 y
 endocrinas.
 Hay
 mioquinas
 que
 presentan
 una
 elevada
 expresión
 durante
el
ejercicio
físico
y
contribuyen
al
mantenimiento
de
la
homeostasis
metabólica(3,
4).
La
 mayoría
de
estas
mioquinas,
relacionan
el
ejercicio
físico
con
diferentes
propiedades
fisiológicas
 saludables
 como,
 por
 ejemplo,
 la
 regulación
 del
 sistema
 inmune(5)
 .Las
 más
 importantes
 de
 éstas
mioquinas
conocidas
son
las
interleuquinas
6,
8
y
15
e
Irisina
(6).







 Además
de
órgano
secretor,
en
el
músculo
esquelético
tiene
lugar
la
oxidación
de
ácidos
 grasos
y
glucosa,
lo
que
permite
determinar
ciertos
parámetros
del
metabolismo
del
organismo.


(7).






 Con
 este
 trabajo,
 se
 ha
 querido
 estudiar
 el
 efecto
 de
 diferentes
 compuestos
 sobre
 el
 metabolismo
 de
 células
 musculares
 determinando
 cómo
 afectan
 en
 la
 expresión
 de
 genes
 importantes
del
metabolismo
energético
y
de
mioquinas.
Por
ello,
se
ha
estudiado
el
papel
de
los
 receptores
 activados
 por
 proliferadores
 peroxisomales
(PPARs)
 y
 ácidos
 grasos
 de
 cadena
 larga
 (AGCL).
Esto
se
debe
a
que
los
ácidos
grasos
(y
sus
derivados)
regulan
la
expresión
de
genes
a
 través
de
los
PPARs
(44).






 Podemos
 definir
 a
 los
 PPARs
 como
 receptores
 nucleaares
 (y,
 por
 tanto,
 factores
 de
 transcripción)
 que
 regulan
 genes
 importantes
 en
 la
 diferenciación
 celular
 y
 varios
 procesos
 metabólicos,
 especialmente
 en
 la
 homeostasis
 de
 lípidos
 y
 glúcidos.
 Los
 PPARs
 presentan
 una
 estructura
tridimensional
basada
en
un
dominio

de
unión
del
DNA
en
el
extremo
N‐terminal
y
 en
 un
 dominio
 de
 unión
 al
 ligando,
 en
 el
 extremo
 C‐terminal. La
 función
 de
 los
 PPARs
 
 se
 modifica
 por
 una
 serie
 de
 co‐activadores
 y
 co‐represores
 ,
 la
 presencia
 de
 los
 cuales
 puede
 estimular
o
inhibir
la
función
del
receptor
respectivamente.
Estos
receptores
realizan
diferentes
 actividades,
principalmente
a
través
de
ligandos
endógenos
producidos
en
las
vías
metabólicas
 de
los
ácidos
grasos
y
por
ello
se
denominan
sensores
de
lípidos.
Los
PPARS
tienen
diferentes
 propiedades,
diferentes
perfiles
de
distribución
y
diferentes
perfiles
de
expresión
génica(8)
.
Los
 PPARs
 son
 cruciales
 en
 la
 regulación
 del
 metabolismo
 muscular,
 ya
 que
 pueden
 redirigir
 el
 metabolismo
cuando
son
activados
por
los
ácidos
grasos
(AG)
y
sus
derivados
(9).


Los
 PPARs
 presentan
 tres
 isoformas
 diferentes:
 Peroxisome
 proliferator­activated
 receptor­α
 (PPARα);
 
 Peroxisome
 proliferator­activated
 receptor­β(PPARβ)
 y
 Peroxisome
 proliferator–activated
receptor­γ
(PPARγ).
Estos
tres
isotipos
difieren

según
su
distribución

en
 el
 tejido,
 sus
 ligandos
 específicos
 y
 sus
 funciones
 fisiológicas,
 aunque
 los
 tres
 subtipos
 se
 encuentran
en
las
células
musculares.
Cada
uno
de
ellos,
activa
o
suprime
diferentes
genes
(8).





El
PPARα
fue
el
primer
miembro
identificado
de
la
familia
de
los
PPARs.
Está
altamente
 expresado
en
el
hígado,
músculo
esquelético,
corazón
y
riñones,
todos
ellos
tejidos
con
un
alto
 grado
 de
 oxidación
 de
 AG
 (11).
 Su
 expresión
 está
 regulada
 por
 numerosos
 estímulos
 como
 el
 estrés,
la
liberación
de
insulina
o
la
liberación
de
leptina
en
el
tejido
adiposo
(10).
Este
receptor


8

está
 altamente
 involucrado
 en
 el
 metabolismo
 de
 AG
 y
 su
 activación
 disminuye
 los
 niveles
 de
 lípidos.
Si
 la
 concentración
 de
 ácidos
 grasos
 aumenta,
 se
 activa
 el
 PPARα
 y
 capta
 las
 formas
 oxidadas
de
estos
ácidos.
Por
el
contrario,
una
disminución
en
la
concentración
de
ácidos
grasos
 provoca
una
disminución
en

la
activación
del
PPAR
α
y
por
lo
tanto
una
reducción
en
la
quema
 de
energía(8).





El
PPARβ
es
el
PPAR
menos
estudiado
en
la
actualidad
(8).
Se
expresa
en
la
mayoría
de
 los
tejidos
(10).
Sin
embargo,
su
presencia
es
muy
abundante
en
hígado,
intestino,
riñón,
tejido
 adiposo
abdominal
y
el
músculo
esquelético,
tejidos
que
están
involucrados
en
el
metabolismo
 lipídico
(8).En
cuanto
a
su
función
en
el
músculo
esquelético,
se
basa
en
el
transporte
de
AG
y
su
 posterior
 oxidación
 mitocondrial,
 termogénesis
 y
 metabolismo
 oxidativo.
 En
 cuanto
 a
 su
 expresión
 en
 el
 músculo
 esquelético,
 el
 PPAR β
 presenta
 unos
 niveles
 entre
 10
 y
 50
 veces
 superiores
 que
 PPAR
 α
 y
 PPARγ,
 respectivamente

(10).

El
 PPARβ
 
 se
 encuentra
 fuertemente
 asociado
con
el
PGC1α
y
se
le
considera
como
el
máximo
regulador
de
la
oxidación
de
los
ácidos
 grasos
y
consumo
de
energía
en
el
músculo
esquelético
(11).





El
 PPARγ
 se
 expresa
 en
 el
 intestino
 grueso
 y
 el
 bazo,
 pero
 podemos
 encontrarlo
 mayoritariamente
 en
 el
 tejido
 adiposo
 marrón
 y
 blanco,
 donde
 juega
 un
 papel
 clave
 en
 la
 adipogénesis,
el
balance
energético
y
la
biosíntesis
lipídica.
En
el
músculo
esquelético,
evita
la
 acumulación
 de
 lípidos,
 permitiendo
 de
 esta
 manera
 una
 adecuada
 funcionalidad
 del
 músculo
 (8).
La
activación
de
PPARγ
produce
una
disminución
de
la
secreción
de
citoquinas,
como
la
IL‐6
 (10).
 





Centrándonos
a
continuación
en
los
AGCL,
podemos
definirlos
como
aquellos
lípidos
que
 presentan
 entre
 13
 y
 27
 carbonos,
 siendo
 los
 más
 comunes
 los
 que
 presentan
 de
 16
 a
 18
 carbonos.
 Su
 síntesis
 endógena
 tiene
 lugar
 en
 el
 retículo
 endoplasmático
 y
 las
 mitocondrias
 mediante
 las
 elongasas,
 encargadas
 de
 añadir
 unidades
 de
 dos
 carbonos
 a
 la
 cadena
 de
 ácido
 palmítico
 (C16),
 mientras
 que
 los
 AGCL
 exógenos
 son
 adquiridos
 a
 partir
 de
 la
 dieta.
 Podemos
 clasificarlos
 según
 su
 grado
 de
 saturación
 en
 saturados,
 monoinsaturados
 (presentando
 únicamente
1
enlace
doble)
o
poliinsaturados
(presentado
2
ó
más
dobles
enlaces)
(12).
Son
los
 ácidos
grasos
más
abundantes
en
los
seres
humanos,
de
los
cuales
destacan
el
ácido
palmítico
 (C16)
y
ácido
oleico
(C18)
debido
a
su
presencia
en
la
gran
mayoría
de
grasas
(13).





Para
nuestro
trabajo,
se
decidió
utilizar
ácido
oleico
y
ácido
linoleico,
siendo
cada
uno
de
 ellos
un
ejemplo
de
ácido
graso
monoinsaturado
y
ácido
graso
poliinsaturado
respectivamente,
 debido
a
que
en
estudios
previos
se
pudieron
observar
efectos
sobre
la
expresión
de
la
IL6
(45).





El
ácido
oleico
es
un
ácido
graso
ω‐9‐monoinsaturado
que
fue
descubierto
por
Svanborg
 en
 el
 año
 1990
 (14).
 Es
 conocido
 por
 sus
 efectos
 beneficiosos
 sobre
 la
 salud
 cardiovascular
 y
 hepática.
Aumenta
el
colesterol
HDL
y
reduce
el
colesterol
LDL
en
sangre,
ejerciendo
una
acción
 beneficiosa
 y
 reduciendo
 las
 probabilidades
 de
 padecer
 enfermedades
 cardiovasculares
 (15).


Aparte
de
su
función
como
sustrato
energético,
su
principal
papel
en
el
músculo
esquelético
es
la
 mejora
de
la
sensibilidad
a
la
insulina
y
su
protección
frente
a
la
resistencia
a
esta
hormona
(16).





















Fig
1.
Estructura
química
del
ácido
oleico
(17)
 
 








 
 


9

En
 cuanto
 al
 ácido
 linoleico,
 es
 un
 ácido
 graso
 ω‐6‐poliinsaturado
 que
 fue
 descubierto
 por
 Michael
 W.
 Pariza
 en
 1978
 (18).
 Se
 le
 conoce
 como
 un
 ácido
 graso
 esencial,
 debido
 a
 que
 nuestro
organismo
es
incapaz
de
sintetizarlo
y
debe
ser
consumido
por
la
dieta,
formando
parte
 de
 los
 triacilgliceroles
 (19).
 Además
 de
 su
 efecto
 conocido
 como
 reductor
 de
 grasa
 corporal,
 también
se
sabe
que
posee
un
papel
importante
en
la
mejora
de
la
actividad
física
aportando
una
 mayor
resistencia
en
el
desarrollo
de
la
misma.
Se
cree
que
los
efectos
producidos
por
el
ácido
 linoleico
son
consecuencia
de
cambios
fisiológicos
producidos
en
el
músculo
esquelético,
aunque
 su
mecanismo
de
acción
aún
esté
en
estudio.
Se
cree
que
el
ácido
linoleico
produce
un
aumento
 en
la
expresión
del
gen
PGC1α
(20).












Fig
2.
Estructura
química
del
ácido
linoleico
(21)
 
 


Así
pues,
el
tratamiento
de
las
células
musculares
diferenciadas
con
distintos
agonistas
 de
 los
 PPARs
 y
 con
 AGCL,
 solos
 o
 combinados
 con
 Aicar,
 ha
 despertado
 nuestro
 interés
 para
 poder
estudiar
y
observar
el
posible
efecto
que
pueden
tener
sobre
la
expresión
de
diferentes
 genes
codificantes
de
mioquinas
y
del
que
codifica
el
co‐activador
transcripcional
PGC1α,
capaz
 de
interactuar
con
los
PPARs,
debido
a
los
efectos
observados
en
estudios
previos.
Por
tanto,
los
 genes
de
interés
en
este
estudio
han
sido
el
PGC1α,
IL6,
FNDC5
e
IL15.





La
PGC1α
o
(Peroxisome
proliferator­activated
receptor
ganma
coactivator
1­alpha),
es
un
 coactivador

involucrado
en
la
regulación
transcripcional
de
múltiples
genes.
Tiene
la
capacidad
 de
 aumentar
 considerablemente
 la
 actividad
 transcripcional
 del
 PPARγ,
 jugando
 un
 papel
 importante
en
la
modulación
de
genes
relacionados
con
el
metabolismo
de
hidratos
de
carbono
 y
 de
 AG
 entre
 otras
 muchas
 funciones
 (22).
 Se
 trata
 de
 un
 importante
 regulador
 en
 la
 determinación
 de
 fibra
 muscular,
 además
 de
 verse
 involucrado
 en
 el
 mantenimiento
 de
 la
 presión
arterial,
desarrollo
de
la
obesidad
o
regulación
homeostática
del
colesterol
celular
entre
 otros
(23).
Este
factor
transcripcional
presenta
una
abundante
expresión
en
aquellos
tejidos
que
 presentan
 una
 mayor
 demanda
 en
 la
 producción
 de
 energía,
 como
 el
 músculo.
 
 Diferentes
 estímulos
producen
un
aumento
de
la
expresión
del
PGC1α
en
estos
tejidos,
como
son
el
frío,
o
el
 ejercicio
en
el
músculo
esquelético
(24).
Diferentes
estudios
han
demostrado
que
hay
diferencias
 en
la
concentración
de
PGC1α
entre
los
diferentes
tipos
de
fibras
musculares
(22).
En
el
músculo
 esquelético,
la
mayor
expresión
de
este
factor
transcripcional
se
produce
en
aquellas
fibras
que
 sufren
 contracción
 lenta,
 debido
 a
 que
 a
 su
 vez
 son
 las
 fibras
 más
 oxidativas
 (24).
 Diferentes
 estudios
en
animales
han
demostrado
que
el
ejercicio
y
el
entrenamiento
de
resistencia
a
corto
 plazo
 podrían
 activar
 la
 expresión
 del
 PGC1α
 en
 el
 músculo
 esquelético.
 Además,
 se
 ha
 comprobado
que
la
expresión
de
este
factor
transcripcional
permite
llevar
a
cabo
la
contracción
 lenta
del
músculo
esquelético
y
a
su
vez,
jugar
un
papel
en
la
adaptación
estructural
del
músculo
 esquelético
al
ejercicio
(24).
Así
mismo,

hay
que
destacar
el
papel
del
PGC1α
como
regulador
del
 metabolismo
de
la
glucosa
en
el
músculo,
donde
una
inhibición
de
la
oxidación
de
la
glucosa
y
 una
mayor
captación
por
parte
del
músculo
es
eficaz
para
almacenar
nuevamente
reservas
de
 glucógeno
 recuperando
 cantidad
 perdida
 durante
 el
 ejercicio
 y
 preparar
 de
 esta
 manera
 al
 músculo
 para
 realizar
 de
 nuevo
 un
 ejercicio
 intenso
 (24).
 La
 proteína
 quinasa
 activada
 por
 adenosín
monofosfato
(AMPK)
,
importante
en
la
estimulación
de
la
oxidación
de
AG
y
activada,
 entre
 otros
 factores,
 por
 el
 ejercicio
 físico,
 es
 una
 importante
 reguladora
 de
 la
 actividad
 del
 PGC1α
en
el
músculo
(25).





10

La
 IL6
 o
 (Interleuquina
 6),
es
 una
 citoquina
 del
 tipo
 1
 producida
 en
 diferentes
 tejidos,
 siendo
el
tejido
adiposo,
el
músculo
esquelético
y
el
sistema
inmune
los
más
abundantes
(26).
La
 IL6
 posee
 receptores
 especialmente
 en
 el
 tejido
 adiposo,
 el
 hígado
 y
 el
 músculo
 esquelético,
 jugando
en
este
último
un
papel
importante,
mejorando
considerablemente
la
sensibilidad
a
la
 insulina
 y
 la
 gluconeogénesis
 (5).
 Además,
 en
 el
 músculo
 presenta
 un
 papel
 importante
 antiinflamatorio,
 produciendo
 efectos
 saludables
 para
 el
 organismo(26).
 Puede
 actuar
 de
 manera
autocrina
,
paracrina
y
endocrina,
afectando
al
peso
corporal,
homeostasis
energética
y,
 cómo
 se
 ha
 mencionado
 con
 anterioridad,
 a
 la
 sensibilidad
 a
 la
 insulina
 (27).
 Por
 otro
 lado,
 la
 producción
 de
 IL6
 tiene
 una
 fuerte
 relación
 con
 el
 ejercicio
 físico,
 incrementando
 
 sus
 concentraciones
plasmáticas
hasta
100
veces
durante
el
mismo
(28).
Su
expresión
tiene
lugar
en
 las
fibras
musculares
al
inicio
del
ejercicio
y
se
libera
al
músculo
durante
la
actividad
física
(27).


La
IL6
tiene
un
papel
importante
en
la
producción
de
glucosa
endógena
en
el
músculo
durante
el
 ejercicio
físico
(4).
Presenta
una
destacada
relación
con
la
proteína
quinasa
AMPK.
Un
aumento
 de
la
IL6
produce
un
incremento
de
la
actividad
de
la
AMPK,
estimulando
la
oxidación
de
AG
y
 promoviendo
 la
 absorción
 de
 glucosa.
 La
 IL6
 presenta
 una
 alta
 tasa
 de
 transcripción
 en
 comparación
 con
 otros
 genes
 del
 músculo,
 siendo
 éstos
 modulados
 por
 la
 presencia
 de
 carbohidratos,
 lo
 que
 permite
 considerar
 que
 la
 IL6
 es
 capaz,
 al
 igual
 que
 la
 AMPK,
 de
 actuar
 como
un
sensor
de
disponibilidad
energética(29,
30).





La
FNDC5
o
(proteína
5
que
contiene
el
dominio
III
tipo
fibronectina)
fue
descubierta
en
el
 2002
 mientras
 se
 buscaban
 los
 dominios
 de
 la
 fibronectina
 tipo
 III
 (31).
 Al
 producirse
 un
 aumento
del
ejercicio,
se
incrementaba
la
expresión
en
el
músculo
de
PGC1α
y
este
incremento
 del
 PGC1α
 provoca
 la
 producción
 de
 la
 proteína
 FNDC5,
 la
 cual
 se
 trocea
 dando
 lugar
 a
 una
 proteína
 mucho
 más
 pequeña
 conocida
 como
Irisina,
que
 es
 secretada
(32).
 Debido
 a
 que
 la
 Irisina
es
producida
mediante
un
mecanismo
iniciado
por
contracción
muscular,
está
clasificada
 como
mioquina
(5).
Boström
et
al.
propusieron
que
la
Irisina
y
su
precursor,
la
FNDC5,
inducían
 la
 conversión
 de
 adipocitos
 blancos
 a
 marrones
 y
 un
 papel
 importante
 en
 la
 inducción
 a
 la
 termogénesis
 (33).
 Otros
 estudios
 revelaron
 que
 una
 sobreexpresión
 de
 los
 niveles
 de
 FNDC5
 impedía
 la
 acumulación
 de
 grasa
 en
 ratones
 (34).
 Finalmente
 otros
 estudios
 han
 demostrado
 que
la
Irisina
produce
efectos
beneficiosos
en
el
cerebro.
Esto
se
produce
debido
a
que
después
 de
 largos
 periodos
 de
 ejercicio
 físico,
 el
 PGC1α
 es
 incrementado
 en
 el
 músculo
 y
 estimula
 la
 producción
de
FNDC5,
que
se
libera
en
forma
de
Irisina
al
torrente
sanguíneo,
la
cual
provoca
la
 expresión
 de
 determinadas
 proteínas
 cerebrales
 encargadas
 de
 las
 funciones
 de
 memoria,
 aprendizaje
y
manejo
espacial
(35).





La
IL15

o
 (Interleucina
 15)
es
 una
 citoquina
 del
 tipo
 4
 descubierta
 en
 1994
 por
 dos
 laboratorios
diferentes
y
se
caracterizó
por
ser
el
factor
de
crecimiento
de
las
células
T
(36).
Se
 expresa
en
un
gran
número
de
células
y
tejidos,
incluyendo
monocitos,
macrófagos,
fibroblastos,
 o
 células
 nerviosas
 (37).
 Como
 citoquina
 de
 tipo
 4
 (producidas
 por
 linfocitos
 Th2),
 juega
 un
 papel
importante
en
la
inmunidad
innata
y
adaptativa
(38).
Haciendo
referencia
al
ejercicio,
la
 IL15
 se
 expresa
 de
 manera
 abundante
 durante
 los
 entrenamientos
 para
 ejercitar
 la
 fuerza
 muscular
(5).
En
el
músculo
esquelético,
inhibe
la
degradación
proteica,
estimula
la
captación
de
 glucosa
y
facilita
la
oxidación
de
AG,
representando
un
fuerte
estímulo
anabólico
(39).
En
otros
 órganos
 y
 tejidos
 como
 el
 tejido
 adiposo,
 contribuye
 a
 la
 lipólisis
 y
 a
 la
 inhibición
 en
 la
 diferenciación
de
los
preadipocitos,
produciendo
una
reducción
del
tejido
adiposo
(40).
Debido
a
 los
efectos
beneficiosos,
se
ha
llegado
a
considerar
a
la
IL15
como
una
opción
terapéutica
para
el
 tratamiento
de
la
obesidad
(41).




 
 


Se
ha
considerado
oportuno
introducir
en
este
estudio
el
AICAR,
ya
que
es
un
activador
 de
la
AMPK
y
un
mimetizador
del
ejercicio
(9),
para
poder
observar
el
efecto
que
tiene
por
si
 sólo
con
las
células
C2C12
en
la
expresión
de
mioquinas
y
PGC1α
y
principalmente
el
efecto
que
 ejerce
en
combinación
con
los
PPARs
y
los
AGCL.


11

El
AICAR,
dentro
de
la
célula
se
metaboliza
a
un
análogo
de
la
AMP,
capaz
de
estimular
a
 la
proteína
quinasa
activada
por

AMP
(AMPK)
(42).
Es
capaz
de
simular
los
efectos
del
ejercicio
 físico
 en
 el
 metabolismo,
 produciendo
 de
 esta
 manera
 una
 serie
 de
 efectos
 beneficiosos
 sobre
 enfermedades
 como
 la
 obesidad
 o
 la
 hipertensión.
 Además,
 aumenta
 la
 utilización
 de
 grasas
 como
fuente
de
energía,
la
expresión
de
proteínas
regeneradoras
del
tejido
muscular,
etc.
Otro
 efecto
 producido
 por
 el
 AICAR,
 es
 la
 capacidad
 de
 aumentar
 la
 captación
 de
 glucosa
 antes
 y
 después
 de
 la
 realización
 de
 ejercicio
 (43).
 Actualmente,
 este
 fármaco
 se
 utiliza
 como
 tratamiento
para
la
diabetes,
produciendo
un
aumento
de
la
actividad
metabólica
y
cambiando
 la
composición
física
del
músculo
(44).











Fig
3.
Estructura
química
del
AICAR(42)
 
 


A

partir
de
la
información
obtenida
y
consultada,
y
teniendo
en
cuenta
la
importancia
 del
músculo
esquelético
en
cuanto
a
la
disposición
de
energía,
así
como
el
efecto
de
los
PPARs
y
 AGCL
sobre
el
músculo,
con
este
estudio
se
quiere
estudiar
el
posible
efecto
que
tienen
los

AGCL
 el
AICAR
y
la
activación
de
los
PPARs
(mediante
agonistas)
en
células
musculares
diferenciadas
 (miotubos)
sobre
la
expresión
de
mioquinas
y
PGC1α,
importantes
en
el
metabolismo
energético
 muscular.













































12

2.
Objetivos


Los
objetivos
principales
que
van
a
desarrollarse
en
este
trabajo
son:





‐ Adquirir
 conocimientos
 y
 aprender
 a
 realizar
 cultivos
 de
 células
 C2C12,
 tratadas
 con
 diferentes
 tratamientos:
 AICAR;
 ácidos
 grasos
 de
 cadena
 larga
 (AGCL)
 (ácido
 oleico
 y
 ácido
linoleico)

y
diferentes
agonistas
de
PPARs
(PPARα,
PPARβ
y
PPARγ);
extracción
y
 purificación
de
RNA
y
el
análisis
de
los
datos
obtenidos.





‐ Describir
los
diferentes
tratamientos
utilizados
y
su
papel
en
las
células
musculares,
así
 como
en
la
expresión
de
determinados
genes.





‐ Conocer
y
acostumbrarse
al
manejo
de
las
diferentes
técnicas
en
los
cultivos
celulares,
 familiarizarse
con
la
maquinaria
y
el
material
de
un
laboratorio
de
biología
molecular
y
 aprender
a
analizar
los
datos
obtenidos
mediante
la
ayuda
de
programas
estadísticos.





‐ Aprender
 cómo
 realizar
 un
 diseño
 
 experimental
 y
 llevar
 a
 término
 un
 trabajo
 de
 investigación
 y
 aprender
 a
 extraer
 conclusiones
 de
 los
 resultados
 obtenidos
 y
 a
 solucionar
 los
 problemas
 que
 se
 puedan
 plantear
 en
 el
 trascurso
 del
 mismo
 de
 una
 manera
adecuada
y
profesional.





‐ Profundizar
 en
 el
 conocimiento
 de
 los
 efectos
 de
 la
 activación
 de
 los
 PPARs
 sobre
 la
 producción
de
mioquinas
y
la
expresión
del
PGC1α.






























































13




3.Diseño
experimental
:
materiales
y
métodos
 


3.1
Diseño
experimental




Para
llevar
a
cabo
el
estudio,
se
utilizó
un
stock
de
células
musculares
de
ratón
procedentes
del
 laboratorio
 de
 Biología
 Molecular,
 Nutrición
 y
 Biotecnología
 de
 la
 Universidad
 de
 las
 Islas
 Baleares,
obtenidas
de
la
casa
comercial
ATCC

(American
Type
Culture
Collection).
Estas
células
 musculares,
 conocidas
 como
 C2C12,
 habían
 sido
 conservadas
 con
 crioprotectores
 en
 un
 contenedor
de
nitrógeno
líquido
para
el
mantenimiento
de
un
estado
óptimo.


Ya
en
el
laboratorio,
tuvo
lugar
el
inicio
del
experimento,
mediante
la
descongelación
de
 las
 células,
 lo
 que
 nos
 permitió
 realizar
 el
 cultivo
 celular
 adecuadamente
 y
 observar
 la
 diferenciación
 y
 el
 crecimiento
 de
 las
 mismas
 para
 finalmente
 aplicarles
 el
 tratamiento
 estimado.
 Durante
 el
 proceso
 de
 cultivos,
 una
 vez
 alcanzada
 la
 confluencia
 celular
 óptima,
 se
 aplicaron
los
tratamientos
basados
en
la
utilización
de
agonistas
de
los
PPARs:
PPARα
,
PPARβ

y
 PPARγ,
 y
 ácidos
 grasos
 de
 cadena
 larga
 (AGCL),
 concretamente
 Oleico
 y
 Linoleico,
 en
 combinación
o
no
con
Aicar.


Realizado
el
tratamiento,
se
llevó
a
cabo
la
purificación
y
extracción
de
ARN
celular
y
tras
 la
 comprobación
 de
 la
 calidad
 del
 mismo,
 se
 inició
 un
 análisis
 para
 poder
 determinar
 la
 expresión
de
diferentes
genes
(PGC1α,
IL6,
FNDC5
y
IL15)
mediante
retrotranscripción
seguida

 de
una
reacción
en
cadena
de
la
polimerasa
a
tiempo
real
(RT‐qPCR).


Los
datos
obtenidos
fueron
analizados
y
están
explicados
en
el
apartado
de
resultados
y
 discusión,
mediante
la
ayuda
de
programas
estadísticos.


Cultivo
de
líneas
celulares
C2C12
y
diferenciación
a
miotubos
 


A
continuación,
se
reflejan
los
pasos
seguidos
en
el
protocolo,
que
se
explican
con
más
detalle
en
 los
anexos.














3.2
Descongelación
de
las
células


Recogemos
un
vial
de
células
del
tanque
de
nitrógeno
líquido
y
se
coloca
en
un
baño
con
agua
a
 una
 temperatura
 de
 37ºC
 
para
 comenzar
 la
 descongelación.
 Una
 vez
 se
 tengan
 las
 células
 descongeladas,
se
debe
limpiar
de
manera
adecuada
el
vial
con
etanol
al
70%
para
evitar
de
esta
 manera
 todo
 riesgo
 de
 contaminación
 de
 las
 células.
 Durante
 todo
 el
 proceso
 de
 cultivo
 es
 importante
 evitar
 todo
 tipo
 de
 contaminación,
 por
 ello
 se
 deben
 mantener
 las
 
condiciones
 asépticas.









Se
continúa
con
la
centrifugación
del
vial
y
se
le
añade
9
ml
de
medio
de
cultivo
completo
 caliente
(37º),

poco
a
poco,
evitando
de
esta
manera
que
se
produzca
un
choque
osmótico.
Una
 vez
finalizada
la
centrifugación,
se
descarta
el
sobrenadante
y
se
resuspende
el
precipitado
con
 medio
de
cultivo
fresco,
a
continuación
cogemos
una
pequeña
alícuota
para
realizar
el
contaje
de
 las

células.









 De
 forma
 general,
 podemos
 contabilizar
 aproximadamente
 unas
 7000
 células/cm²
 teniendo
 en
 cuenta
 únicamente
 las
 células
 vivas.
 Posteriormente
 se
 trasladan
 a
 un
 recipiente
 adecuado
para
incubar
las
células.
Pasado
un
periodo
de
incubación
de
24h
en
una
estufa
con
un
 5%
 de
 CO2,
 se
 elimina
 completamente
 el
 GM
 (medio
 de
 crecimiento)
 y
 se
 añade
 medio
 completamente
fresco.


Se
dejan
cultivar
las
células
hasta
que
alcancen
el
50%
de
la
confluencia,
momento
en
el
 que
se
iniciará
la
división
del
cultivo
en
diferentes
subcultuivos.
(ANEXO
1)



 





 


14

3.3.
Subcultivos
de
células
C2C12





A
 partir
 de
 este
 momento,
 es
 muy
 importante
 evitar
 que
 las
 células
 lleguen
 al
 100%
 de
 la
 confluencia,
 por
 ello,
 se
 debe
 dividir
 en
 diferentes
 viales
 el
 cultivo
 general
 una
 vez
 éste
 haya
 alcanzado
 el
 50%
 de
 la
 confluencia.
 De
 esta
 forma,
 se
 asegura
 una
 correcta
 diferenciación
 y
 desarrollo
 de
 las
 células.
 Para
 ello,
 iniciamos
 la
 división
 del
 cultivo
 general
 en
 diferentes
 subcultivos
 con
 la
 eliminación
 del
 medio
 del
 cultivo
 antiguo
 y
 limpiamos
 las
 células
 con
 PBS.


Dividimos
 el
 cultivo
 en
 8
 placas
 de
 12
 pocillos
 cada
 una,
 ya
 que
 realizamos
 el
 estudio
 por
 cuadruplicado,
habiendo
un
duplicado
o
triplicado
de
cada
tratamiento
dependiendo
de
la
placa
 tratada.
 Colocamos
 2
 ml
 de
 tripsina_EDTA
 al
 0,05%
 y
 la
 dejaremos
 actuar
 unos
 minutos
 para
 poder
 despegar
 las
 células
 del
 fondo.
 Con
 el
 mismo
 volumen
 de
 medio
 fresco
 bloqueamos
 la
 acción
 de
 la
 tripsina
 y
 resuspendemos
 el
 precipitado
 de
 células
 en
 un
 volumen
 adecuado
 de
 medio
fresco.
Repartimos
de
forma
equitativa
las
células
en
los
pocillos
e
incubaremos
las
placas
 a
37ºC,
cambiando
el
70%
del
medio
cada
dos
días.
(ANEXO
2)





3.4
Diferenciación
de
las
células
C2C12
a
miotubos
 


Una
 vez
 se
 haya
 alcanzado
 un
 número
 suficiente
 y
 adecuado
 de
 células,
 normalmente
 cuando
 éstas
 han
 alcanzado
 el
 50%
 de
 su
 confluencia,
 se
 inicia
 el
 proceso
 de
 diferenciación
 celular
 a
 miotubos.
 Comenzamos
 con
 la
 eliminación
 completa
 del
 medio
 de
 cultivo,
 para
 seguir
 con
 un
 lavado
 de
 PBS.
 A
 lo
 largo
 del
 proceso,
 se
 va
 renovando
 el
 70%
 del
 medio,
 añadiendo
 medio
 nuevo,
el
cual
está
suplementado
con
Arabinocid‐C,
la
función
del
cual
consiste
en
provocar
la
 apoptosis
de
las
células
aún
en
división.
A
partir
del
quinto
día
de
diferenciación
se
trataran
las
 células.
En
nuestro
estudio
utilizaremos
como
tratamientos
los
distintos
agonistas
de
los
PPARs
 (PPARα,
 PPARβ
 y
 PPARγ)
 y
 una
 combinación
 de
 ácidos
 grasos
 de
 cadena
 larga
 (AGCL),
 concretamente
Oleico
y
Linoleico
y
AICAR
.


Después
 de
 3
 horas
 de
 haber
 aplicado
 los
 tratamientos,
 se
 recogerán
 las
 células
 para
 su
 posterior
extracción
del
ARN.
(ANEXO
3)
















3.5
Tratamientos
utilizados
durante
la
diferenciación
de
las
células
C2C12
 


En
el

quinto
y
último

día
del
proceso
de
diferenciación
se
aplicarán
los
diferentes
tratamientos
 a
 las
 células.
 Disponemos
 de
 seis
 placas,
 cada
 una
 de
 ellas
 con
 12
 pocillos.
 Tres
 placas
 fueron
 tratadas
 con
 un
 único
 tratamiento
 
y
 las
 otras
 dos
 con
 una
 combinación
 de
 los
 diferentes
 tratamientos.
Los
diferentes
tratamientos
fueron
aplicados
durante
3h
en
todas
las
placas
(45)


En
 las
 placas
 donde
 se
 aplicaron
 los
 tratamientos
 sin
 combinar,
 dos
 de
 los
 pocillos
 fueron
 controles,
 por
 lo
 que
 no
 se
 les
 aplico
 ningún
 tratamiento.
 Mientras,
 que
 al
 resto
 de
 pocillos,
se
le
añadieron
los
pertinentes
tratamientos.


En
 la
 siguiente
 imagen
 quedan
 reflejados
 los
 diferentes
 tratamientos
 aplicados
 y
 su
 distribución
y
combinación
durante
el
proceso:





15


 





Fig
 4
 .Representación
 de
 las
 placas
 de
 12
 pocillos
 con
 la
 distribución
 de
 los
 diferentes
 tratamientos
 en
 solitario,
cada
uno
de
ellos
por
duplicado
tras
3h
de
tratamiento.
Nomenclatura:
C:
control;
AGCL:
mezcla
 equimolar
 ácidos
 oleico/linoleico;
 WY‐14.643
 :
 Peroxisome
 proliferator‐activated
 receptor‐α
 agonist;


GW0742:
 Peroxisome
 proliferator‐activated
 receptor‐β
 agonist;
 Rosi
 (rosiglitazona):
 Peroxisome
 proliferator–activated
receptor‐γ
agonist.
Las
concentraciones
finales
de
cada
tratamiento
fueron:
Aicar:


500µM;
FFA:
700µm;
WY:
50µM;
GW:
100nM;
Rosi:
0,5µM.






En
 las
 placas
 donde
 se
 aplicaron
 los
 tratamientos
 combinados,
 no
 se
 incluyó
 ningún
 pocillo
 control,
 ya
 que
 se
 tomó
 como
 referencia
 el
 de
 las
 placas
 sin
 combinar,
 aplicando
 cada
 combinación
de
tratamientos
por
triplicado.



En
la
siguiente
imagen
quedan
reflejados
los
tratamientos
aplicados
y
su
distribución
y
 combinación
durante
el
proceso:






 


Fig
 5
 .Representación
 de
 las
 placas
 de
 12
 pocillos
 con
 la
 distribución
 de
 los
 diferentes
 tratamientos
 combinados,
 cada
 uno
 de
 ellos
 por
 triplicado
 tras
 3h
 de
 tratamiento.
 Nomenclatura:
 AGCL:
 mezcla
 equimolar
 ácidos
 oleico/linoleico;
 WY‐14.643
 :
 Peroxisome
 proliferator‐activated
 receptor‐α
 agonist;


GW0742:
 Peroxisome
 proliferator‐activated
 receptor‐β
 agonist;
 Rosi:
 Peroxisome
 proliferator–activated
 receptor‐γ
 agonist.
 Las
 concentraciones
 finales
 de
 cada
 tratamiento
 fueron:
 Aicar:
 500µM;
 FFA:
 700µm;


WY:
50µM;
GW:
100nM;
Rosi:
0,5µM
 


16

Las
 concentraciones
 empleadas
 para
 los
 diferentes
 grupos
 de
 tratamientos
 se
 basan
 en
 bibliografía
existente,
ya
que
se
ha
comprobado
que
estas
concentraciones
producen
los
efectos
 deseados
 como
 agonistas
 o
 efectos
 en
 la
 expresión
 de
 genes
 relaciones
 con
 el
 metabolismo
 oxidativo
(45).











3.6
Extracción
y
purificación
del
RNA
 


El
RNA
total
fue
extraído
por
el
método
de
extracción
en
columnas
utilizando
TRK
Lysis
Buffer
 (Kit
 E.Z.N.A^TM.
 Eazy
 Nucleic
 Acid
 Isolation)
 con
 β‐Mercaptoetanol
 según
 las
 indicaciones
 del
 fabricante.
Partimos
directamente
de
las
células
con
el
reactivo
mencionado
anteriormente.
No
 fue
 necesario
 homogeneizar,
 pero
 sí
 romper
 las
 células
 pasándolas
 varias
 veces
 con
 la
 pipeta.


Este
 compuesto
 altera
 la
 estructura
 celular
 y
 desnaturaliza
 las
 nucleasas
 endógenas,
 permitiendo
así
la
extracción
del
RNA
y
su
posterior
purificación.









Una
vez
finalizado
el
proceso
de
extracción
y
purificación
del
RNA,
se
realizó
la
cuantificación
 de
 éste
 para
 determinar
 si
 la
 concentración
 de
 éste
 era
 la
 correcta
 y
 con
 el
 fin
 de
 saber
 si
 la
 extracción
 se
 había
 llevado
 a
 cabo
 correctamente.
 Fue
 cuantificado
 por
 espectofotometría
 utilizando
 el
 espectofotómetro
 NanoDrop
 ND‐1000
 (NanoDrop
 Technologies
 Inc.,
 Wilmington,DE,USA),
 el
 cual
 se
 basa
 en
 la
 absorbancia
 característica
 de
 los
 ácidos
 nucleicos
 a
 una
longitud
de
onda
de
260
nanómetros
(nm).






 Se
 midieron
 diferentes
 ratios,
 uno
 de
 ellos
 a
 230
 nm,
 el
 cual
 nos
 permite
 descartar
 contaminación
por
disolventes
orgánicos,
un
ratio
entre
1,8‐2,2
se
considera
que
la
purificación
 es
correcta,
y
el
otro
ratio
a
280
nm,
que
nos
sirve
para
identificar
contaminación
por
proteínas.


Los
valores
que
consideran
una
purificación
adecuada
basándose
en
este
último
ratio
son
de
2
 para
RNA
y
1,8
para
DNA.
(ANEXO
4)





3.7
 Análisis
 por
 retrotranscripción
 (RT)
 seguida
 de
 reacción
 en
 cadena
 de
 la
 polimerasa
cuantitativa
a
tiempo
real
(qPCR).





Para
poder
analizar
los
niveles
de
expresión
de
los
genes
IL6,
IL15,
FNDC5
y
PGC1α,
utilizamos
 la
técnica
de
la
RT‐qPCR,
en
la
cual
se
realizó
una
retrotranscripción
del
RNA
total
a
su
cDNA
y
 posteriormente
se
amplificó
un
fragmento
específico
mediante
la
q‐PCR
con
el
fin
de
aumentar
 el
número
de
copias.
Para
iniciar
la
RT,
se
utilizó
la
RT
mix,
que
está
formada
por
una
serie
de
 reactivos
los
cuales
nos
permitirán
realizar
la
transcripción
de
la
cadena,
unión
de
los
primers
o
 mejorar
la
eficiencia
de
la
reacción
entre
otros.
Haciendo
hincapié
en
la
PCR,
ésta
se

basa
en
la
 propiedad
natural
del
DNA
polimerasa
para
replicar
las
hebras
del
DNA,
basándose
en
el
uso
de
 ciclos
 a
 altas
 temperaturas
 junto
 con
 ciclos
 a
 bajas
 temperaturas,
 con
 el
 fin
 de
 separar
 las
 cadenas
de
DNA
recién
formadas
tras
cada
proceso
de
replicación.
A
continuación,
las
hebras
de
 DNA
volverán
a
unirse
a
polimerasas
para
volver
a
ser
duplicadas.
Este
proceso
se
realiza
varias
 veces
 de
 manera
 secuencial
 para
 obtener
 un
 gran
 número
 de
 copias.
 En
 nuestro
 estudio
 solo
 utilizamos
la
técnica
de
la
q‐PCR
(PCR
a
tiempo
real),
aunque
existan
diferentes
tipos
de
PCR.






 La
 q‐PCR
 consiste
 en
 hacer
 incidir
 sobre
 las
 muestras
 un
 haz
 de
 luz
 de
 una
 determinada
 longitud
 de
 onda,
 con
 el
 objetivo
 de
 detectar
 la
 fluorescencia,
 debido
 a
 la
 presencia
 de
 fluorocromo
excitado
que
previamente
se
había
introducido
en
la
muestra,
por
acción
del
Power
 SYBR
Green
PCR
Master
Mix
(Applied
Biosystems,
Foster
City,
CA,
USA).
La
reacción
se
produce
 en
 un
 termociclador
 (Step
 One
 Plus
 ™).
 Para
 comprobar
 la
 integridad
 del
 ARN
 se
 realizó
 una
 electroforesis
con
alícuotas
de
las
muestras
en
un
gel
de
agarosa
para
comprobar
que
el
proceso
 se
había
realizado
correctamente
y
que
no
había
presencia
de
contaminación,
se
llevó
a
cabo
una
 curva
de
desnaturalización
después
de
cada
PCR.
El
umbral
de
los
ciclos
se
calculó
a
partir
del
 programa
proporcionado
por
la
casa
comercial
(Step
One
software
2.0)
y
la
expresión
del
mRNA
 se
 calculó
 como
 porcentaje
 respecto
 del
 grupo
 control,
 usando
 como
 gen
 de
 referencia
 el
 que
 codifica
el
rRNA
del
18S
(housekeeping).
(ANEXO
5)



 


17








3.7
Análisis
estadístico





Para
realizar
el
análisis
estadístico
utilizamos
el
programa
SPSS
para
Windows
(SPSS,
Chicago,
 IL,
 USA).
 Las
 diferencias
 entre
 los
 diferentes
 grupos
 se
 obtienen
 mediante
 una
 ANOVA
 de
 un
 factor
seguida
de
un
test
LSD
(Least
Significant
Differences)
como
post‐hoc
análisis.


Los
 resultados
 obtenidos
 están
 expresados
 como
 medias
 ±
 S.E.M
 (error
 típico
 de
 la
 media)
(n=6).

Se
llevaron
a
cabo
comparaciones
entre
los
diferentes
grupos
y
en
todos
los
casos
 se
ha
considerado
estadísticamente
significativo
un
nivel
mínimo
de
probabilidad
inferior
a
0,05
 (p<0,05).



















































































18




4.Resultados


PGC1α
 A


B


En
 la
 fig.6,
 podemos
 observar
 la
 expresión
 del
 gen
 PGC1α
 en
 combinación
 con
 diferentes
 tratamientos.
En
la
gráfica
A,
no
se
observa
significancia
de
los
distintos
tratamientos
respecto
al
 control,
 pero
 sí
 una
 expresión
 significativamente
 menor
 del
 PGC1α
 del
 grupo
 del
 agonista
 del
 PPARβ
 en
 comparación
 con
 el
 grupo
 AICAR
 y
 el
 grupo
 agonista
 del
 PPARγ.
 En
 la
 gráfica
 B,
 podemos
observar
una
inhibición
estadísticamente
significativa
en
la
expresión
de
PGC1α
de
los
 grupos
AICAR+GW
y
AICAR+ROSI,
respecto
al
grupo
AICAR.


Fig.6.
Expresión
(a
nivel
de
 mRNA)
del
gen
PGC1α
frente
a
 distintos
tratamientos.
Los
datos
 son
las
medias
±SEM
(n=6).
(A)
 representa
los
diferentes
 tratamientos
aplicados
en
 solitario
referenciados
al
 control.
(B)
representa
la
 combinación
de
diferentes
 tratamientos
referenciados
al
 control
en
comparación
con
el
 tratamiento
de
AICAR
solo.
Las
 diferencias
significativas
se
 analizaron
mediante
una
ANOVA
 de
una
vía
seguida
de
un
post
 hoc
LSD
(p<
0,05):
a≠b.


Abreviaturas:
AGCL:
mezcla
 equimolar
ácidos


oleico/linoleico;

WY:


Peroxisome
proliferator‐

activated
receptor‐α
agonist;


GW:
Peroxisome
proliferator‐

activated
receptor‐β
agonist;


Rosi:
Peroxisome
proliferator–

activated
receptor‐γ
agonist.


Concentraciones:
Aicar:
 500µM;


ACGL:
 700µm;
 WY:
 50µM;
 GW:


100nM;
Rosi:
0,5µM
 


19







IL6





A


B
 



 
 


En
 la
 fig.7,
 podemos
 observar
 la
 expresión
 del
 gen
 IL6
 en
 combinación
 con
 diferentes
 tratamientos.
En
la
gráfica
A,

podemos
observar
un
incremento,
estadísticamente
significativo,
 en
 la
 expresión
 del
 gen
 de
 la
 IL6
 en
 el
 grupo
 AICAR
 con
 respecto
 al
 control.
 Por
 el
 contrario,
 observamos
una
inhibición
estadísticamente
significativa
en
el
grupo
de
los
AGCL
con
respecto
 al
 grupo
 control.
 Además,
 el
 grupo
 de
 los
 AGCL
 presentan
 una
 menor
 expresión,
 estadísticamente
 significativa,
 en
 referencia
 al
 resto
 de
 grupos,
 a
 excepción
 del
 grupo
 del
 agonista
 del
 PPARβ
 En
 la
 gráfica
 B,
 podemos
 observar
 una
 inhibición,
 estadísticamente
 significativa,
de
la
expresión
del
IL6
entre
todos
los
tratamientos
con
respecto
al

grupo
AICAR.



 
 
 





Fig.7.
Expresión
(a
nivel
de
 mRNA)
del
gen
IL6
frente
a
 distintos
tratamientos.
Los
datos
 son
las
medias
±SEM
(n=6).
(A)
 representa
los
diferentes
 tratamientos
aplicados
en
 solitario
referenciados
al
control.


(B)
representa
la
combinación
de
 diferentes
tratamientos


referenciados
al
control
en
 comparación
con
el
tratamiento
 de
AICAR
solo.
Las
diferencias
 significativas
se
analizaron
 mediante
una
ANOVA
de
una
vía
 seguida
de
un
post
hoc
LSD
(p<


0,05):
a≠b≠c.


Abreviaturas:
AGCL:
mezcla
 equimolar
ácidos


oleico/linoleico;

WY:
Peroxisome
 proliferator‐activated
receptor‐α
 agonist;
GW:
Peroxisome


proliferator‐activated
receptor‐β
 agonist;
Rosi:
Peroxisome
 proliferator–activated
receptor‐γ
 agonist.


Concentraciones:Aicar:
 500µM;


ACGL:
 700µm;
 WY:
 50µM;
 GW:


100nM;
Rosi:
0,5µM


20




FNDC5





A


B
 



 
 
 


En
 la
 fig.8,
 podemos
 observar
 la
 expresión
 del
 gen
 FNDC5
 en
 combinación
 con
 diferentes
 tratamientos.
 En
 la
 gráfica
 A,
 
 no
 podemos
 apreciar
 ninguna
 diferencia
 significativa
 de
 los
 tratamientos
 en
 referencia
 al
 control.
 De
 la
 misma
 manera,
 en
 el
 gráfico
 B,
 tampoco
 podemos
 observar
ninguna
significancia
de
los
distintos
tratamientos
combinados
respecto
al
AICAR.



 
 
 
 
 
 


Fig.8.
Expresión
(a
nivel
de
 mRNA)
del
gen
IL6
frente
a
 distintos
tratamientos.
Los
 datos
son
las
medias
±SEM
 (n=6).
(A)
representa
los
 diferentes
tratamientos
 aplicados
en
solitario
 referenciados
al
control.
(B)
 representa
la
combinación
de
 diferentes
tratamientos
 referenciados
al
control
en
 comparación
con
el


tratamiento
de
AICAR
solo.
Las
 diferencias
significativas
se
 analizaron
mediante
una
 ANOVA
de
una
vía
seguida
de
 un
post
hoc
LSD
(p<
0,05):


a≠b≠c.


Abreviaturas:
AGCL:
mezcla
 equimolar
ácidos


oleico/linoleico;

WY:


Peroxisome
proliferator‐

activated
receptor‐α
agonist;


GW:
Peroxisome
proliferator‐

activated
receptor‐β
agonist;


Rosi:
Peroxisome
proliferator–

activated
receptor‐γ
agonist.


Concentraciones:Aicar:


500µM;
 ACGL:
 700µm;
 WY:


50µM;
 GW:
 100nM;
 Rosi:


0,5µM


21




IL15





A


B
 



 
 


En
 la
 fig.9,
 podemos
 observar
 la
 expresión
 del
 gen
 IL15
 en
 combinación
 con
 diferentes
 tratamientos.
 En
 la
 gráfica
 A,
 
 no
 podemos
 apreciar
 ninguna
 diferencia
 significativa
 de
 los
 tratamientos
 en
 referencia
 al
 control.
 De
 la
 misma
 manera,
 en
 el
 gráfico
 B,
 tampoco
 podemos
 observar
ninguna
significancia
de
los
distintos
tratamientos
combinados
respecto
al
AICAR.



 
 
 
 
 
 
 


Fig.9.
Expresión
(a
nivel
de
 mRNA)
del
gen
IL6
frente
a
 distintos
tratamientos.
Los
 datos
son
las
medias
±SEM
 (n=6).
(A)
representa
los
 diferentes
tratamientos
 aplicados
en
solitario
 referenciados
al
control.
(B)
 representa
la
combinación
de
 diferentes
tratamientos
 referenciados
al
control
en
 comparación
con
el
tratamiento
 de
AICAR
solo.
Las
diferencias
 significativas
se
analizaron
 mediante
una
ANOVA
de
una
 vía
seguida
de
un
post
hoc
LSD
 (p<
0,05):
a≠b≠c.


Abreviaturas:
AGCL:
mezcla
 equimolar
ácidos


oleico/linoleico;

WY:


Peroxisome
proliferator‐

activated
receptor‐α
agonist;


GW:
Peroxisome
proliferator‐

activated
receptor‐β
agonist;


Rosi:
Peroxisome
proliferator–

activated
receptor‐γ
agonist.


Concentraciones:Aicar:
 500µM;


ACGL:
 700µm;
 WY:
 50µM;
 GW:


100nM;
Rosi:
0,5µM
 


22




5.Discusión
 


El
 PGC1α
 está
 altamente
 relacionado
 con
 el
 metabolismo
 oxidativo
 (24).
 El
 tratamiento
 de
 las
 células
 musculares
 en
 presencia
 de
 AGCL
 y
 diferentes
 agonistas
 de
 los
 PPARs
 no
 han
 tenido
 ningún
 efecto
 significativo
 sobre
 la
 expresión
 del
 gen
 que
 lo
 codifica
 (fig.
 6A)
 en
 comparación
 con
 el
 grupo
 control
 (no
 tratado).
 En
 presencia
 de
 AICAR,
 sin
 embargo,
 parece
 ser
 que
 los
 agonistas
 del
 PPARβ
 y
 el
 PPARγ
 ejercen
 un
 efecto
 inhibidor
 sobre
 la
 expresión
 de
 PGC1α
 (fig.


6B).
A
partir
de
la
bibliografía
existente,
se
sabe
que
los
AGCL,
en
presencia
de
AICAR,
producen
 un
 incremento
 de
 la
 expresión
 de
 este
 gen
 tras
 3h
 de
 tratamiento,
 pudiendo
 tener
 un
 efecto
 importante
en
la
regulación
de
otros
genes,
según
la
bibliografía
disponible,
en
este
caso
en
las
 células
musculares
(9,
45).

Debido
a
los
resultados
obtenidos,
que
parecen
ser
contradictorios,
 basándonos
 en
 bibliografía
 previa,
 sería
 conveniente
 realizar
 nuevos
 estudios
 aumentado
 el
 número
de
muestras
y
manteniendo
el
resto
de
condiciones
experimentales.
También
valdría
la
 pena
 indagar
 más
 en
 el
 posible
 efecto
 inhibidor
 sobre
 la
 expresión
 del
 PGC1α
 con
 los
 tratamientos
 con
 agonistas
 del
 PPARβ
 y
 el
 PPARγ
 en
 presencia
 de
 Aicar,
 ya
 que
 los
 datos
 obtenidos
 al
 respecto,
 junto
 con
 los
 datos
 contradictorios
 que
 acabamos
 de
 mencionar,
 no
 permiten
extraer
conclusiones
más
específicas.





En
el
caso
de
la
IL6,
podemos
observar
una
disminución
importante
en
la
expresión
de
 este
 gen
 cuando
 las
 células
 son
 tratadas
 con
 AGCL
 por
 sí
 solas
 (fig.
 7A),
 como
 mediante
 su
 combinación

con
AICAR
(fig.
7B).
En
el
caso
del
tratamiento
con
AGCL,
existe
bibliografía
que
 indica
 
 que
 estos
 AG
 son
 capaces
 de
 aumentar
 expresión
 de
 la
 IL6
 al
 cabo
 de
 unas
 3h
 aproximadamente
en
el
mismo
sistema
de
cultivo
celular
de
C2C12
(45),
de
forma
que
estamos
 observando
un
efecto
contrario
al
esperado.
Del
mismo
modo
ocurre
al
combinar
los
AGCL
con
 AICAR,
 ya
 que
 la
 capacidad
 de
 inducir
 un
 claro
 efecto
 sinérgico
 sobre
 la
 expresión
 (a
 nivel
 de
 mRNA)
 de
 IL6
 cuando
 se
 combina
 con
 AICAR
 es
 excepcional
 según
 la
 bibliografía
 previa
 (45),
 sobre
todo
al
transcurrir
24h
de
tratamiento,
aunque
en
nuestro
caso
el
período
de
tiempo
fue
 de
3h.
Una
posible
causa
que
explique
la
obtención
de
estos
resultados
pueden
ser
los
distintos
 fallos
 realizados
 durante
 el
 proceso
 experimental,
 como
 puede
 ser
 un
 mal
 pipeteo
 o
 una
 mala
 realización
de
la
combinación
equimolar
de
oleico/linoleico,
etc.



 Por
 otro
 lado,
 se
 ve
 que
 la
 presencia
 de
 los
 diferentes
 agonistas
 de
 los
 PPARs
 como
 tratamiento,
en
combinación
con
AICAR,
provoca
una
clara
inhibición
de
la
expresión
de
la
IL6
 (fig.
 7B).
 A
 partir
 de
 los
 resultados
 obtenidos,
 los
 diferentes
 agonistas
 de
 los
 PPARs
 en
 combinación
con
AICAR
parecen
mimetizar
el
efecto
inhibitorio
producido
por
los
AGCL,
así
que
 sólo
con
estos
resultados
podríamos
sugerir
que
el
efecto
de
los
AGCL
sobre
la
expresión
de
IL6
 aquí
 observado
 podría
 deberse,
 en
 gran
 medida,
 a
 su
 capacidad
 de
 activación
 de
 los
 PPARs,
 especialmente
 en
 presencia
 de
 Aicar..
 No
 obstante,
 según
 la
 bibliografía
 existente,
 se
 sabe
 que
 los
AG
regulan
la
expresión
de
diferentes
genes
mediante
los
receptores
nucleares
PPARs
(46)
y
 que
 estos,
 mediante
 una
 interacción
 con
 la
 vía
 dependiente
 de
 la
 AMPK,
 aumentarían
 en
 gran
 medida
la
expresión
de
IL6,
lo
que
sugiere
que
los
PPARs
podrían
ser
parte
de
los
factores
de
 transcripción
 que
 regulan
 la
 expresión
 de
 IL6.
 Además
 se
 ha
 demostrado
 que
 la
 activación
 simultánea
de
AMPK
y
PPARs
inducen
la
expresión
de
genes
relacionados
con
el
metabolismo
 oxidativo
 (47);
 siendo
 especialmente
 importante
 en
 el
 músculo
 esquelético
 para
 el
 caso
 del
 PPARβ
 (48).
 Por
 tanto,
 los
 resultados
 aquí
 observados
 parecen
 entrar
 en
 contradicción
 con
 la
 bibliografía
previa.
Una
explicación
al
efecto
contrario
a
lo
esperado
podría
deberse
a
un
error
 durante
el
proceso
experimental,
así
como
la
pérdida
de
muestras
durante
el
proceso.
De
este
 modo,

sería
necesario
aumentar
el
número
de
muestras
tratadas
con
AICAR
y
posiblemente
el
 tiempo
de
tratamiento
para
poder
comprobar
si
realmente
ha
sido
un
error
experimental.