Studier av proteaser i humane osteoklast-liknende celler og
polariserte makrofager
Leila Hassani
Mastergradsoppgave i farmasi 45 studiepoeng
Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap Farmasøytisk institutt
Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO
Mai 2021
II
III
Studier av proteaser i humane osteoklast-liknende celler og
polariserte makrofager
Leila Hassani
Mastergradsoppgave i farmasi Veiledere:
Professor Rigmor Solberg
Postdoktor Ngoc Nguyen Lunde
IV
© Leila Hassani 2021
Studier av proteaser i humane osteoklast-liknende celler og polariserte makrofager
Leila Hassani
http://www.duo.uio.no/
Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo
V
Forord
Denne masteroppgaven ble utført i perioden august 2020 til mai 2021 ved Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap ved Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo.
En stor takk rettes først og fremst til mine to dyktige veiledere, professor Rigmor Solberg og postdoktor Ngoc Nguyen Lunde. Tusen takk for all veiledning, oppfølging, oppmuntring og deres uvurderlige hjelp og nyttige tilbakemeldinger under skriveprosessen. Jeg er veldig takknemlig for å ha fått muligheten til å jobbe i forskningsgruppen «ProTarg».
Jeg vil også rette en stor takk til professor Harald Thidemann Johansen for all faglig rådgivning og innspill i begynnelsen av arbeidet. Takk til doktorgradsstipendiat Karl Martin Frøseth Forbord for hjelp i gjennomføring av noen analyser.
Jeg vil også rette en stor takk til overingeniør Hilde Nilsen for den gode opplæringen og veiledningen i det praktiske laboratoriearbeidet og gjennomføringen av noen analyser, og ikke minst for ditt positive humør.
Jeg vil også takke alle mine medstudenter, og alle i 4 etasje for tålmodigheten de viste. Jeg er spesielt takknemlig for mine to medstudenter i forskningsgruppen «ProTarg», Nora Osman Ashkir og Cathrine Lilleheil Christiansen. Jeg setter stor pris på deling av erfaringer, kunnskap og latter gjennom hele masteroppgaven. Takk for et minnerikt år!
Jeg vil rette spesiell takk til mine to foreldre, Mohammad Yaqob Hassani og Gulchehra Hassani, som alltid har støttet meg og har vært der for meg. Tusen takk til mine søstre, for all latter og støtte opp gjennom årene.
Oslo, mai 2021 Leila Hassani
VI
Sammendrag
Osteoporose er en progressiv metabolsk skjelettsykdom som er preget av en ubalanse i beinhomeostasen mellom osteoklasters nedbrytning av bein og osteoblasters oppbygging av bein. Osteoklaster (OC) er multinukleære celler som har sitt opphav i monocytter/makrofager og har unik evne til å resorbere bein ved å skille ut ulike cysteinproteaser (f.eks. cathepsin K) og matriksmetalloproteaser (f.eks. MMP-9). I denne masteroppgaven ble regulering av cysteinproteaser (legumain, cathepsin B, K og L), deres endogene inhibitorer (cystatin C og E/M) og matriksmetalloproteaser (MMP-2 og -9) studert ved enzymaktivitetsmålinger, immunoblotting og real-time PCR i humane OC-liknende celler, mens legumainsekresjon ble analysert med ELISA.
En human THP-1 monocytt-cellelinje ble brukt som cellemodell og en metode ble etablert i laboratoriet for differensiering av OC etter stimulering med forbolesteren PMA, RANKL og/eller M-CSF som førte til dannelse av multinukleære celler. Legumainaktivitet og mRNA- ekspresjon var uendret i OC-liknende celler, men RANKL og/eller M-CSF førte til oppregulering av legumain moden form (36 kDa). Differensiering i serumfritt dyrkningsmedium ga betydelig lavere totalproteinkonsentrasjoner i cellene sammenliknet med serumholdig medium. Eksponering for medium med høyt innhold av prolegumain under OC- differensiering førte til økning i legumainaktivitet i cellene, særlig for celler stimulert med M- CSF. Dette tydet på opptak og prosessering av prolegumain i OC, som ble bekreftet ved immunoblotting. Eksponering for cystatin E/M førte derimot ikke til endring i legumainaktiviteten, som indikerer at cellene ikke tok opp cystatin E/M.
Siden makrofager også er involvert ved beinremodellering, så ble PMA-behandlede THP-1 celler polarisert til M1- og M2-makrofager ved bruk av henholdsvis IFNγ og LPS eller IL-4, og regulering av legumain, cathepsin B og K ble studert. M1- og M2-makrofager viste ulik morfologi, cysteinproteaseaktivitet og -mRNA-ekspresjon. M1-makrofager uttrykte og sekrerte signifikant mer legumain enn M2- eller upolariserte makrofager. Eksponering for prolegumain under polariseringen førte til opptak og prosessering av legumain i M2- og upolariserte makrofager, men ikke i M1.
I bein er det et samspill mellom OC og makrofager, og proteiner skilt ut av en celletype kan tas opp av/eller påvirke en annen celletype. Denne masteroppgaven har vist at prolegumain kan
VII skilles ut og tas opp av både OC og makrofager, men om dette har betydning for beinremodelleringen er foreløpig ikke kjent.
VIII
Abstract
Osteoporosis is a progressive metabolic skeletal disease characterized by an imbalance in bone homeostasis between resorption of bone by osteoclasts and formation of bone by osteoblasts.
Osteoclasts (OC) are multinuclear cells that originate from monocytes/macrophages and have a unique ability to resorb bone by secreting various cysteine proteases (e.g. cathepsin K) and matrix metalloproteases (e.g. MMP-9). In this master thesis, regulation of cysteine proteases (legumain, cathepsin B, K and L), their endogenous inhibitors (cystatin C and E/M) and matrix metalloproteases (MMP-2 and -9) were studied by enzyme activity measurements, immunoblotting and real-time PCR in human OC-like cells, while legumain secretion was analyzed by ELISA.
A human THP-1 monocytic cell line was used as a cell model and a method was established in the laboratory for differentiation of OC after stimulation with the phorbol ester PMA, RANKL and/or M-CSF which led to the formation of multinuclear cells. Legumain activity and mRNA expression were unchanged in OC-like cells, but RANKL and/or M-CSF led to upregulation of the legumain mature form (36 kDa). Differentiation in serum-free culture medium gave significantly lower total protein concentrations in the cells compared to serum-containing medium. Exposure to medium with a high content of prolegumain during OC differentiation led to an increase in legumain activity in the cells, especially for cells stimulated with M-CSF.
This indicated uptake and processing of prolegumain in OC, which was confirmed by immunoblotting. In contrast, exposure to cystatin E/M did alter legumain activity, indicating that the cells did not internalize cystatin E/M.
Since macrophages are also involved in bone remodeling, PMA-treated THP-1 cells were polarized to M1 and M2 macrophages using IFNγ and LPS or IL-4, respectively, and regulation of legumain, cathepsin B and K was studied. M1 and M2 macrophages showed different morphology, cysteine protease activity and mRNA expression. M1 macrophages expressed and secreted significantly more legumain than M2 or unpolarized macrophages. Exposure to prolegumain during polarization led to uptake and processing of legumain in M2 and unpolarized macrophages, but not in M1.
In bone, there is an interaction between OC and macrophages, and proteins secreted by one cell type can be internalized by and/or influence another cell type. This master thesis has shown that
IX prolegumain can be secreted and taken up by both OC and macrophages, but whether this is important for bone remodeling is not yet known.
X
Innholdsfortegnelse
1 Innledning ... 1
1.1 Stamceller ... 1
1.1.1 Osteoblaster ... 1
1.2 Monocytter og differensiering til ulike celletyper ... 2
1.2.1 Osteoklaster ... 2
1.2.2 M1- og M2-makrofager ... 3
1.3 Celler involvert i beinremodellering ... 3
1.4 Proteaser ... 5
1.5 Cysteinproteaser ... 7
1.5.1 Legumain ... 7
1.5.2 Cathepsin K ... 9
1.5.3 Cathepsin B ... 9
1.5.4 Cathepsin L ... 9
1.6 Matriksmetalloproteaser ... 10
1.7 Cysteinproteasehemmere ... 10
1.8 Osteoporose ... 11
1.8.1 Risikofaktorer ... 12
1.8.2 Diagnostisering og behandling ... 12
2 Mål med oppgaven ... 13
3 Materialer og metoder ... 14
3.1 Materialer ... 14
3.1.1 Kjemikalier og reagenser ... 14
3.1.2 Utstyrsliste ... 16
3.2 Celledyrking ... 19
3.2.1 THP-1 celler ... 19
3.2.2 Frysing, tining og utsåing av THP-1 celler ... 19
3.2.3 Dyrking og splitting av celler ... 20
3.2.4 Telling av celler ... 20
3.2.5 Utsåing av celler til forsøk ... 21
3.2.6 Høsting av celleforsøk ... 21
3.2.7 Tillaging av kondisjonerte medier som reagens til celleforsøk ... 22
XI
3.3 Celleforsøk... 22
3.3.1 Differensiering av THP-1 monocytter til OC-liknende celler ... 22
3.3.2 Differensiering og polarisering av THP-1 monocytter til makrofager ... 23
3.4 TRAP-farging ... 24
3.5 Totalproteinmåling ... 24
3.6 Enzymaktivitetsmåling ... 25
3.6.1 Legumain- (asparaginyl endopeptidase, AEP) og ukjent AEP-aktivitet ... 25
3.6.2 Cathepsin B-aktivitetsmåling ... 26
3.7 Gelelektroforese og immunoblotting ... 27
3.7.1 Acetonfelling av totalprotein i cellelysat ... 27
3.7.2 Tillaging av gelelektroforeseprøve ... 27
3.7.3 Gelelektroforese ... 27
3.7.4 Immunoblotting ... 28
3.7.5 Stripping og reblotting ... 30
3.8 Zymografi ... 30
3.9 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ... 31
3.10 Real-time PCR ... 32
3.10.1 Isolering av total RNA ... 32
3.10.2 Kvantifisering av RNA ... 33
3.10.3 Komplementært DNA (cDNA)-syntese ... 34
3.10.4 Real-time PCR ... 35
3.10.5 Behandling av RT-qPCR-data ... 36
3.11 Statistiske analyser ... 37
4 Resultater ... 38
4.1 Differensiering av THP-1 monocytter til osteoklastliknende celler ... 38
4.1.1 Regulering av cysteinprotease-aktivitet i THP-1 celler etter differensiering til osteoklastliknende celler ... 39
4.1.2 Legumain, cathepsin K, cathepsin B og cystatin E/M mRNA-ekspresjon i osteoklastliknende celler ... 40
4.1.3 Sekresjon av legumain fra THP-1 celler under differensiering til osteoklastliknende celler ... 42 4.1.4 Regulering av proteaser i osteoklastliknende celler etter dyrking i serumfritt medium 43
XII
4.2 Differensiering av THP-1 monocytter til osteoklastliknende celler under
tilstedeværelse av prolegumain eller cystatin E/M ... 49
4.2.1 Opptak av prolegumain eller cystatin E/M i THP-1 differensierte osteoklastliknende celler ... 51
4.2.2 Sekresjon av legumain fra celler eksponert for cystatin E/M under differensiering til osteoklastliknende celler ... 55
4.3 Differensiering og polarisering av THP-1 monocytter til makrofager ... 56
4.3.1 Ulik cysteinprotease-aktivitet i M1- og M2-makrofager ... 57
4.3.2 Legumain, cathepsin B og cathepsin K mRNA uttrykkes forskjellig i M1- og M2-makrofager ... 59
4.3.3 Verifisering av THP-1 differensierte M1- og M2- makrofager ... 60
4.3.4 M1-makrofager sekrerer mer legumain enn kontroll- og M2-makrofager ... 61
4.4 Differensiering og polarisering av THP-1 monocytter til makrofager under tilstedeværelse av prolegumain eller cystatin E/M ... 62
4.4.1 Opptak av prolegumain eller cystatin E/M i THP-1 celler under differensiering til makrofager ... 64
4.4.2 Sekresjon av legumain fra THP-1 celler eksponert for cystatin E/M under differensiering til makrofager ... 68
5 Diskusjon ... 69
6 Konklusjon ... 80
Litteraturliste ... 81
Vedlegg A. Sammensetning av løsninger brukt i oppgaven ... 90
Vedlegg B. Tabeller over sammentning på løsninger tilsatt i forsøk ... 97
XIII
Forkortelser
AEP Asparaginyl endopeptidase
AMC 7-amino-4-metylkumarin
Ala Alanin
Asn Asparagin
Asp Aspartat
Arg Arginin
AP Aktiveringspeptid
BSA Bovint serumalbumin
PBS Fosfatbufret saltvann
CBBG «Coomassie Brilliant Blue G-250»
CHAPS 3-[(3-kolamidopropyl)-dimetylammonio]-1-propansulfonat
CO2 Karbondioksid
cDNA komplementært DNA
dH2O destillert vann
dF Delta fluorescens
DMEM «Dubecco’s Modified Eagle Medium»
DMSO Dimetylsulfoksid
DTT Ditiotreitol
E-64 Trans-epoksysuksinyl-L-leukylamido(4-guanidino)-butan
EDTA Etylendiamintetraacetat
ELISA «Enzyme-linked immunosorbent assay»
XIV
EtOH Etanol
FBS Føtalt kalveserum
GAPDH Glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase
HSC Hematopoietiske
HRP «Horseradish peroxidase»
GF1 vekstfaktor 1
IFN-γ Interferon-gamma
IL Interleukin
kDa Kilodalton
KM Kondisjonert medium
LPS lipopolysakkarid
Mill. Million
MSC Mesenklymale stamceller
M-CSF Makrofag-kolonistimulerende faktor
MMP Matriksmetalloprotease
M4C Stabiltransfekterte HEK293 cellelinje som overuttrykker Cystatin E/M
M38L Stabiltransfektert HEK293 cellelinje som overuttrykker legumain
MHC «Major histocompatibility complex»
mRNA Budbringer-ribonukleinsyre
OB Osteoblast
OC Osteoklast
XV OIP-2 Osteoklastinhibitoriskpeptid-2
OPG Osteoprotegerin
PAGE Polyakrylamidgelelktroforese
PTH Paratyroideahormon
qRT-PCR Reverstranskripsjonpolymerase kjedereaksjon RANK Reseptoraktivator av kjernefaktor kappa-B
RANKL RANK-ligand
RNA Ribonukleinsyre
RD «Reagent Dilution»
rpm «Rounds per minute», omdreininger per minutt
SDS Natriumdodecylsulfat
SEM «Standard error of the mean», standardfeil SERM Selektiv østrogenreseptormodulerende
TGF-β Transformerende vekstfaktor β
TNF Tumornekrosefaktor
T-TBS Tris-bufret saltvann med Tween 20
Z-Ala-Ala-Asn-AMC Benzyloksykarbonyl-alanin-alanin-asparagin-4-metylkumarin Z-Arg-Arg-AMC Benzyloksykarbonyl-arginin- arginin-7-amino-4-metylkumarin
1
1 Innledning
1.1 Stamceller
Stamceller defineres som en populasjon med udifferensierte og uspesialiserte celler som har uendelig proliferasjonsevne [1]. Avhengig av hvor disse cellene er lokalisert og hvilke differensieringspotensiale de har deles de inn i fire hovedklasser; totipotente-, pluripotente-, multipotente- og unipotente stamceller [1, 2, 3].
Multipotente stamceller er vevsspesifikke stamceller [2, 3]. Disse cellene er involvert i flere cellulære og molekylære mekanismer som fører til antiinflammatoriske og anti- apoptotiske effekter [4, 5]. Dermed brukes disse cellene blant annet i behandling av beinbrudd og autoimmune sykdommer som f.eks. revmatoid artritt [5, 6, 7]. Hematopoietiske (HSC) og mesenklymale stamceller (MSC) er to eksempler på multipotente stamceller lokalisert i beinmargen [8, 9], som utgjør et av kroppens største organer [10]. HSC gir opphav til alle modne blodceller i den perifere sirkulasjonen og immunsystemet, inkludert monocytter, granulocytter, lymfocytter, megakaryocytter (blodplater) og erytrocytter [8, 11, 12]. MSC gir opphav til blant annet osteoblaster (OB), kondrocytter og adipocytter, og har en reparasjonsrolle i skadet vev [13].
1.1.1 Osteoblaster
OB er mononukleære celler som har hovedrollen i beindannelse. Disse cellene stammer fra MSC i beinmargen som danner osteoblastforløperceller. Disse forløpercellene vil videre prolifere og differensiere til osteoblaster på knokkeloverflaten. Signalmolekyler som er avgjørende for differensiering av MSC til OB er blant annet parathyroideahormon (PTH), vekstfaktor 1 (IGF1) og transformerende vekstfaktor β (TGF-β). Osteoblaster produserer beinsubstans ved å syntetisere ekstracellulære matriksproteiner, som type 1 kollagen, deretter mineraliserer bein gjennom akkumulering av kalsiumfosfat som hydroksyapatitt (Ca10 (PO4)6 (OH)2). Osteoblaster skiller ut viktige cytokiner som RANKL-ligand (RANKL) og Osteoprotegerin (OPG), og dermed er også involvert i reguleringen av beinmasse ved moduleringen av osteoklaster [14-20, 43] (Figur 1.1).
2
1.2 Monocytter og differensiering til ulike celletyper
Monocytter er en type hvite blodceller som utgjør 5-10% av blodleukocytter hos mennesket [21] og sirkulerer mellom kroppens ulike vev [22-24]. Monocytter har potensialet til å differensiere til makrofager eller dentrittiske celler, som fungerer som effektorceller i immunforsvaret hovedsakelig med fagocytose og sekresjon av cytokiner [23-25]. Sirkulerende monocytter differensieres til makrofager etter proinflammatorisk, metabolsk eller immunologiske stimuli [24, 25].
Makrofager er celler som finnes i alle organer og vev. Spesialiseringen av makrofager utfra type stimuli i ulike mikromiljøer og deres lokalisering i kroppen, klassifiserer dem i f.eks.
osteoklaster (OC) i bein, alveolære makrofager i lungene, Kupffer-celler i lever, mikroglia i hjernen. og spesialiserte makrofager i testikler, øye, tarm og sekundære lymfoide organer [24- 26]. Makrofager er en del av det mononukleære fagocytt-systemet og spiller en sentral rolle i immunrespons og opprettholdelse av homeostase (for eks. beinhomeostasen) [24, 26, 27].
1.2.1 Osteoklaster
Osteoklaster (OC) er multinukleære celler med opptil 50 kjerner per celle [14, 28]. OC er kjent som store celler med ruglete struktur som er ansvarlige for beinresorpsjon [15, 29]. Disse cellene stammer fra HSC i beinmargen. OC-differensieringen er avhengig av to sentrale endogene cytokiner, makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av kjernefaktor kappa-B ligand (RANKL) [28, 30, 31]. M-CSF-signalering vil gjennom M-CSF- reseptoren fremme differensiering av stamceller til heterogene populasjoner av monocytter, makrofager, dendrittiske celler og beinnedbrytende osteoklaster [28, 32, 33]. RANKL er et cytokin som uttrykkes membranbundet på overflaten til preosteoblaster eller befinner seg fritt ekstracellulært, og binder til RANK-reseptorer på overflaten av forløperceller til eller modne osteoklaster [29, 31]. Ligandens interaksjon med RANK-reseptorene på osteoklastforløpere er helt essensielt for aktivering, differensiering og fusjonering av monocytter/makrofager til funksjonelle OC-er. RANKL oppreguleres av M-CSF, samtidig som M-CSF stimulerer til RANK-uttrykk på osteoklastforløpere [15, 28]. Økning i RANKL-ekspresjon føre til økt antall OC som videre leder til økt resorpsjon og utvikling av osteoporose [15, 16, 28, 34]. M-CSF er opprinnelig beskrevet som en vekstfaktor som deltar i inflammatoriske reaksjoner og
3 beinmetabolisme [35]. Andre typer cytokiner som kan fremme osteoklastdifferensiering og funksjon er interleukin 1 (IL-1), IL-6 og tumornekrosefaktor-α (TNF-α) [26].
1.2.2 M1- og M2-makrofager
Makrofager eksisterer i to polariseringstilstander: proinflammatoriske M1- og antiinflammatoriske M2-makrofager. Betegnelsene M1 eller M2 stammer fra T-hjelpeceller (henholdsvis T-hjelpecelle 1 (Th1) eller T-hjelpecelle 2 (Th2)) som bidrar i polarisering [36- 38]. Interferon-gamma (IFN-γ) er det viktigste cytokinet som er assosiert med M1-aktivering.
IFN-γ er hovedsakelig produsert av Th1-celler, men også produseres av naturlige drepeceller (NK) og makrofager. M1-aktivering kan også oppnås av IFN-γ i kombinasjon med lipopolysakkarid (LPS) [36, 39].
M2-makrofager er en antiinflammatorisk fenotype som oppstår etter stimulering av makrofager med IL-4. Andre cytokiner eller signalstoffer som også kan igangsette M2-differensiring og aktivering er IL-10, IL-13 og M-CSF [36, 39, 40].
1.3 Celler involvert i beinremodellering
Bein er et levende vev som består av en organisk og en uorganisk del. For å kunne ivareta sin mekaniske styrke er bein helt avhengig av en balansert og kontinuerlig remodelleringsprosess.
Remodellering av bein er en dynamisk prosess som skjer ved at spesialiserte celler i beinvevet syntetiserer og nedbryter beinmatriks. Reguleringen av denne prosessen skjer både lokalt og systemisk [41]. Den viktigste systemiske stimulatoren er PTH, mens kalsitriol, glukokortikoider og kjønnshormoner (østrogen) er eksempler på hemmere [15, 42]. De tre fasene som inngår i beinremodellering er resorpsjon, omdannelse og formasjon av bein.
OC er en av de viktigste cellene i denne prosessen [29]. Disse cellene bryter ned bein ved å binde seg til matriksadhesjonsproteiner på den mineraliserte beinoverflate. Denne bindingen danner et lukket hulrom under OC, kalt «Resportive pits» [43, 44]. OC kan bevege seg på beinmatriksoverflaten ved hjelp av adhesjonsproteiner (integriner) og resorbere bein uten å miste kontakt. OC skiller ut organiske syrer som skaper et surt miljø i det ekstracellulære resorpsjonsområdet. Det sure miljøet er med på å løse opp den uorganiske delen av beinmatriksen og samtidig aktiveres proteolytiske enzymer (f.eks. cathepsin K
4
og matriksmetallproteaser (f.eks. MMP-9)) (Kap. 1.5) utskilt fra OC. Disse enzymene er ansvarlige for å degradere organiske komponenter av beinmatriksen, hovedsakelig kollagen [15, 28, 45]. Økt OC-aktivitet er ansett å føre til en rekke kliniske tilstander som osteoporose og revmatoid artritt [30, 46]. OC er avhengig av en tett og regulert samarbeid med OB for å regulere sin aktivitet [47] (Figur 1.1).
I tillegg til OB og OC er andre celler som osteocytter, forløperceller og stamceller i beinmargen også direkte involvert i beinremodellering [14, 46]. Beinresorpsjonen foregår i omtrent to uker, mens beinformasjonen kan foregå i fire måneder. Derfor vil en ubalanse i disse prosessene føre til patologiske tilstander som osteoporose [48].
Figur 1.1 Samspillet mellom osteoklaster og osteoblaster i beinremodelleringen.
Hematopoietiske stamceller (HSC) differensieres til preosteoklaster som i nærvær av cytokiner som RANKL og M-CSF (skilles ut av osteoblaster) differensierer til multinukleære osteoklaster. Disse cellene nedbryter bein og frigjør blant annet kalsium og vekstfaktorer. Mesenkymale stamceller (MSC) differensierer til preosteoblaster som og vekstfaktorer til å differensiere til modne osteoblaster.
Osteoblaster kan deretter transformeres til osteocytter og bli en del av beinmatriksen, eller osteoblaster kan legge seg på beinoverflaten som beinkledningsceller («bone lining cells»). Figuren er hentet fra [47].
Det er flere studier som tyder på makrofagenes viktige rolle i beinhomeostasen. I den tidlige fasen av en betennelse aktiveres makrofager (f.eks. M2) og polariseres til en M1-fenotype som
5 har proinflammatorisk funksjon og skiller ut proinflammatoriske cytokiner som IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α og superoksydanioner etter aktivering. Dette induserer en Th1-immunorespons som fører til vevsskade. Disse cytokinene er med på å indusere ekspresjon av RANKL på overflaten av preosteoblaster, som aktiverer osteoklaster og fører til beinresorpsjon. Mot slutten av betennelsesreaksjoner blir makrofager (f.eks. M1) polarisert til M2-fenotype som har en regulatorisk funksjon i vevsreparasjon. Disse makrofagtypene produserer IL-10, IL-1α og TNF- β som gir aktivering av Th2-immunrespons og andre antiinflammatoriske funksjoner. Dermed vil M2-makrofager være med på å undertrykke proinflammatorisk cytokinproduksjon og hindre beinresorpsjon [26, 36-40] (Figur 1.2).
Figur 1.2 Polarisering av makrofager kan påvirke beinresorpsjon. Makrofager stammer fra hematopoietiske stamceller (HSC). Avhengig av mediatorer (LPS, IFN-γ og IL-4) i mikromiljøet aktiveres og polariseres makrofager til proinflammatoriske M1 og antiinflammatoriske M2 fenotyper.
M1 skiller ut TNF-α og IL-1β, og indusere beinresorpsjon. M2-makrofager skiller ut IL-10 og TGFβ, og hemme beinresorpsjon. Figuren er hentet fra [26].
1.4 Proteaser
Proteaser, også kalt proteinaser eller peptidaser, er proteolytiske enzymer som katalyserer spalting av proteiner ved irreversibel hydrolyse av peptidbindinger [49, 50]. Avhengig av hvor i proteinsubstratet spaltingen skjer, deles de inn i endo- og eksopeptidaser. Endopeptidaser spalter internt i polypeptidkjeden, mens eksopeptidaser som spalter proteinsubstratet på enten amino- eller karboksyterminal ende kalles henholdsvis amino- eller karboksypeptidaser [50, 51].
Proteolytiske enzymer deltar i ulike fysiologiske prosesser som cellesyklus, celleproliferasjon, celledød, DNA-replikasjon, nedbrytningsprosesser, hemostase, sårheling og immunrespons.
6
Derfor vil dysregulering i proteaseaktivitet føre til ulike patologiske tilstander som for eksempel kreft, kardiovaskulære og inflammatoriske sykdommer, osteoporose og nevrologiske lidelser [52, 54].
Databasen MEROPS gir oversikt over alle proteolytiske enzymer, deres inhibitorer og substrater [49]. Disse enzymene er klassifisert i et hierarkisk system etter deres proteolytiske mekanismer (klasser), deres tredimensjonale struktur (klaner), og deres aminosyresekvenslikheter (familier) [49]. Navnet på klanene består av to bokstaver På bakgrunn av type aminosyre i det katalytiske setet deles proteasene i totalt ni ulike klasser (Figur 1.3), hvor serin-, aspartat-, treonin-, metallo- og cysteinproteaser er de fem viktigste [49, 55].
Figur 1.3. MEROPS klassifisering av proteaser. Proteaser klassifiseres i ni klasser i henhold til likhet i det katalytiske sete. Klassen deles videre inn i klaner i henhold til proteasenes tredimensjonale struktur, som igjen deles inn i familier basert på likheter i aminosyresekvenser. Proteasene nevnt under familier er studert i denne masteroppgaven. Figur modifisert fra Rawlings et al. [49].
7
1.5 Cysteinproteaser
En av de største klassene av proteaser er cysteinproteaser [53], som syntetiseres som inaktive proformer [56]. Aktiveringen av proenzymene skjer enten ved autoaktivering eller ved hjelp av andre proteaser. Proenzymene transporteres fra endoplasmatisk retikulum (ER) til Golgi og deretter til det sure miljøet i endosomer/ lysosomer hvor aktiveringen skjer [57, 58]. Mer enn 70 familier av cysteinproteaser er identifisert og karakterisert, hvor fire er påvist i mennesker [59]. En familie er papainfamilien (C1) som inkluderer blant annet cathepsin B, K og L [60, 61], som er studert i denne masteroppgaven (Figur 1.3). Disse enzymene er ansvarlige for proteolyse i det lysosomale systemet, men befinner seg også i cytosol. Den lysosomale cysteinproteasen legumain tilhører C13-familien, og er også studert i denne masteroppgaven.
Cysteincathepsiner tilhører klan CA, mens legumain tilhører klan CD (Figur 1.3) [61, 62].
1.5.1 Legumain
Legumain (også kalt asparaginyl endopeptidase (AEP)) fikk sitt navn etter proteasen ble oppdaget i frø/bønner fra ulike belgfrukter (Leguminosae) [63]. I 1997 ble legumain for første gang identifisert i pattedyr [63]. Det ble vist at legumain spalter karboksyterminalt for aminosyren asparagin (Asn) ved pH 5.8 som er optimalt både for enzymets aktivitet og stabilitet [64, 65]. I likhet med caspasene (tilhører også klan CD) er legumain også kjent for å spalte aspartat (Asp)- substratet, siden Asp da vil være i protonert form slik at den strukturelt likner Asn [64, 65]. Ved pH 7 eller høyere vil enzymet bli irreversibelt denaturert og inaktivert [63, 66]. Noen kjente legumainsubstrater er cathepsin B, H og L, promatriksmetalloproteinase-2 (proMMP-2) og matriksproteinet fibronektin [67, 68].
Syntese og aktivering av legumain
Legumain uttrykkes som glykosylert proform (prolegumain) med en molekylvekt på 56 kDa.
Prolegumain består av ulike domener; et N-terminalt signalpeptid, et katalytisk domene og et C-terminalt prodomene. Det C-terminale prodomenet består av et aktiveringspeptid (AP) (Figur 1.4, blått) og et legumain stabiliserings- og aktiveringsmodulerende domene (LSAM; Figur 1.4 gult). Prolegumain er stabilt ved nøytral pH, men aktiveres autokatalytisk ved pH<5,5 ved spalting av LSAM-domenet til en inaktiv intermediær form (47 kDa), som spaltes videre ved pH≤4,0 til en aktiv intermediær form (46 kDa). Prosessering til aktiv moden form (36 kDa) er
8
avhengig av andre ukjente proteaser. En aktiv form med molekylvekt på 25 kDa er også nylig identifisert [65].
Figur 1.4 Prosessering og aktivering av legumain. Aktiv moden form (36 kDa) dannes fra prolegumain (56 kDa) via flere trinn. Først gjennomgår prolegumain autokatalytisk prosessering til en inaktiv intermediær form (47 kDa) ved pH < 5,5 og videre spalting til aktiv intermediær form (46 kDa) ved pH
≤ 4,0. Aktiv moden form (36 kDa) dannes ved hjelp av en eller flere ukjente proteaser. NTF (N-terminalt fragment; oransje), LSAM (legumain stabiliserings og aktiveringsmodulerende domene; gul). Figuren er modifisert fra Dall et al. [66].
Legumain ved sykdomstilstander
I pattedyr er legumain detektert i de fleste vev, men den proteolytiske aktiviteten av legumain er vist å være høyest i nyrer, milt, lever, placenta og testikler [63, 66]. Legumain er blant annet involvert i patofysiologien til flere sykdomstilstander som aterosklerose, kreft og osteoporose [65]. Overuttrykk og aktivitet av legumain fører til invasjon og metastase av mange kreftsvulster og derfor er proteasen et attraktivt målmolekyl for lokal aktivering av cytotoksiske prodrugs ved kreft [69]. Ikke minst vil oppregulering av dette enzymet hemme differensiering av humane mesenkymale stamceller (hBMSC) til osteoblaster og på den måten er legumain også involvert i beinremodellering ved osteoporose [65, 70].
Legumain inngår også andre prosesser som prosessering av antigen for presentasjon via MHC- II [66, 71]. Proteasen har en viktig rolle i aktivering av andre proteaser som proMMP-2, cathepsin B, H og L [67, 68]. Legumain kan i tillegg ha protease-uavhengige egenskaper ved at det C-terminale fragmentet i enzymets struktur har vist en hemmende effekt på
9 osteoklastdannelse og beinresorpsjon [65, 72, 73]. Mekanismen er ikke kjent, men hemmet osteoklastdannelse er antatt å være relatert til hemming av cathepsin L-aktivitet [74].
1.5.2 Cathepsin K
Cathepsin K er en lysosomal cysteinprotease og som sekreres og spiller en viktig rolle i nedbryting av bein ved å degradere type 1 collagen som er en hovedbestanddel i bein. På den måten bidrar enzymet til resorpsjon av mineralisert beinvev og dermed osteoporotisk beintap [75]. Cathepsin K er det eneste cathepsinet som uttrykkes spesielt høyt i OC [75-77], syntetiseres som proform (38kDa) og autoaktiveres til moden form (24 kDa) ved sur pH [78].
Genekspresjonen av cathepsin K reguleres av cytokiner som RANKL og tumornekrosefaktor- alfa (TNF-α), hormoner som retinnsyre og østrogen, og transkripsjonsfaktorer [79]. Den viktige funksjonen av cathepsin K i beinremodelleringen har vekket interesse for å designe spesifikke cathepsin K-inhibitorer for å redusere beintapet ved osteororose, men per dags dato finnes det ingen cathepsin K-hemmere tilgjengelig på markedet [55, 80].
1.5.3 Cathepsin B
Cathepsin B er en lysosomal cysteinprotease som i likhet med cathepsin K også sekreres [81, 82]. Cathepsin B uttrykkes hovedsakelig av makrofager [81], og sekreres som procathepsin B, og aktiveres ved spalting enten av andre proteaser eller gjennom en autokatalytisk prosessering i surt miljø (pH 5,5) etter reopptak i Golgi og lysosomer. Da blir procathepsin B prosessert til to aktive former, enkelt-kjedet og/eller dobbelt-kjedet cathepsin B [58, 83]. Proteasen utviser både endo- og eksopeptidase-aktivitet avhengig av pH. Ved sur pH er eksopeptidase-aktiviteten dominerende [84-86]. Det er vist at cathepsin B inngår i degradering av ekstracellulære matrikskomponenter, deriblant type IV kollagen, under sure forhold [77]. Videre er det vist at cathepsin B øker overlevelsen av OC [87, 88].
1.5.4 Cathepsin L
Cathepsin L er i likhet med cathepsin B og K en cysteinprotease lokalisert i lysosomer. Dette enzymet er en endopeptidase som syntetiseres som inaktiv proform (39 kDa), og aktiveres i det sure miljøet i lysosomer til to aktive former, enkelt-kjedet (29 kDa) og dobbelt-kjedet (22 kDa) [89]. Cathepsin L er vist å være involvert i reguleringen av viktige biologiske funksjoner,
10
inkludert beinresorpsjon under normale og patologiske forhold [74, 88, 90]. Derfor kan cathepsin L betraktes som et mål i behandlingen av osteoporose.
1.6 Matriksmetalloproteaser
Matriksmetalloproteaser (MMP-er) er ekstracellulære proteaser som skilles ut fra celler i form av proenzymer (proMMP-er). MMP-er har evnen til å degradere ekstracellulær matriks (f.eks.
kollagen) som er viktig for blant annet utvikling av embryo, reproduksjon og remodellering av vev [91]. MMP-er er vist å være involvert i initiering av beinresorpsjon ved å bidra til osteoklastmigrasjon i beinoverflaten. Dermed har de fått mye oppmerksomhet i ulike patologiske tilstander som blant annet osteoporose [45]. Deltakelse av MMP-er i beinresorpsjonen vist å være spesifikk. I flate knokler som hodeskalle eller skulderblader bruker OC. MMP-er til å nedbryte bein, mens i andre knokler er OC-aktivitet ikke avhengig av disse enzymene [92].
Så langt er det rapportert flere enn 20 MMP-typer. Noen MMP-er er membranbundne og viktige for aktiveringen av andre MMP-er [93, 94]. MMP-er er endopeptidaser som har et katalytisk sinkion i det aktive setet. Avhengig av deres katalytiske domene-posisjon og spesifisiteten til ulike substrater deles de inn i ulike grupper; kollagenaser, gelatinaser, stromelysiner, matrilysiner, membranbundne MMP og andre MMP-typer [68, 95]. MMP-2 og-9 er to eksempler på matriksmetalloproteaser [94] som ble undersøkt i denne oppgaven.
1.7 Cysteinproteasehemmere
Cystatiner er kompetitive og reversible inhibitorer av cysteinproteaser og fungerer både ekstra- og intracellulært. Kun cystatin C, E/M og F er vist å hemme cathepsiner og legumain i mennesket [96] ved å danne reversible komplekser med høy affinitet. Det er også vist at legumain og cathepsin B kan hemmes samtidig ved at enzymene bindes til ulike seter på hemmerne [82, 96]. I følge MEROPS klassifiseringen går disse inhibitorene under subfamilie type 2 cystatiner [82]. I denne masteroppgaven er det fokusert på cystatin E/M og C.
11 Cystatin E/M, den meste potente legumain-hemmeren er hovedsakelig sekretorisk, men er vist å kunne internaliseres og hemme legumain også intracellulært [97]. Det finnes to molekylære former av cystatin E/M, en uglykolysert (14 kDa) og en glykolysert (17 kDa) form. Cystatin E/M finnes i hele kroppen, men spesielt i hudvev hvor lave nivåer av cystatinet fører til unormal hudutvikling [98]. Lave nivåer av cystatin E/M er påvist i kroppsvæsker, inkludert tårer og morsmelk hos mennesket. Cystatin E/M er sterkt involvert i ulike krefttyper spesielt brystkreft, hvor nedregulering av cystatin E/M førte til økt proteaseaktivitet [99-101].
Cystatin C er et sekretorisk protein som blant annet har blitt funnet utenfor resorpsjonshulrommet og i alle kroppsvæsker, spesielt i sædplasma og i cerebrospiralvæske [102]. Dette cystatinet har høy inhiberende effekt mot legumain og cathepsin L og deretter cathepsin B, og på den måten har cystatin C en regulatorisk funksjon i beinresorpsjonen [65, 66]. Intracellulært er cystatin C høyt uttrykt i OC [103]. På grunn av sin lave molekylvekt (15 kDa), elimineres cystatin C effektivt via glomerulær filtrering og derfor benyttes cystatin C som en utmerket markør for glomerulær filtreringshastighet [102].
1.8 Osteoporose
Osteoporose (beinskjørhet) er definert som en progressiv metabolsk skjelettsykdom som er preget av lav beinmasse og forringelse i beinvevets mikroarkitektur. Dette fører til redusert beinstyrke og dermed økt risiko for lavenergibrudd [104, 105]. Osteoporose oppstår på grunn av en ubalanse mellom de motsatte aktiviteter i beinhomeostasen; osteoklasters nedbrytning av bein (resorpsjon) og osteoblasters oppbygging av bein (formasjon) [48].
Sykdommen betegnes ofte som «en stille sykdom» på grunn av mangel på symptomer før pasienten opplever et brudd [106]. De vanligste brudd skjer i håndleddet, ankel, hofter og lårhals og ryggsøylene [105, 108]. Slike osteoporotiske brudd fører til alvorlig funksjonshemming, redusert livskvalitet og økt dødelighet [107]. Det er kjent at arv bestemmer opptil 75 % av beintettheten [104, 108]. Andre medvirkende årsak kan være lav disponering for sol som resulterer til redusert vitamin D-produksjon, noe som er kritisk for opptak av kalsium i tarmen og reabsorpsjon i nyrene [109].
12
1.8.1 Risikofaktorer
Det skilles mellom primære og sekundære risikofaktorer som henholdsvis fører til primær og sekundær osteoporose. Den vanligste formen er primær osteoporose som enten er postmenopausal eller aldersrelatert. Det er vist at kvinner er mest utsatt for å utvikle osteoporose enn menn, forårsaket av nedgang i hormon-nivå (østerogen) i overgangsalderen. Det aldersrelaterte beintapet skjer gradvis på grunn av tap av stamcelleforløpere hos begge kjønn.
Livsstilsfaktorer som fysisk inaktivitet, dårlig kosthold, fedme, lav BMI (kroppsmasseindeks), alkohol og røyk påvirker også beintettheten negativt [16, 47, 108]. Sekundær osteoporose er kjønnsuavhengig [110] og enten legemiddelindusert eller forårsaket av underliggende sykdommer som revmatiske, gastrointestinale og endokrine tilstander. Langvarig bruk av legemidler som glukokortikoider, aromatasehemmere, tyroksin, og psykofarmaka kan knyttes til lav beinmasse [16, 109, 111, 112].
1.8.2 Diagnostisering og behandling
Den mest anvendte metoden for å diagnostisere osteoporose er måling av beinmineraltettheten (BMD) med dobbel røntgenabsorbsjonsmetri (DXA-skanning). BMD-verdi mindre eller lik 2,5 standardavvik under gjennomsnittsverdien for yngre voksne betraktes som lav beintetthet. Det er først når pasienten opplever et lavenergibrudd at tilstanden får betegnelsen «etablert osteoporose» [16, 104, 108, 109, 112].
Hovedformålet med ulike behandlingsalternativer som finnes er å redusere risikoen for osteoporotisk brudd gjennom enten å øke osteoblastenes aktivitet eller å hemme osteoklastenes aktivitet. Legemidler med hemmende effekt på OC er blant annet bisfosfonater, selektive østrogenreseptormodulatorer (SERMs), hormonerstatningsterapi (HRT) og RANKL-hemmer (denosumab). OB-stimulerende legemidler inkluderer teriparatid (PTH-analog), androgene anabole steroider (ved hypogonadisme) og remozumab (sklerostin-mAb) som er godkjent av EMA, men ikke registrert i Norge. Pasienter med påvist etablert osteoporose bør begynne med bisfosfonater kombinert med kalsium og D-vitamin for å forebygge videre beintap [16, 108, 109]. I tillegg oppfordres pasientene til å eliminere livsstilsrelaterte risikofaktorer.
13
2 Mål med oppgaven
Mål med denne oppgaven er å:
• Etablere metoder i laboratoriet for differensiering av humane THP-1 monocytter til osteoklaster
• Studere regulering av cysteinproteaser (legumain, cathepsin B, K, L), cysteinproteaseinhibitorer (cystatin C og cystatin E/M) og matriksmetalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) i osteoklaster
• Studere regulering av cysteinproteaser (legumain, cathepsin B og K) i humane THP-1 differensierte M1- og M2-makrofager
• Studere om tilsetning av prolegumain eller cystatin E/M under celledyrkning har effekt på differensiering av osteoklaster, polarisering av makrofager og regulering av cellulært legumain
14
3 Materialer og metoder
3.1 Materialer
3.1.1 Kjemikalier og reagenser
Reagenser Leverandør
Aceton Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland
Albuminstandard (23209) Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (500-0006)
Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA
Bovint serum albumin (BSA), Pierce™ (Cat ID:23209)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Chameleon™ Duo Prestained Protein Ladder (928-60000)
LI-COR Biosciences GmbH, Bad Homburg, Tyskland
CHAPS (Cat ID: C3023) Merck KGaA
Dimetylsulfoksid (DMSO) (Cat ID: D2650) Merck KGaA Ditiotreitol (DTT) (438117) Merck KGaA DuoSet® Human Total Legumain ELISA kit
(DY4769)
R&D Systems
E-64, trans-epoksysuccinyl-L- leucylamido(4-guanidino)-butan (Cat ID:
E3132)
Merck KGaA
Fosfatbufret saltvann (PBS) (10X) (Cat ID:
D1408)
Merck KGaA
Føtalt kalveserum (FBS) (SV30160.03) Thermo Fisher Scientific Inc.
Geit anti-human polyklonalt antistoff mot Cathepsin L (AF952)
R&D Systems
Geit anti-human polyklonalt antistoff mot CD163 (AF1607)
R&D Systems
15 Geit antihuman polyklonalt antistoff mot
CD80 (AF140)
R&D Systems
Geit anti-mus polyklonalt antistoff mot GAPDH (Sc-47724)
Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA
Geit anti-human cystatin E/M polyklonalt antistoff (AF1286)
R&D Systems
Geit anti-human cystatin C polyklonalt antistoff (AF1196)
R&D Systems
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit (4368814)
Thermo Fisher Scientific Inc.
IRDye® 680/800CW Esel anti-geit IgG sekundært antistoff
LI-COR Biosciences GmbH
IRDye® 680/800CW Esel anti-mus IgG sekundært antistoff
LI-COR Biosciences GmbH Invitrogen ™ nukleasefritt vann (1905023) Thermo Fisher Scientific Inc.
LPS fra Escherichia coli (L5418) Sigma-Aldrich HEK293-KM
M38L-KM M4C-KM
Nilsen, H, Seksjon for farmakologi og farmasøytisk biovitenskap, Universitetet i Oslo
M-CSF («Macrophage colony-
stimulating factor») (216-MC)
R&D Systems NewBlot™ IR Stripping Buffer (5X) (928-
40030)
LI-COR Biosciences GmbH NuPAGE™ antioxidant (NP0005) Thermo Fisher Scientific Inc.
NuPAGE™ LDS Sample Buffer (4X) (NP0007)
Thermo Fisher Scientific Inc.
NuPAGE™ MOPS SDS Running Buffer (20X) (NP0001)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) (927- 50000)
LI-COR Biosciences GmbH
Penicillin-Streptomycin (1556461) GE Healthcare LifeSciences, Marlborough, MA, USA
16
Power SYBR® Green PCR Master Mix (4367659)
Thermo Fisher Scientific Inc.
PMA (forbol 12-myristat-13-acetat, 12-O- tetradekanoylphorbol 13-acetat) (P1585)
Sigma-Aldrich
Reagent Diluent concentrate 2 (10X) (DY995)
R&D Systems
Buffer RLT Plus
RNeasy® Plus lysis buffer (163048725)
QIAGEN GmbH, Tyskland
Rekombinant humant RANK L R&D Systems Rekombinant human IFNγ (285-IF) R&D Systems
Rekombinant human IL-4 (204-IL) Thermo Fisher Scientific Inc.
Substrate Solution, Color Reagent A + Color Reagent B (DY999)
R&D Systems
Tartrate Resistant Acid Phosphatase (TRAP) kit
Sigma-Aldrich
Tween® 20 (170-6531) Bio-Rad Laboratories
Trypanblått (0,4%) (T10282) Thermo Fisher Scientific Inc.
Z-Ala-Ala-Asn-AMC (I-1865) Bachem Holding AG, Dubendorf, Sveits Z-Arg-Arg-7-amido-4-metylkumarin
hydroklorid (AMC), peptidsubstrat (C-5429)
Bachem Holding AG
3.1.2 Utstyrsliste
Utstyr Leverandør
Bio-Rad PowerPac™ HC Bio-Rad Laboratories Inc.
Biosphere® Filter Tip (10, 20, 300, 200, 1000 μl)
Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Tyskland
Blottepapir, filterpapir (732-0593) VWR International Ltd., Lutterworth, Storbritannia
Corning® Sentristar™, sentrifugerør (15 ml) (430791), (50 ml) (430921)
Corning Inc., USA
17 Costar® 5 ml pipette (4051), 10 ml pipette
(4101), 25 ml pipette (4251), 6-brønners plate (3516), 96- brønners microplate, blank (3598), 96- brønners microplate, svart (3915)
Corning Inc.
Countess™ cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific Inc.
Countess™ Invitrogen automated cell counter
Thermo Fisher Scientific Inc.
Clear Microplate (DY990) R&D Systems
Di-Block® Heater DM-2A Techne, Cambridge, Storbritannia
Digital Dry Bath Labnet International, Inc.
Eppendorfrør (1.5, 2 og 5 ml) Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland
Finnpipetter™ Thermo Fisher Scientific Inc.
Finnpipetter™ F1 Multichannel Thermo Fisher Scientific Inc.
Galaxy® (170S) inkubator Eppendorf, Inc. USA Heraeus™ FrescoTM 21 Centrifuge
(75002426)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Holten Lamin Air LAF-benk Medinor AS, Norge Intelwasher 3D-IW8- Microplate washer Biosan, England Kubota sentrifuge- model 2010 Medinor AS
Lateks hansker (112-2751) VWR International Ltd.
MicroAmp® 8-Tube Strip, Assorted Colors (0,2 mL) (N8010838)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Nunc™ EasYFlask™ 75 cm2 Cellekultur flasker (Cat ID: 156499)
Thermo Fisher Scientific Inc.
NuPAGE™ 4-12 % Bis-Tris Midi Protein Gel (Cat ID: WG1401A)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Novex™ 10% Zymogram Plus (Gelatin) Protein Gel (Cat ID: ZY00102BOX)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Novex™ Tris-Glycin SDS sample buffer (2X) (Cat ID: LC2676)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Novex ™ Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X) (Cat ID: LC2675)
Thermo Fisher Scientific Inc.
18
Novex™ Zymogram- Renaturing Buffer (10X) (Cat ID: LC2670)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Novex™ Zymogram- Developing Buffer (10X) (Cat ID: LC2671)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Odyssey® CLx Near-Infrared Imaging System
LI-COR Biosciences GmbH
Olympus, lysmikroskop (CKX41) Olympus Life Science Solutions, Tokyo, Japan
Olympus, lysmikroskop (CKX53) Olympus Life Science Solutions
PipetBoy™, Integra VWR International Ltd.
Plate Sealers, plastfilm til ELISA (DY992) R&D Systems
RNeasy® Plus Mini Kit (250) QIAGEN GmbH
Sarstedt® sentrifugerør 50 ml (62.547.254) Sarstedt AG & Co.
Sartorius™ Biohit™ Optifit tip, pipettespiss (10, 200, 1000 μl)
Sartorius Biohit Liquid Handling Oy, Helsinki, Finland
Spectrafuge™ mini (C1301B) Corning Inc.
SUB Aqua 12-sandbad Grant, Storbritannia
The Belly Dancer Stovall Life Science, Greensboro, NC, USA TPP® celleskraper (99002) TPP Techno Plastic Products AG,
Trasadingen, Sveits Trans-Blot® Turbo Mini-size
nitrocellulosemembran (7,1 cm x 8,5 cm, 40 membraner) (L002049A)
Bio-Rad Laboratories
Trans-Blot® TurboTM Mini-size Tranfer Stacks (7,1 cm x 8,5 cm, 40 membraner) (L002043A)
Bio-Rad Laboratories
Trans-Blot® TurboTM Transfer system Bio-Rad Laboratories Victor™ X4 Multimode Plate Reader,
microplate reader(2030-0050)
Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Zaventem, Belgia
Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc., Bohemia, NY, USA
19 VWR® Disposable Graduated Transfer
pipets (612-4545)
VWR International Ltd.
XCell SureLock™ Mini-Cell
Electrophoresis System
Thermo Fisher Scientific Inc.
3.2 Celledyrking
3.2.1 THP-1 celler
THP-1 celler (American Type Culture Collection; TIB-202) er en human monocyttcellelinje, isolert fra blodet til en ett år gammel gutt med akutt monocytisk leukemi [113]. Denne cellelinjen vokser som suspensjonsceller og brukes ofte som en in vitro modell for blant annet å studere differensiering og funksjon av makrofager [114, 115].
3.2.2 Frysing, tining og utsåing av THP-1 celler
På forhånd lages THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) med 5% dimetylsulfoksid (DMSO), som cellene oppbevares i under nedfrysing. Grunnen til det er at ved nedfrysing kan det dannes intracellulære vannkrystaller i cellene som kan ødelegge cellemembranen og føre til celledød. DMSO er et kryoprotektant som virker cellebeskyttende ved å trekke vann ut fra cellene og på den måten hindre intracellulær krystallisering [116]. Cellene telles og sentrifugeres (Kap. 3.1.4). Deretter tilsettes THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) med 5%
DMSO forsiktig til cellepelleten og under kontinuerlig blanding tilsvarende 1 mill. celler/ml.
Så fordeles cellesuspensjonen på 1 ml Cryo-rør og settes på is i 5-10 minutter. Deretter oppbevares rørene ved -70 °C i 2 timer før overføring til nitrogentank (-196 °C) for langtidslagring [117, 118].
Etter uttak fra nitrogentanken (N2-tanken) blir cellene tint i 40-60 sekunder på vannbad ved 37°C under dreiing av cellerøret til det kun er en liten isklump igjen. Så tørkes rørets utside av med 70% etanol (EtOH). Deretter blir 1 ml av cellematerialet overført til en 75 cm2-celleflaske med 9 ml THP-1 dyrkingsmedium (Vedlegg A.1.1), som på forhånd er varmet opp til 37°C.
Cellene inkuberes ved 37°C og 5% CO2 over natt. Dagen etter overføres cellene til et 50 ml rør og sentrifugeres i 5 minutter ved 800 rpm før supernatanten, som DMSO befinner seg i, suges
20
av og nytt oppvarmet medium tilsettes. Etter 3 dager blir cellene fortynnet i nytt oppvarmet medium. Frysing, tining og utsåing av celler fra N2-tanken ble utført av overingeniør Hilde Nilsen.
3.2.3 Dyrking og splitting av celler
THP-1 celler dyrkes i celleflasker på 75 cm2 i 10 ml THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1).
Cellene splittes når cellekonsentrasjonen i celleflasken var ca. 1 mill. celler/ml, som er en gang i uken. Da blir cellesuspensjonen overført til et 50 ml rør, og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. Gammelt medium blir fjernet forsiktig og cellepelleten resuspendert i tilsvarende nytt romtemperert THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1). Cellesuspensjonen blandes godt ved å pipettere forsiktig opp og ned for å redusere celleklumper og telles (Kap. 3.1.4). Det tas det ut et bestemt volum av cellesuspensjonen for utsåing til forsøk (Kap. 3.1.5), mens 1 ml (ca. 1 mill. celler) av cellesuspensjonen overføres til ny celleflaske med 9 ml THP- 1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) (1+9 fortynning) til ny celleflaske. Splitting av celler er viktig for å opprettholde optimal pH og næring for celler. Cellene inkuberes i varmeskap ved 37°C og 5% CO2. I tillegg fortynnes cellesuspensjonen 1+1 tre dager etter splitting ved å tilsette 10 ml romtemperert THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1).
3.2.4 Telling av celler
I ulike forsøk sås det ut et bestemt antall celler per brønn. Dermed er det viktig å kjenne til cellekonsentrasjonen i cellesuspensjonen i celleflasken (antall levende celler/ml). Dette blir bestemt ved å telle celler basert på en metode kalt,
«Trypan Blue Exclution Test of Cell Viability» [119]. I et eppendorfrør blir 20 μl av fargestoffet trypanblått (0,4%) og 20 μl cellesuspensjon blandet godt sammen. Blandingen (ca.
10 μl) overføres til et tellekammer, som settes inn i en automatisk celleteller (CountessTM Invitrogen Automated Cell Counter). Trypanblått er et fargestoff som bindes til cellemembranen på levende celler og farger membranen blå. Da vil cellene se ut som runde partikler som er hvite i midten med blå ring rundt. Døde celler vil absorbere dette fargestoffet grunnet permeabel cellemembran og se ut som blå partikler. Derfor vil denne metoden også skille mellom levende og døde celler [119]. Celletelleren gir informasjon om det totale-, levende- og døde antall celler, samt prosent celleviabilitet. Antall levende celler/ml
21 benyttes til å beregne volum av cellesuspensjon som skal brukes for å få riktig antall levende celler til forsøk.
3.2.5 Utsåing av celler til forsøk
Totalt antall celler som trengs i et forsøk deles på antall levende celler/ml (Kap. 3.1.4) for å beregne volum cellesuspensjon til et forsøk. Dette volumet overføres til et 50 ml sentrifugerør og blandes godt med et volum THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) til ønsket cellekonsentrasjon. Celleblandingen tilsettes PMA rett før utsåing. Avhengig av type forsøk blir det brukt ulike antall celler per 2 ml/brønn i 6-brønners brett. I makrofag-forsøkene ble det sådd ut 1 mill. celler/brønn (0,5 mill. celler/ml), mens i osteoklast-forsøkene ble det sådd ut 0,5 mill. celler/brønn (0,25 mill. celler/ml). Etter utsåing blir cellene inkubert i varmeskap ved 37°C og 5% CO2 før videre stimulering (Kap. 3.2).
3.2.6 Høsting av celleforsøk
Underveis og ved avslutning av celleforsøk inspiseres cellene under lysmikroskop for adherens, morfologiske endringer og celletetthet. Mikroskopibilder tas etter avsluttet forsøk og før høsting av kondisjonert medium og celler.
Høsting av kondisjonerte medier gjøres ved forsiktig avpipettering og overføring til 1,5 ml eppendorfrør. Videre sentrifugeres røret ved 800 rpm i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten avpipetteres forsiktig og overføres til et nytt eppendorfrør og oppbevares ved –20 °C før analyse.
Adherente celler vaskes en gang forsiktig med 500 μl steril 1X PBS (Vedlegg A.2.1) ved å sette løsningen langs veggen i brønnen og deretter suge forsiktig av og kaste. Deretter lyseres cellene i brønnen med enten 250 µl legumain lysisbuffer (Vedlegg A.2.2) eller 350 µl RNA lysisbuffer, under skraping med en celleskraper. Det kontrolleres under mikroskop at cellene har løsnet. Så overføres cellelysatet fra hver brønn til godt merkede 1,5 ml eppendorfrør. For lysat i legumain lysisbuffer gjennomføres en fryse-tinning prosedyre ved at cellene fryses ved –70°C i ca. 15 minutter, og deretter tines raskt på varmeblokk ved 30°C (ved å vende opp og ned). Prosessen gjentas to ganger til for å lysere cellene fullstendig, og til slutt sentrifugeres cellelysatene ved 10 000 g og 4°C i 5 minutter. Supernatanten pipetteres av og overføres til nytt
22
merket eppendorfrør og oppbevares nedfryst (ved -20°C) frem til analyse eller analyseres direkte. RNA-prøvene oppbevares ved -80°C frem til analyse.
3.2.7 Tillaging av kondisjonerte medier som reagens til celleforsøk
I denne masteroppgaven blir serumfrie kondisjonerte medier (KM) fra HEK293 (HEK-KM, kontroll), M38L (M38L-KM, inneholder prolegumain) og M4C (M4C-KM, inneholder cystatin E/M) celler [97] brukt som tilsetning til celledyrkningsmediet i enkelte celleforsøk. Ved tillaging av disse kondisjonerte mediene blir det sådd ut ca. 1 mill. celler (HEK293, M38L eller M4C) per flaske (75 cm2) i 10 ml HEK-medium (vedlegg A.1.6). Cellene inkuberes i 3 døgn inntil ca. 75-90% konfluens før cellene vaskes en gang med serumfritt medium. Deretter tilsettes cellene 10 ml serumfritt HEK-medium (vedlegg A.1.6), og inkuberes ytterligere 3 døgn før. Cellene sjekkes i mikroskop for eventuelle løse celler før kondisjonert medium ble forsiktig avpipetteres og overføres til rør. Kondisjonerte medier sentrifugeres ved 800 rpm i 5 min. Supernatanten suges av og overføres til nytt rør som oppbevares nedfryst til senere analyse eller forsøk. Tillaging av kondisjonerte medier ble utført av overingeniør Hilde Nilsen.
3.3 Celleforsøk
THP-1 celler er suspensjonsceller som kan bli til adherente makrofagliknende celler etter behandling med forbolesteren forbol-12-myristate-13-acetate (PMA). Etter PMA-stimulering blir cellene stimulert med reseptoraktivator av kjernefaktor kB ligand (RANKL) og/eller makrofag kolonistimulerende faktorer (M-CSF) for differensiering til osteoklaster (OC).
Stimulering av PMA-stimulerte THP-1 celler med lipopolysakkarid (LPS), interferon gamma (INFγ) og interleukin 4 (IL-4) kan gi differensiering til henholdsvis M1- og M2-makrofager.
Videre undersøkes disse differensierte cellene for blant annet regulering av endogene proteaser.
3.3.1 Differensiering av THP-1 monocytter til OC-liknende celler
Etter celletelling (Kap. 3.1.4) blandes ønsket volum av cellesuspensjon med beregnet volum THP-1 dyrkningmedium (Vedlegg A.1.1) til ønsket celletetthet per brønn (0,25 mill. celler/ml).
Blandingen tilsettes PMA (Vedlegg A.2.4) og cellene sås ut i 6-brønners brett (0,5 mill.
celler/brønn) og inkuberes ved 37˚C og 5% CO2. Etter 6 eller 48 timer inspiseres cellene for
23 adherens. Medium blir tatt vare på eller fjernet og cellene enten høstet, «tartrat resistent acid phosphatase» (TRAP)-farget eller eksponert for ulike mediatorer. For OC-differensiering tilsettes 1 ml RPMI-OC dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.3) enten RANKL (Vedlegg A.2.5) (50 ng/ml) og/eller M-CSF (Vedlegg A.2.6) (50 ng/ml). For kontrollmakrofager tilsettes det kun 1 ml RPMI-OC dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.3) tilsatt 3,3 µl PBS (+0,2% BSA) (vedlegg A.2.4). Etter inkubering ved 37˚C og 5% CO2, inspiseres cellene for endring i morfologi før medium høstes og overføres eppendørfrør. Kondisjonert medium blir tatt vare på og erstattes med nytt og cellulær morfologi blir observert hver annen eller tredje dag frem til dag 9 eller 10, da cellene og kondisjonert medium høstes som beskrevet i kap. 3.1.6. Tilsvarende forsøk ble også gjentatt i fravær av serum (FBS) (Vedlegg A.1.4) de tre siste dagene.
OC-differensiering ble også utført under tilstedeværelse av 1+1 RPMI-OC dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.3) og enten HEK293-KM (kontroll), M38L-KM (med prolegumain) eller M4C- KM (med cystatin E/M) (Vedlegg B.1) etter 6 timers inkubering med PMA (62 ng/ml). Siden de kondisjonerte media er serumfrie, ble det tilsatt ekstra serum til totalt 10% FBS (Vedlegg A.1.5).
3.3.2 Differensiering og polarisering av THP-1 monocytter til makrofager
Ønsket volum av cellesuspensjon blandes med beregnet volum THP-1 dyrkningmedium (Vedlegg A.1.1) til ønsket celletetthet per brønn (0,5 mill. celler/ml). Blandingen tilsettes PMA (Vedlegg A.2.3) med sluttkonsentrasjon på 62 ng/ml og cellene sås ut i 6-brønners brett (1 mill.
celler/brønn) og inkuberes ved 37˚C og 5% CO2 i 6 timer. Deretter inspiseres cellene for adherens. Medium blir tatt vare på eller fjernet og celler eksponeres for ulike mediatorer i duplikater. For M1-differensiering blir 2 ml THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) tilsatt LPS (Vedlegg A.2.7) (10 ng/ml) og IFNγ (Vedlegg A.2.8) (5 ng/ml). For M2-differensiering blir 2 ml THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) tilsatt IL-4 (Vedlegg A.2.9) (25 ng/ml).
For kontrollmakrofager blir kun 2 ml THP-1 dyrkningsmedium tilsatt. Etter 72 timers inkubering ved 37˚C og 5% CO2, inspiseres alle brønnene for celleadherens og endring i morfologi. Mikroskopibilder tas før høsting av kondisjonerte medier og celler.
Dette forsøket ble også gjentatt under tilstedeværelse av 1+1 THP-1 dyrkningsmedium (Vedlegg A.1.1) og enten HEK293-KM (kontroll), M38L-KM (med prolegumain) eller M4C- KM (med cystatin E/M) (vedlegg B.2) etter 6 timers inkubering med PMA (62 ng/ml). Siden
24
de kondisjonerte media er serumfrie, ble det tilsatt ekstra serum til totalt 10% FBS (Vedlegg A.1.2).
3.4 TRAP-farging
TRAP-farging er en metode som brukes for å validere OC-differensiering. TRAP er et enzym som befinner seg i intracellulære vesikler i OC, det er sett at økt OC-differensiering er korrelert med økt TRAP-aktivitet og at TRAP kan brukes som en OC-markør [120]. Metoden baserer seg på å visualisere TRAP-aktivitet i OC-differensierte celler. Denne aktiviteten kan vises ved at TRAP hydrolyserer naftol-ASBI-fosfat og frigir naftol-ASBI som umiddelbart binder seg til
«fast garnet GBC» (et fargestoff) som danner et uløselig rødbrunt fargekompleks. Videre tilsettes hematoksylin som oksiderer natriumjodat til hematin. Hematin er et fargestoff som farger cellekjerner blå. På den måten blir det også enklere å bekrefte multinuklearitet i celler, noe som kjennetegner osteoklaster [121, 122].
I dette arbeidet ble Leukocyte Acid Phosphatase TRAP Kit fra Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA) brukt og produsentens protokoll ble fulgt. Først ble mediet avpipettert og adherente celler vasket forsiktig 3 ganger med 1 ml PBS (Vedlegg A.2.1). Deretter ble det tilsatt 2 ml fikseringsvæske (romtemperert) (Vedlegg A.3.1) som ble fjernet etter 30 sekunder. Cellene ble så vasket 4 ganger med 2 ml destillert vann (dH2O) (37°C). Det var viktig å ikke la cellene tørke. Etter 1 times inkubering med 2 ml løsning B (Vedlegg A.3.2) ved 37°C og beskyttet mot lys, ble løsning B (Vedlegg A.3.2) fjernet og cellene vasket 4 ganger med 2 ml dH2O (37°C).
Deretter ble 0,5 ml hematoksylinløsning (romtemperert) tilsatt cellene og fjernet etter 2 minutter. Cellene ble så vasket med 1-3 ml romtemperert spring vann (Vedlegg A.3.3). Til slutt ble brønnene lufttørket og fotografert ved bruk av lysmikroskop og programmet Cell Sens.
3.5 Totalproteinmåling
Metoden som brukes for å måle den totale proteinkonsentrasjonen i cellelysat er en etablert prosedyre beskrevet av Bradford [123]. Prinsippet for denne metoden baserer seg på at det skjer en endring i absorbsjonsmaksimum fra 465 nm til 595 nm ved at det dannes en kompleks mellom det rødbrune fargestoffet, Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) i en sur løsning og proteiner som eksisterer i prøven. Dannelse av CBBG-protein-komplekset vil føre til fargeendring i løsningen fra rødbrun til blå. Økende kompleksdannelse gir sterkere blå farge og
25 dermed økt absorbans og dette måles ved 595 nm i en mikroplateleser som bestemmer proteinkonsentrasjonen [123].
Siden absorbansspekteret av fri og kompleksbundet DBBG er overlappende ved denne metoden, må avlesningen skje i forhold til en standardkurve basert på fortynninger av bovint serum albumin (BSA) (stamløsning på 2 mg/ml) i lysisbuffer. Konsentrasjonen til fortynninger laget for standardkurven er 0, 50, 100, 200, 300 og 400 μg/ml, og mengde totalprotein i en ukjent prøve beregnes ut ifra denne standardkurven. Tre paralleller av standarder og cellelysater/prøver på 10 μl appliseres per brønn i en transparent 96-brønners mikroplate.
Prøver fortynnes (1+1 i lysisbuffer) før applisering for å sikre at proteinkonsentrasjonen ikke faller utenfor standardkurven. Mikroplaten kan «tappes» for å sikre blanding. Dersom blåfargeintensiteten etter tilsetning av CBBG-fargestoffet til prøven er sterkere enn den høyeste standardkonsentrasjonen (400 μg/ml BSA) indikerer dette at proteinkonsentrasjonen i prøvene er høyere enn 400 µg/ml, og vil falle utenfor standardkurven. Videre tilsettes 200 μl «Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate» som inneholder CBBG-fargestoffet (Vedlegg A.4.1) (fortynnet i 1+4 i dH2O) til alle brønnene. Mikroplaten skal stå 5 minutter i romtemperatur før måling for å sikre CBBG-protein-kompleksdannelse. Til slutt settes mikroplaten i mikroplateleseren (Victor TM X4) for avlesning ved 595 nm.
Hensikten med å bestemme proteinkonsentrasjonen i prøver er å korrigere for enzymaktivitet (Kap. 3.5) og for å begrene uttak av lik proteinmengde ved immunoblotting (Kap. 3.6).
3.6 Enzymaktivitetsmåling
3.6.1 Legumain- (asparaginyl endopeptidase, AEP) og ukjent AEP-aktivitet
For å måle legumain- og ukjent AEP- aktivitet i cellelysat brukes metoden beskrevet i Chen et al. [63] og Johansen et al. [124] benyttet. Til en prøve som inneholder legumain, tilsettes legumain assaybuffer (pH 5,8; Vedlegg A.5.1). Denne bufferen inneholder et reduksjonsmiddel, ditiotreitol (DTT), som gjør at cysteinproteasene i prøven blir aktive. Så tilsettes det et fluorescerende peptidsubstrat, Z-Ala-Ala-Asn-AMC, som spaltes av legumain (og ukjent AEP). Denne spaltingen fører til frisetting av AMC (7-amino-4-metylcoumarin), kalt
«leaving group», som gir kraftig fluorescens ved eksitasjonsbølgelegde 360 nm og
26
emisjonsbølgelengde 460 nm. Dermed måles aktivitet som økning i fluorescens per tidsenhet (dF/sek) (kinetikk) i en mikroplateleser.
Tjue μl av prøve eller blindprøve (lysisbuffer) tilsettes to brønner hver på en svart 96-brønners mikroplate. E-64 er et epoksid som irreversibelt hemmer alle cysteincathepsiner, men ikke legumain. Derfor tilsettes den ene parallellen 5 µl 34 µM E-64 (sluttkonsentrasjon: 1 µM) for å bestemme ekte legumainaktivitet, mens den andre parallellen tilsettes 5 µl dH2O for å måle totale AEP-aktivitet [124]. Aktiviteten som hemmes av E-64 omfatter ukjent AEP- aktivitet. Deretter tilsettes hver brønn 95 μl legumain assaybuffer (tilsatt 200 mM DTT (sluttkonsentrasjon: 1 mM) og CHAPS 1% (sluttkonsentrasjon: 0,01%)). DTT og CHAPS i assaybuffer skal være fersk tilsatt. Det skal gå minst 10 minutter fra tilsetting av reduksjonsmiddelet (i legumain assaybuffer) til måling av aktivitet, og prøvene og bufferen blandes ved å «tappe» platen for å sikre blanding og aktivering av enzym. Umiddelbart før målingen begynner tilsettes hver brønn 50 µl 34 µM peptidsubstratoppløsning (sluttkonsentrasjon: 10 µM; Vedlegg A.5.2). Sluttvolumet i brønnene skal alltid være 170 μl.
Det utføres fluorescensmålinger med 360 sekunder mellom hver måling totalt 10 ganger (kinetikk, 1 time) ved 30°C i en mikroplateleser. Økning i fluorescens er direkte proporsjonal med aktivitet av legumain/ukjent AEP og beregnes som endring i fluorescens per sekund delt på totalproteinkonsentrasjon.
3.6.2 Cathepsin B-aktivitetsmåling
På samme måte som aktivitetsmåling av legumain baserer denne aktivitetsmålingen seg på spalting av et fluorescerende peptidsubstrat, Z-Arg-Arg-AMC som er angitt å være spesifikt for cathepsin B. Prosedyren er basert på en metode beskrevet av Barret [125]. Ti µl prøve (cellelysat) eller blindprøve (lysisbuffer) tilsettes 3 brønner hver på en svart 96-brønners mikroplate. Hver brønn tilsettes 110 µl cathepsin B assaybuffer (pH 5,5; Vedlegg A.5.3) (tilsatt 200 mM DTT (sluttkonsentrasjon: 1 mM) og CHAP 1% (sluttkonsentrasjon: 0,01%)). Prøvene og bufferen blandes ved å «tappe» platen. Det skal gå minst 10 minutter fra tilsetting av reduksjonsmiddel til måling av aktivitet for å sikre aktivering av enzymet. Umiddelbart før målingen, tilsettes hver brønn 50 µl 34 µM peptidsubstratoppløsning (sluttkonsentrasjon: 10 µM; Vedlegg A.5.4). Det utføres totalt 10 fluorescensmålinger ved bølgelengde 460 nm med 60 sekunder mellom hver måling (kinetikk) ved 30°C i mikroplateleseren. Økning i fluorescens
