TESIS DOCTORAL 2014
TÉCNICAS DE CULTIVO Y MOLECULARES PARA EL ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES
MICROBIANAS EN AGUAS HOSPITALARIAS
Claudia Stella Prince Manzano
TESIS DOCTORAL 2014
Programa de Doctorado de Microbiología Ambiental y Biotecnología
TÉCNICAS DE CULTIVO Y MOLECULARES PARA EL ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES
MICROBIANAS EN AGUAS HOSPITALARIAS
Claudia Stella Prince Manzano
Director/a: Margarita Gomila Ribas Director/a: Jorge Lalucat Jo
Doctor/a por la Universitat de les Illes Balears
Índice………...
Agradecimientos………...
Resumen/Resum/Abstract.………...
Introducción………..
5 9 11 15
I1. Importancia del tratamiento de agua para hemodiálisis……...……… 18
I2. Contaminantes habituales del agua...………... 18
I3. Pureza y calidad del agua para hemodiálisis……….……….……….. 21
I4. Características biológicas de los contaminantes microbianos………... 23
I4.1. Microorganismos intactos……… I4.2. Derivados bacterianos..………... I4.2.1 Lipopolisacáridos y fragmentos de lipopolisacáridos……….. I4.2.2. Peptidoglucano……… I4.2.3. Fragmentos cortos de ADN bacteriano……….. I.4.2.4. Respuesta al receptor Toll-like……..………... 24 26 26 26 27 28 I5. Métodos para la detección de contaminantes microbianos………. 28
I6. Principales metodologías usadas para el estudio de la comunidad microbiana presente en aguas de hemodiálisis en esta tesis doctoral……….. 31
I6.1. Identificación de microorganismos mediante espectrometría de masas Matrix- Assisted Laser Desorption/ionization Time-Of-Flight de Bruker Daltonics………... 31
I6.2. TSA-FISH (Tyramide Signal Amplification-Fluorescence In Situ Hybridization)………... 32
I6.3. Tecnología de secuenciación masiva Roche 454/GS FLX……….. 33
Antecedentes……….. 35
Objetivos……… 39
Material y métodos………...………... 43 M1. Unidad de hemodiálisis, recogida de muestras y puntos de muestreo analizados..
M2. Análisis físico-químico y determinación de endotoxinas de las muestras de agua………
M3. Análisis microbiológicos por métodos dependientes de cultivo……….
M3.1. Medios de cultivo y volúmenes analizados………..
M3.2. Análisis de los aislamientos mediante espectrometría de masas MALDI- TOF……….
M3.2.1. Obtención de perfiles proteicos y generación de dendrogramas…...
M3.2.2. Construcción de una base de datos in-house a partir de los resultados obtenidos por MALDI-TOF MS………
M3.3. Análisis de los aislamientos mediante el gen 16S rRNA: Identificación bacteriana y análisis filogenético………
M3.3.1. Extracción de ácidos nucleicos totales………..
M3.3.2. PCR y Secuenciación del gen 16S rRNA……….
M3.3.3. Análisis filogenético………..
M3.4. Análisis de diversidad y curvas de rarefacción………
M4. Métodos independientes de cultivo……….…
M4.1 Análisis de la comunidad microbiana por TSA-FISH y DAPI……….
M4.2. Análisis metagenómico de las aguas de diálisis: Análisis de los amplicones y caracterización de la comunidad total………...
M4.2.1 Recogida de muestra (Filtración prolongada)……….
M4.2.2. Extracción del ADN total………..
M4.2.3. Preparación de las muestras para el análisis metagenómico………..
M4.2.4. Caracterización de la comunidad bacteriana total. Análisis bioinformático del metagenoma………..
M4.2.5. Amplificación por PCR y pirosecuenciación de los amplicones del gen 16S rRNA y del gen rpoD de las muestras del Hospital Son Llàtzer…...
M4.2.6. Amplificación por PCR y pirosecuenciación de los amplicones del gen 16S rRNA y del gen rpoD de las muestras del Hospital Universitario
45 50 50 50 51 51 53 53 53 54 54 55 56 56 57 57 58 59 59 61
Son Espases……….
M4.2.7. Análisis bioinformático de los amplicones………....
M4.2.7.1. Cribado de las muestras……….
M4.2.7.2. Detección de quimeras………..
M4.2.7.3. Construcción de Unidades Operacionales Taxonómicas (OTUs)………...
M4.2.7.4. Clasificación filogenética………..
M4.2.7.4.1. Análisis del gen 16SrRNA - RDP classifier…………...
M4.2.7.4.2. Análisis del gen rpoD - Generación de Unidades Operacionales Filogenéticas (OPUs)……….
M4.2.7.4.3. Índices de diversidad y análisis de las curvas de rarefacción………..
61 62 62 62 63 64 64 64 64
Resultados y Discusión………. 65
Capitulo 1: Caracterización de la comunidad microbiana del agua de hemodiálisis mediante métodos dependientes de cultivo……… 67
R1.1. Muestreo mensual rutinario: Seguimiento del sistema de distribución de agua de diálisis ………..
R1.1.1. Recuento de bacterias cultivables………
R1.1.2. Análisis físico-químico, carbono orgánico total y determinación de endotoxinas de las muestras de agua………
69 69 70 R1.2. Muestreo trimestral: Caracterización de la comunidad microbiana presente en el punto M3 del anillo de distribución………..
R1.2.1. Muestreo Noviembre 2012……….……….
R1.2.2. Muestreo Febrero 2013………
R1.2.3. Muestreo Mayo 2013………..
R1.2.4. Muestreo Agosto 2013………....
R1.2.5. Muestreo Noviembre 2013.……….
R1.2.6. Caracterización de la comunidad microbiana. Análisis filogenético de los aislados en base a la secuenciación del gen 16S rRNA y a los espectros proteicos obtenidos por MALDI-TOF MS………..
R1.2.7. Identificación de los aislados mediante la base de datos Biotyper.
Creación de una base de datos in-house a partir de los espectros proteicos………....
R1.2.8. Análisis de diversidad y curvas de rarefacción………
71 72 74 76 77 78
80
109 110 Capitulo 2: Caracterización de la comunidad microbiana del agua de hemodiálisis mediante métodos independientes de cultivo, DAPI y TSA- FISH………... 117
R2.1. Determinación del número total de células microbianas y detección de grupos
microbianos particulares……….………... 119
Capitulo 3: Caracterización de la comunidad microbiana del agua de hemodiálisis mediante métodos independientes de cultivo, pirosecuenciación de los amplicones
16S rDNA y rpoD..……… 123
R3.1. Muestras analizadas..………... 125
R3.2. Análisis bioinformático y caracterización de la comunidad en base al análisis de los amplicones del gen 16S rRNA……….
R3.2.1. Análisis bioinformático: Cribado, detección de quimeras y construcción de OTUs………
R3.2.1.1. Análisis de la calidad y la longitud de las lecturas. Cribado……...
R3.2.1.2. Detección de quimeras. Efecto CHIMERA-CHECK………..
R3.2.1.3. Asignación de OTUs al 97 % de similitud………
R3.2.2. Clasificación filogenética del gen 16S rRNA mediante RDP classifier…..
R3.2.3. Caracterización filogenética de la comunidad en base al gen 16S rRNA…
R3.2.3.1. Caracterización filogenética a nivel de filo………...
R3.2.3.2. Caracterización filogenética a nivel de clase……….
R3.2.3.3. Caracterización filogenética a nivel de orden………
126 126 126 129 129 132 133 133 133 134
R3.2.3.4. Caracterización filogenética a nivel de familia………...
R3.2.3.5. Caracterización filogenética a nivel de género………...
R3.2.3.5.1. Caracterización filogenética a nivel de género en las muestras individuales………
R3.2.3.5.2. Caracterización filogenética a nivel de género al comparar las distintas muestras……….
R3.2.4. Análisis de diversidad y curvas de rarefacción basadas en el análisis del gen 16S rRNA………..
135 140 140 146 153 R3.3. Análisis bioinformático y caracterización de la comunidad en base al análisis de
los amplicones del gen rpoD………. 159
R3.3.1. Análisis bioinformático: Cribado, detección de quimeras y construcción de
OTUs……… 159
R3.3.2. Identificación de especies del género Pseudomonas mediante OPUs…...
R3.3.2.1 Identificación de especies del género Pseudomonas mediante OPUs en las muestras individuales………
R3.3.2.2. Caracterización de la comunidad bacteriana del Hospital Son Llàtzer y el Hospital Universitario Son Espases basada en el gen rpoD………..
R3.3.2.2.1. Caracterización de la comunidad bacteriana del Hospital Son Llàtzer………..
R3.3.2.2.2. Caracterización de la comunidad bacteriana del Hospital Universitario Son Espases………
163 164
166 167 174 R3.3.3. Análisis de diversidad y curvas de rarefacción para el gen rpoD………….... 182 Capitulo 4: Análisis metagenómica de la comunidad microbiana del agua de
hemodiálisis………..………. 185
R4.1. Muestras analizadas………. 187
R4.2. Caracterización de la comunidad microbiana del metagenoma procedente del Hospital Son LLàtzer………..………..
R4.2.1. Análisis funcional de los metagenomas HSLL-PRE y HSLL- POST……….
R4.2.2. Análisis filogenómico de los metagenomas HSLL-PRE y HSLL- POST……….
R4.3. Caracterización de la comunidad microbiana del metagenoma procedente del Hospital Universitario Son Espases………..
R4.3.1. Análisis funcional de los metagenomas HSE-2012 y HSE- 2013………..
R4.3.2. Análisis filogenómico de los metagenomas HSE-2012 y HSE-2013……..
187 189 193 195 196 197 Discusión general.………. 201 Conclusiones…….………..……….. 211
Referencias………...……… 215
AGRADECIMIENTOS
Llegar a este punto de mi tesis, y empezar a escribir los agradecimientos, hasta hace unos meses lo veía como algo casi imposible, pero aquí estoy, y en contra de todo mi pesimismo, creo que lo he logrado, pero nada de esto hubiese sido posible sin la ayuda de muchas personas, a las que tengo mucho que agradecer y que fueron fundamentales para llegar a buen puerto.
En primer lugar, quiero dar las gracias a mi director de Tesis, Jorge Lalucat, por confiar en mi trabajo y darme la oportunidad de realizar una Tesis, por estar siempre ahí, para resolver dudas y problemas y encontrar una solución a todo. Un agradecimiento muy especial a mi otra directora de Tesis, Margarita Gomila, gracias por todo, y todo es, confiar en mí cuando decidí hacer el practicum de microbiología y me escogiste, sin apenas conocerme, este fue mi primer paso y el que me permitió llegar al laboratorio de microbiología, gracias por tu paciencia al enseñarme cosas que para mi eran completamente nuevas y que no se aprenden en las aulas, sino con la práctica, gracias por la pasión y dedicación que le pones a todo lo que haces y que terminaste transmitiéndome, por tus regañinas que me enseñaron a como trabajar en el laboratorio y a ser más eficiente (que no sé si lo he logrado) y por hacerme ver que las cosas son posibles, si le pones toda las ganas y buena energía, por tu comprensión y preocupación en momentos difíciles, tanto profesionales como personales, lo cual ha sido muy importante para mí. Creo que en este párrafo no alcanzo a expresar mi gratitud y simplemente diré que sin ti esta tesis no habría sido posible. Gracias a ambos por el esfuerzo y trabajo puesto en esta Tesis, sobre todo en el momento en que ves, que todo puede ser posible y que hay una luz al final del túnel.
Al dar las gracias al resto de jefes, empezare por dar las gracias a Elena García-Valdés, quien es la investigadora principal del proyecto en el que se ha enmarcado esta Tesis, por su interés en mi trabajo, por darme siempre ánimos y en lo personal por querer conocer todo lo relacionado con mi país de origen, Colombia. Gracias a Balbina, Rafa, y a Toni Bennassar, por interesarse en como lo llevaba y darme ánimos.
A todos en el laboratorio; María, Cati, Bel, Arantxa (gracias por tu colaboración en el capítulo de metagenómica), y Dani (con el que podía compartir mi pasión por el fútbol, en especial por el Barça), gracias por ser tan buenos compañeros, por compartir tantas risas y anécdotas durante todo este tiempo. Y en este último año, gracias por su interés en mi Tesis y en darme ánimo para seguir adelante. Aquí me gustaría hacer un apartado muy especial, para referirme a Magda, Cris y David, gracias por todo, por ayudarme y guiarme en el laboratorio cuando llegue por primera vez, por enseñarme muchas cosas durante todos estos años, por su tiempo para escuchar mis historias estilo telenovela latinoamericana, por las conversaciones (a veces, un poco de besugos) sobre muchos temas menos de trabajo, por las risas, complicidades, y por darse cuenta (especialmente Magda), con solo mirarme a la cara, que las cosas no iban bien y preocuparse por mi y ser uno o varios hombros en los cuales poder llorar, me gustaría dedicarles un apartado a cada uno de ustedes, pero no hay suficiente espacio en estas páginas, para, darles las gracias simplemente por estar ahí, siempre que los necesité. Me gustaría agradecer especialmente a Toni B. por su valiosa ayuda con los muestreos, especialmente en el montaje de nuestro
“sistema de filtración” para hacer TSA-FISH y DAPI, el cual iba perfeccionando a medida que pasaba el tiempo (es un manitas), por darme una mano cuando era la primera vez que implementaba un protocolo y ayudarme a procesar muestras fundamentales para mi Tesis.
Gracias, por haberme ayudado siempre de buen agrado y con mucha paciencia y por nuestras
conversaciones, casi debates, sobre temas de actualidad y situaciones de la vida, en los que algunas veces no llegábamos a ponernos de acuerdo.
Además, me gustaría agradecer a todas aquellas personas que han estado en el laboratorio durante mi paso por éste; a Joseph, Mariana, Lady, Farid, Mohamed, a los practicum Andrés, Sebas, Freddy, Ana Cristina, Glenys, Carolina, Xisco, y especialmente a Deny, Alfaniris y Toni Nicolau quienes estuvieron conmigo durante su practicum y que con su trabajo contribuyeron en parte a esta Tesis, especialmente Toni quien con su Máster contribuyó al procesamiento de resultados de pirosecuenciación necesarios para esta Tesis. Todos han hecho parte de este recorrido y les doy las gracias. Un recuerdo especial para Juana, quien ha estado pendiente de mi Tesis y las pocas veces que nos veíamos, no dejaba de darme ánimo y buenos consejos, también para Claudia S, que pronto leerá, lo cual me alegra mucho.
Y ya para finalizar, agradecer, a la gente que está ahí siempre, y me refiero a Angel, Xisco y Guillem, oficiales de laboratorio, fundamentales en el buen funcionamiento del laboratorio y que con su trabajo han contribuido de algún modo a esta Tesis. A Trinidad y a Rosa de los
“Serveis Cientifico-tècnics”, gracias por su ayuda a la hora de organizar el tiempo para pasar las muestras y hacer que todos los resultados estuvieran cuando los necesitaba. Aquí nuevamente me gustaría hacer una mención especial de agradecimiento a Rosa Gomila, quien se encargó de procesar todas las muestras mediante el MALDI, mil gracias por tu ayuda, compromiso y preocupación, para que todo saliera bien, por dedicar tanto tiempo a procesar mis muestras y a elaborar la base de datos y por hacerme sentir que mi Tesis era importante para ti.
A Joan Gascó quiero agradecerle la ayuda prestada, en la toma de muestras de agua, realizadas en la unidad de hemodiálisis del Hospital Son Espases, las cuales son la base fundamental y objeto de investigación en esta Tesis doctoral.
Solo me queda agradecer a mis amigos, en especial a Sonia y a Edu, que aunque no entendían lo que estaba haciendo en mi trabajo, ni porque le dedicaba tanto tiempo, siempre me daban ánimo y fuerza para seguir adelante. Y porque son como mi familia en esta Isla.
A mi familia, que aunque lejos, siempre ha estado acompañándome en este viaje, especialmente a mi madre, que a pesar de explicarle muchas veces lo que estaba haciendo nunca ha terminado de entenderlo, pero eso no le ha impedido preocuparse por mi y desearme lo mejor en todo lo que hago, y pedirle a Dios, según sus palabras que me iluminara. A mi padre que ya no está entre nosotros pero sé que estaría muy orgulloso de lo que he logrado. A mis hermanos que siempre me preguntaban entre risas cuando me podían llamar Doctora y que no entendían mis horarios ni mi ritmo de trabajo, pero que siempre han estado interesados y orgullosos de lo que hago.
Y por último todo el agradecimiento del mundo para Keefer, solamente decirte que sin tu apoyo, no habría sido posible nada de esto, que estoy en este punto de mi vida gracias a ti, y que tu amor y optimismo, me han dado la fuerza necesaria para seguir adelante en todos los aspectos de mi vida y especialmente en este que ha sido tan difícil. Perdona mis malos momentos que no han sido pocos y el dejarte tan solo en estos últimos meses, simplemente sin ti no habría podido llegar hasta aquí. Gracias.
Esta tesis doctoral ha sido financiada por el proyecto CGL2011-24318/BOS del Ministerio de Economía y Competitividad.
RESUMEN
La calidad microbiológica de las aguas es de crucial importancia en el tratamiento sustitutivo renal de los pacientes sometidos a hemodiálisis. Las aguas de hemodiálisis utilizadas para la preparación del líquido de hemodiálisis constituyen un hábitat oligotrófico en el que pueden desarrollarse comunidades bacterianas complejas, con un elevado índice de diversidad procariota. Los microorganismos presentes en las aguas pueden formar biopelículas sobre los filtros, depósitos y conducciones de agua lo que dificulta su eliminación y facilita su persistencia. Algunas de estas bacterias son potencialmente patógenas y pueden ser el origen de infecciones nosocomiales o actuar como reservorio y medio de difusión de genes de resistencia a antibióticos. Además, algunos productos microbianos resultantes de la muerte y lisis microbiana, así como las “nanobacterias”, pueden atravesar los filtros de hemodiálisis, provocando reacciones inflamatorias en los pacientes con insuficiencia renal crónica.
La presente tesis doctoral pretende ampliar nuestros conocimientos sobre las bacterias constituyentes de estas biopelículas en las aguas de hemodiálisis, utilizando metodologías moleculares de nueva generación, así como nuevas estrategias de identificación de aislados bacterianos. El fin último es el conocimiento de las bacterias implicadas, así como el de las condiciones que favorecen su desarrollo, lo que permitirá establecer metodologías para su seguimiento y eliminación, consiguiendo unas aguas de hemodiálisis de mejor calidad y contribuyendo a la calidad de vida de las personas sometidas a este tratamiento.
RESUM
La qualitat microbiològica de les aigües de diàlisis es molt important en el tractament substitutiu renal dels malalts sotmesos a hemodiàlisis. Les aigües d’hemodiàlisis utilitzades per la preparació del líquid d’hemodiàlisis constitueixen un habitat oligotròfic on es poden desenvolupar comunitats bacterianes complexes, amb un alt nombre de diversitat procariota. Els microorganismes presents a aquestes aigües poden formar biopel·lícules damunt els filtres, depòsits i conduccions d’aigua, dificultant la seva eliminació i facilitant la seva persistència.
Alguns d’aquests bacteris son potencialment patògens i poden ser l’origen d’infeccions nosocomials o actuar com a reservoris i medi de difusió de gens de resistència a antibiòtics. A més, alguns productes microbians conseqüència de la mort i lisi microbiana, provoquen reaccions inflamatòries als malalts amb insuficiència renal crònica.
Aquesta tesis doctoral pretén ampliar els nostres coneixements sobre els bacteris que formen les biopel·lícules a les aigües d’hemodiàlisis, utilitzant metodologies moleculars de nova generació, així com noves estratègies d’identificació dels aïllats bacterians. Es pretén el coneixement dels bacteris implicats, així com de les condicions que afavoreixen el seu desenvolupament, permetent establir metodologies per el seu seguiment i eliminació, i aconseguir aigües d’hemodiàlisis de millor qualitat, contribuint a la qualitat de vida de les persones sotmeses a aquest tractament.
ABSTRACT
The microbiological quality of water is of crucial importance in the renal replacement therapy of patients undergoing haemodialysis. The water used to prepare haemodialysis fluid constitutes an oligotrophic habitat in which complex bacterial communities with a high level of diversity can develop. The microorganisms present in water can form biofilms on filters, tanks and water pipes which hinders their elimination and facilitates persistence. Some of these bacteria are potentially pathogenic, may be the source of nosocomial infections, and act as a reservoir and medium for the dissemination of antibiotic resistance genes. In addition, some microbial products resulting from the lyses and death of microorganisms, as well as "nanobacteria", can pass through the haemodialysis filters, causing inflammatory reactions in patients with chronic renal failure.
The aim of this doctoral thesis is to expand our knowledge of the constituents of these biofilm bacteria in the waters of haemodialysis, using next-generation sequencing methodologies and new strategies for identifying bacterial isolates. The ultimate goal is the knowledge of the bacteria involved and the conditions that favour its development which will allow the establishment of methodologies for monitoring them and their removal, getting a better haemodialysis water quality and contributing to the quality of life of persons subject to this treatment.
INTRODUCCIÓN
La hemodiálisis es un procedimiento terapéutico para los pacientes con insuficiencia renal crónica o aguda, que se utiliza para eliminar los productos de desecho, el exceso de agua y sales minerales acumulados en el organismo como consecuencia de la insuficiencia renal. Durante la hemodiálisis, la sangre del paciente es conducida a través de unos capilares finos dentro de la máquina de diálisis, estos capilares están rodeados de líquido de diálisis que consiste en agua previamente tratada y electrolitos. Los capilares, actúan como membranas semipermeables y por lo tanto las sustancias que necesitan ser retiradas de la sangre del paciente y que normalmente se excretan en la orina de individuos sanos, son capaces de difundirse desde la sangre hacia el líquido de diálisis y por lo tanto ser eliminadas del organismo del paciente. Esta membrana semipermeable puede también permitir el acceso directo de los contaminantes que pueden estar presentes en el líquido de diálisis. Este líquido de diálisis se trata de una solución electrolítica preparada extemporáneamente por el monitor de hemodiálisis a partir de agua purificada y solutos proporcionados en forma de concentrados electrolíticos o sales no disueltas. La composición del líquido de diálisis así formado, es prácticamente isotónica y tiene una composición electrolítica parecida al plasma.
Los pacientes con enfermedad renal crónica sometidos a un tratamiento regular de hemodiálisis son objeto de al menos tres sesiones semanales de 3 a 4 horas cada una. Durante cada sesión de hemodiálisis, la sangre del paciente está potencialmente expuesta a aproximadamente 150 litros de líquido de diálisis, que se produce en línea a partir de agua purificada y del concentrado de diálisis; esto implica que el paciente está expuesto a aproximadamente 23.400 litros por año (Nystrand, 2008). Una unidad de diálisis produce más de 1.000.000 de litros de agua de diálisis por año. Mundialmente la producción de agua de diálisis es aproximadamente de 25.000.000.000 de litros, siendo en medicina uno de los productos más grandes en cuestión de volumen. Según un artículo de revisión de Rolf Nystrand en 2008 se estima que existen alrededor de 28.500 unidades de diálisis en todo el mundo, de las cuales solo unas 2000 unidades cumplen los requisitos de una estrategia de desinfección preventiva y el uso de técnicas microbiológicas de cultivo suficientemente sensibles (Nystrand, 2008).
El análisis de la calidad microbiológica de las aguas de hemodiálisis es un componente principal en el control de la calidad y la seguridad de los pacientes de hemodiálisis. En comparación con un individuo sano, la hemodiálisis aumenta la exposición del paciente al agua que pudiera estar contaminada. Esta exposición única y prolongada en combinación con el hecho de que los paciente en hemodiálisis tienen un sistema inmunológico comprometido, acompañado a menudo de complejas enfermedades, los pone en mayor riesgo de sufrir una infección. Cuanto más tiempo se exponga el paciente a un fluido de diálisis potencialmente contaminado, mayor es el riesgo de infección. Desde su creación, los avances en la tecnología han dado lugar a reducciones en el tiempo de las sesiones de hemodiálisis. Debido a estos avances y a la reducción de los tiempos en cada sesión, los riesgos de septicemia y endotoxemia como resultado de la hemodiálisis se han reducido notablemente.
El reconocimiento del riesgo potencial de la calidad del agua utilizada para la diálisis ha llevado al establecimiento de criterios y estándares en cuanto a su calidad microbiológica y a su composición química, determinados por varios órganos y comisiones. Existen varias recomendaciones hechas por asociaciones como la Asociación para el Avance en Instrumentación Médica (Association for the Advancement of Medical Intrumentation) o las Guías europeas de buenas prácticas en hemodiálisis (European Best Practice Guidelines for Hemodialysis) (Montanari et al., 2009) donde se especifican los límites de calidad en cuanto a
microorganismos y también las estrategias para su detección mediante métodos dependientes de cultivo, basadas principalmente en el análisis de muestras de agua en agar TGEA (tryptone glucose extract agar), TSA (tryptic soy agar) o R2A (Reasoner’s 2 agar). Sin embargo, existe mucha dificultad para llevar a cabo análisis microbiológicos adecuados que representen la biodiversidad, ya que utilizando diferentes técnicas de cultivo, los resultados de los recuentos pueden diferir de 2 a 4 logaritmos. Debido a esta dificultad y con el objetivo de obtener buenos estándares de calidad, se han creado desde el año 2009 diferentes normas ISO, como la ISO 13958, revisada en 2014, que especifica los requerimientos mínimos para el uso del concentrado de hemodiálisis, la ISO 13959 del 2014 que especifica los estándares mínimos del agua usada en hemodiálisis y la ISO 26722, revisada en 2014 dirigida a los fabricantes y/o proveedores de sistemas y/o dispositivos que se utilizan con el único objetivo de proporcionar agua para hemodiálisis o terapias relacionadas con el tratamiento de aguas (ISO2014a,b,c,d).
Resulta evidente la importancia de generar nuevos conocimientos acerca de la pureza microbiológica del agua de hemodiálisis y en particular, sobre la diversidad bacteriana presente en estas aguas. Que en un futuro han de permitir no sólo el desarrollo de nuevas estrategias para conseguir un líquido de diálisis que contenga sólo agua y sus componentes necesarios, sino que también dé información de las características fisiológicas y del papel de cada uno de estos microorganismos en la comunidad microbiana. Esta tesis doctoral se ha planteado para que así, se puedan diseñar sistemas para mejorar la eliminación microbiana y a su vez mejorar la calidad de vida de los pacientes sometidos a hemodiálisis.
I1. Importancia del tratamiento del agua para hemodiálisis.
El fluido utilizado en la diálisis, se compone principalmente de agua potable de distribución tratada, mezclada con una solución concentrada de electrolitos, equivalente a la concentración de electrolitos en el agua del plasma, un tampón y glucosa. La exigencia de la calidad del agua y del líquido de diálisis ha ido aumentando a lo largo de la corta historia de la técnica de hemodiálisis. Al principio se trataba de prevenir el síndrome de agua dura y las contaminaciones bacterianas (Ismail et al., 1996). Posteriormente hubo que enfrentarse a diferentes contaminantes difíciles de eliminar; entre los que se incluyen distintos metales como el aluminio, cuya intoxicación produce encefalopatía y osteomalacia (Hosokawa et al., 1990), o bien las cloraminas, que pueden provocar anemia por hemólisis en los pacientes sometidos a hemodiálisis (Barril et al., 1983, Botella et al., 1977). Frente a estos tipos de contaminantes asociados a complicaciones generalmente agudas, la mayor preocupación en los últimos años se ha centrado en los inconvenientes a mediano y largo plazo. Al considerar los posibles contaminantes que están presentes en el agua usada para preparar el líquido de diálisis, se distinguen tres tipos distintos de contaminantes a controlar: partículas, químicos y contaminación bacteriana (ver Tabla I1).
I2. Contaminantes habituales del agua.
El agua potable no es estéril, pero aun conteniendo distintos contaminantes, éstos se encuentran dentro de unos límites considerados admisibles que la hacen apta para el consumo humano.
Algunas de estas sustancias provienen de la propia fuente u origen del agua o de su sistema de distribución. Otras, por el contrario, son añadidas por las autoridades sanitarias con el fin de
mejorar sus cualidades de potabilidad o de sabor (Pérez García y Rodríguez Benítez, 2011). Por tanto, la composición del agua varía de un lugar a otro.
Tabla I1. Niveles admisibles en el agua purificada de posibles contaminantes a controlar (Pérez García y Rodríguez Benítez, 2011).
Contaminantes AAMI UNE111 Farmacopea
(mg/L o ppm) (1981) (2001)* (1990) Europea (2003)
Sustancias incluidas en los líquidos de diálisis
Calcio 2 2 2
Magnesio 4 4 2
Sodio 70 70 50
Potasio 8 8 2
Sustancias tóxicas reguladas para el agua potable
Antimonio 0,006* 0,006
Arsénico 0,005 0,005 0,005
Bario 0,1 0,1 0,1
Berilio 0,0004* 0,0004
Cadmio 0,001 0,001 0,001
Cromo 0,014 0,014 0,014
Mercurio 0,0002 0,0002 0,001
Plata 0,005 0,005 0,005
Plomo 0,005 0,005 0,005
Selenio 0,09 0,09 0,09
Otras sustancias identificadas como tóxicas en diálisis
Aluminio 0,01 0,01 0,01
Amonio 0,2
Zinc 0,1 0,1 0,1
Cloraminas 0,1 0,1 0,1
Cloro (Cloruros) 50
Cloro libre 0,5 0,5 0,5
Cobre 0,1 0,1 0,1
Flúor 0,2 0,2 0,2
Nitrato (como N) 2 2 2
Sulfatos 100 100 50
Talio 0,002* 0,002
Metales pesados 0,1
Microbiología y endotoxinas
Recuento de colonias (ufc) 200 200 100
Endotoxinas (LAL, UI/ml) 0,25
*LAL, Lisado de amebocitos de Limulus.
Los posibles contaminantes presentes en el agua utilizada para preparar el fluido de diálisis pueden clasificarse en partículas, solutos y microorganismos. Éstos últimos, a su vez, pueden subdividirse según sus propiedades en distintos subtipos, como podemos ver en la Tabla I2. Por otro lado, el propio tratamiento del agua y su sistema de distribución pueden ser fuente de
contaminación. Así, las resinas de los descalcificadores y desionizadores o el carbón activado pueden ser fuente de contaminación bacteriana que pueden ser causa de graves intoxicaciones, del mismo modo que el uso inadecuado de sistemas de conducción de cobre o plomo, o la presencia de restos de desinfectantes o desincrustantes empleados en la esterilización del sistema de tratamiento (Perez-García y Rodríguez Benítez, 2011). Además de los microorganismos intactos, una gran variedad de productos o constituyentes de los microorganismos se pueden liberar en cualquier fluido como resultado de su crecimiento activo o por su lisis. Todo ello afecta a la pureza del líquido de diálisis. Esta pureza es altamente relevante, ya que la exposición crónica de pacientes de hemodiálisis a bajos niveles de componente microbianos inductores de citoquinas puede contribuir significativamente al estado de microinflamación en estos pacientes (Glorieux et al., 2012).
Tabla I2. Contaminantes del agua (Pérez-García y Rodríguez Benítez, 2011).
Partículas. Producen la turbidez del agua.
- Minerales - Coloides
Solutos. Sustancias disueltas/hidrosolubles - Inorgánicos: iones
Cationes (Na, Ca, Mg, Fe, ZN, Cu, Pb, etc.)
Aniones (Cl, F, nitrato, sulfato, bicarbonato, etc.) - Orgánicos
Sustancias naturales (lignina, tanino, etc.)
Sustancias no naturales, provenientes de la agricultura (Insecticidas, pesticidas, abonos, etc.) o de la industria (aguas residuales, derivados de petróleo, minería. etc.)
Endotoxinas, provenientes de los microorganismos Microorganismos
- Bacterias - Levaduras - Hongos - Protozoos - Virus
Sustancias añadidas por las autoridades sanitarias
- Cloro, cloraminas, sulfato de aluminio y flúor. Más raramente ante la presencia de algas, sulfato de cobre.
El tratamiento adecuado del agua para hemodiálisis incluye distintas etapas para eliminar contaminantes químicos, partículas y microorganismos. Estas etapas pueden definirse como preparación, pretratamiento, tratamiento y distribución. La preparación del agua consiste en eliminar la mayoría de las partículas en suspensión. Este paso se logra habitualmente mediante filtros de 500 a 5 µm de poro. El pretratamiento, mediante el uso de descalcificadores, microfiltros o filtros submicrónicos, y filtros de carbón activado, debe conseguir la mayor eliminación posible de partículas, la desaparición de las cloraminas y materia orgánica, así como la disminución de la cantidad de cationes, seguido de la ósmosis reversa, que es el elemento fundamental en la mayoría de los tratamientos de agua. Por último, son muy
importantes las desinfecciones regulares preventivas. Cuando se quiere obtener un agua ultrapura además, es necesario colocar en serie un desionizador u otro sistema de ósmosis inversa.
En el sistema de distribución del agua en una unidad de hemodiálisis, el agua tratada es propulsada por una bomba de presión, a través del anillo de distribución, hasta las máquinas de hemodiálisis. El circuito debe ser cerrado y el agua tiene que circular a una velocidad superior a 1 m/s, para minimizar los riesgos de contaminación y la formación de biopelículas. El agua no consumida debe retornar al sistema de tratamiento de agua y pasar de nuevo por él. En el diseño del anillo de distribución deben evitarse los espacios muertos, donde fácilmente puede producirse crecimiento bacteriano e inducirse la formación de biopelículas, difícilmente eliminables una vez establecidas.
I3. Pureza y calidad del agua para hemodiálisis.
Según sea necesario, pueden usarse dos grados distintos de pureza para el agua en hemodiálisis:
agua purificada y agua altamente purificada o ultra pura. El agua purificada es la forma básica de agua tratada, válida para las modalidades de hemodiálisis convencional, mientras que el agua altamente purificada es el agua estándar para preparar un líquido de diálisis ultrapuro. El agua ultrapura puede ser una alternativa para cualquier modalidad de hemodiálisis, además es mucho más que deseable en la diálisis de alto flujo y es requisito previo en las modalidades de hemodiafiltración y hemofiltración que usan la producción en línea del líquido de sustitución.
La contaminación microbiológica del agua purificada debería cumplir las Recomendaciones de la Farmacopea Europea, recuento bacteriano menor de 100 ufc/ml y menos de 0,25 UI/ml de endotoxinas y el agua altamente purificada o ultrapura debe contener menos de 10 ufc/100 ml y 0,03 UI/ml (Peréz-García et al., 2004). En la Tabla I3 se muestran los niveles de contaminación bacteriana permitidos según las guías de la Sociedad Española de Nefrología.
Tabla I3. Normas de calidad del agua para hemodiálisis. Niveles de contaminación bacteriana según las guías de la SEN.
Bacterias (ufc/ml)
Endotoxinas LAL* (UI/ml)
Agua purificada 100 0,25
Agua ultrapura 10 ufc/100 ml 0,03
Concentrados 0,5
Líquido de diálisis estándar 1000 0,5
Líquido de diálisis ultrapuro 1 0,03
*LAL, Lisado de amebocitos de Limulus.
La evolución en el tratamiento de la insuficiencia renal crónica en las últimas décadas, desde la hemodiálisis con membranas de bajo flujo a membranas de alto flujo, seguido por la introducción de hemodiafiltración en línea, ha llevado a un mayor enfoque en la pureza del líquido de diálisis. La hemodiálisis de alto flujo se aplica actualmente a casi el 50 % de los pacientes renales en todo el mundo (Blankestijn et al., 2010). Las membranas de alto flujo se introdujeron con el objetivo de reducir la morbilidad y mortalidad de los pacientes sometidos a hemodiálisis ya que ofrecen una mejor biocompatibilidad y eliminación de grandes solutos de retención urémica.
A pesar de que el agua utilizada en la hemodiálisis no es estéril, los niveles de bacterias y productos derivados de bacterias tienen que ser lo suficientemente bajos. Las Asociaciones renales españolas y europeas recomiendan valores de menos de 100 ufc/ml, y menos de 0,25 UI/ml de endotoxina como los estándares de agua (Pérez-García et al., 2004). Los valores correspondientes para el líquido de diálisis son <1000 ufc/ml y <0,5 UI/ml de endotoxina. De acuerdo con las normas de la Asociación Americana para el Avance de la Instrumentación Médica, el máximo permitido nivel de bacterias viables es de 200 ufc/ml y menos de 2 UI/ml de endotoxina para el agua utilizada para preparar el dializado, y 2000 ufc/ml para el fluido de diálisis final. Aún cuando los bajos niveles de bacterias y productos químicos (valores para el carbono orgánico total, nitrógeno, fósforo, y sulfato tienen que ser menos de 1 mg/l; Kulakov et al., 2002) se alcancen en los pasos de purificación, el agua tiene que ser transportada hasta los pacientes en la unidad de diálisis, y el crecimiento de bacterias oligotróficas en los sistemas de distribución puede representar un nuevo factor de riesgo a tener en cuenta.
La calidad microbiológica se determina de forma rutinaria por el número de bacterias cultivables, crecidas en medios estándar (como el agar Mueller-Hinton, agar sangre, y el agar soja triptona), sin especificar las especies bacterianas presentes en esta aguas. Los sistemas de aguas depuradas utilizadas para la preparación del líquido de diálisis constituyen un hábitat oligotrófico en el que pueden desarrollarse comunidades bacterianas complejas, con un elevado índice de diversidad de especies. Por lo tanto, conocer la diversidad microbiana presente en el sistema de aguas de hemodiálisis es crucial, debido a los efectos perjudiciales de las bacterias y los productos derivados de estas, como son los lipopolisacáridos, glicolípidos, cianotoxinas, peptidoglucanos y oligonucleótidos, responsables de los efectos nocivos en pacientes de hemodiálisis (Balakrishan et al., 2000, Schindler et al., 2004). La pureza microbiológica en sistemas de agua de hemodiálisis es crucial para la prevención de la inflamación crónica silenciosa asociada a aguas de hemodiálisis (Lonneman, 2000), de la amiloidosis secundaria derivada de la hemodiálisis (Floege y Ketteler, 2001), para la reducción de reacciones pirogénicas (Pegues et al., 1992) y para mejorar el control de la anemia tras la insuficiencia renal crónica (Sitter et al., 2000). Todos ellos, problemas relacionados principalmente con la presencia de bacterias, endotoxinas y productos derivados de bacterias (Canaud et al., 2000).
El control de la calidad microbiológica del agua en la hemodiálisis depende del mantenimiento de todo el sistema de agua. Se ha demostrado que los problemas de contaminación microbiana de los sistemas de diálisis son el producto de muchos factores que incluyen sistemas de tratamiento insuficiente del agua y de los sistemas de distribución del dializado.
A pesar de estos tratamientos y precauciones, la eliminación completa de microorganismos en las aguas de hemodiálisis se considera prácticamente imposible (Kulakov et al., 2002), por lo que es necesaria una buena estrategia de desinfección para asegurar una buena calidad de agua que nos permita un control sobre los microorganismos presentes. Estas estrategias incluyen técnicas como ósmosis inversa, filtros de carbón activo, filtros submicrónicos, desinfecciones regulares preventivas, etc. Los investigadores han citado varios factores que contribuyen a la contaminación bacteriana persistente en centros de hemodiálisis, como la presencia de pirógenos en el equipo de desionización, la desinfección inadecuada del sistema de distribución, el paso de endotoxinas del dializado al plasma, la colonización microbiana de superficies de las tuberías derivadas de un diseño hidráulico subóptimo, la presencia de un depósito de almacenamiento, uso de agua de enjuague no estéril, y un programa de vigilancia microbiológica insuficiente (Montanari et al., 2009). El proceso de desinfección en sí, no sólo
incluye el procedimiento en sí mismo, sino que la frecuencia de la desinfección, tal y como se ha observado previamente, es mucho más importante (Nystrand, 2008). Una frecuencia de desinfección mensual mediante hipercloración con hipoclorito sódico a niveles de 30 ppm parece no afectar significativamente a la estructura de la comunidad bacteriana aunque si permite controlar el aumento de los microorganismos (Gomila et al., 2005, 2006).
De manera general en todos los sistemas de distribución de aguas, los tubos, tanques y grifos representan reservorios de microorganismos que contribuyen a la creación de biopelículas que, una vez formados, son extremadamente difíciles de erradicar mediante métodos químicos o mecánicos. De hecho, diversos estudios muestran como la presencia de biopelículas en los tubos y en los tanques acarrean una alta resistencia a agentes químicos (Capelli et al., 2006, Oie et al., 2003).
En el sistema de aguas de hemodiálisis, incluso después de las etapas de purificación en los que se logran niveles bajos de bacterias y de sustancias químicas (con valores inferiores a 1 mg/l en carbón orgánico, nitrógeno, fósforo y sulfato), se observa crecimiento de bacterias oligotróficas.
Esto puede permitir la difusión de bacterias potencialmente patógenas y/o subproductos de estas bacterias a la sangre de los pacientes en tratamiento con hemodiálisis, con sus consecuentes efectos perjudiciales. A pesar de las precauciones las tuberías, filtros, membranas, grifos, tanques y otras superficies proporcionan sitios favorables para la creación de biopelículas, donde pueden crecer bacterias que utilizan tanto nutrientes orgánicos como inorgánicos. Estos biopelículas son una de las causas principales de la falta de efectividad para la eliminación completa de la comunidad microbiana con las desinfecciones mensuales preventivas (Gomila et al., 2005). Los productos bacterianos generados por tales biopelículas son capaces de atravesar la membrana de hemodiálisis los cuales provocan una respuesta inflamatoria en pacientes con deficiencia renal en tratamiento con hemodiálisis (Hoenich y Levin, 2003).
Aunque el agua usada en hemodiálisis no es estéril, la presencia potencial de bacterias, incluso en bajas cantidades contribuye a una menor calidad del proceso de diálisis. La identificación de los miembros de la comunidad bacteriana en diferentes puntos del sistema de distribución del agua es de suma importancia para establecer el origen de las bacterias, evaluar el efecto de los desinfectantes en el tratamiento y sistema de distribución del agua y valorar con precisión el riesgo asociado a la presencia de patógenos y bacterias oportunistas.
I4. Características biológicas de los contaminantes microbianos.
Cuando consideramos los posibles contaminantes, que pueden estar presentes en el agua utilizada para preparar el líquido de diálisis, tal y como hemos dicho antes, se pueden distinguir tres tipos: (i) partículas, (ii) contaminación química, (iii) contaminación bacteriana. El presente trabajo de tesis doctoral se enfocará principalmente en la contaminación bacteriana y en la caracterización de las comunidades bacterianas presentes en aguas de hemodiálisis. Junto a microorganismos intactos tales como bacterias, hongos y levaduras, existe una gran variedad de derivados microbianos o fragmentos que pueden ser liberados en cualquier fluido durante el crecimiento activo y la lisis de los microorganismos. El tema de la pureza del agua de diálisis tiene mucha relevancia, ya que la exposición crónica de pacientes de hemodiálisis a bajos niveles de componente microbianos inductores de citoquinas, puede contribuir significativamente al estado de microinflamación en estos pacientes (Glorieux et al., 2012). Los derivados de bacterias actúan como sustancias pirogénicas al ser capaces de estimular a las
células presentadoras de antígenos, fundamentalmente a los monocitos. En la Tabla I4 se resume la clasificación de los productos pirogénicos derivados de bacterias Gram-negativas atendiendo a su origen y peso molecular. Muchos de ellos, tienen pesos moleculares inferiores a 10 KDa, pudiendo pasar las membranas de diálisis tanto por retrofiltración como por retrodifusión.
I4.1. Microorganismos intactos.
El agua utilizada para la preparación de líquido de diálisis no es estéril en el origen, por lo tanto, los microorganismos presentes deben mantenerse bajo control, evitando la proliferación bacteriana con el fin de limitar la contaminación biológica. En un estudio de los fluidos de diálisis realizado en 1974 se detectaron bacterias Gram-negativas como Pseudomonas, Xanthomonas (Stenotrophomonas), y Flavobacterium (Favero et al., 1974). Estas bacterias Gram-negativas son comunes en aguas y se consideran no patógenas, aunque cuando se introducen en gran número en pacientes fisiológicamente comprometidos, como es el caso de pacientes en un centro de hemodiálisis, pueden provocar efectos tales como reacciones pirogénicas y bacteriemias. En un estudio realizado por Bambauer et al. (1994), evaluando la calidad microbiológica del agua y líquido de diálisis en 30 centros de hemodiálisis en Alemania, se observó que las bacterias del género Pseudomonas (Gram-negativa y fuente de endotoxinas), resultaron ser más prevalentes tanto en el agua como en el líquido de diálisis. Sin embargo, también se detectaron microorganismos Gram-positivos (fuente de peptidoglucano) de los géneros Micrococcus y Staphylococcus (Bambauer et al., 1994). Recientemente, mediante técnicas de identificación bacteriana más sofisticadas, se demostró que el agua de hemodiálisis contenía predominantemente bacterias Gram-negativas de las clases α-Proteobacteria y β- Proteobacteria, así como micobacterias (Gomila et al., 2006).
Las altas concentraciones de contaminación bacteriana en los fluidos de diálisis se asocian con una mayor incidencia de reacciones febriles. La evidencia epidemiológica ha mostrado un aumento del riesgo de reacciones pirogénicas y septicemia cuando el nivel de contaminación supera 10.000 ufc/ml. Sin embargo, no hay aumento del riesgo de reacciones pirogénicas cuando el nivel de contaminación está entre 1.000-2.000 ufc/ml (Favero y Petersen, 1977) en el dializado. Sin embargo, los estudios muestran que los recuentos microbianos en agua, mayores de 100-200 ufc/ml representan un riesgo debido a la potencial amplificación microbiana en otras partes del sistema de diálisis (Favero y Petersen, 1977).
Reacciones inflamatorias subclínicas repetitivas en pacientes de hemodiálisis se pueden atribuir a un dializado contaminado (Canaud et al., 2000). Además, accesos vasculares frecuentes y prolongados proporcionan la oportunidad para que las bacterias entren en el torrente sanguíneo del paciente en hemodiálisis.
En el sistema de aguas de hemodiálisis, incluso después de las etapas de purificación en los que se logran niveles bajos de bacterias y de sustancias químicas (con valores inferiores a 1 mg/l en carbón orgánico, nitrógeno, fósforo y sulfato), se observa crecimiento de bacterias oligotróficas.
Esto puede permitir la difusión de bacterias potencialmente patógenas y/o subproductos de estas bacterias, a la sangre de los pacientes en tratamiento con hemodiálisis, con sus consecuentes efectos perjudiciales.
Tabla I4. Clasificación de los productos pirogénicos derivados de bacterias Gram-negativas atendiendo a su origen y peso molecular.
Pirógenos exógenos Peso molecular
Componentes de la pared bacteriana, liberados por lisis
Endotoxinas o lipopolisacáridos > 100.000
Fragmentos de lipopolisacáridos asociados a lípido A* 2.000-4.000
Otros fragmentos de lipopolisacáridos* < 8.000
Peptidoglucanos 1.000-20.0000
Muramilpéptidos 400-1.000
Toxinas secretadas activamente, que no precisan la lisis bacteriana Exotoxina A
66.000
Fragmentos de exotoxina A < 5.000
Otras exotoxinas 20.000-50.000
ADN bacteriano Oligonucleótidos
*Contaminantes pirogénicos detectables por lisado de amebocitos de Limulus (test LAL).
Cuando el número de bacterias es demasiado alto, generalmente con recuentos de más de 1.000 ufc/ml, los microorganismos viables pueden cambiar de ser planctónicos (es decir, flotando libremente en el entorno del agua), a sésiles (es decir, fijados de manera permanente). En algunos casos la formación de biopelículas se debe a un proceso llamado “quorum sensing”, (Abraham, 2006). Estas biopelículas son una de las causas principales de la falta de efectividad para la eliminación completa de la comunidad microbiana con las desinfecciones mensuales preventivas (Gomila et al., 2005). La mayoría de estas bacterias pueden usar trazas de nutrientes orgánicos e inorgánicos, multiplicarse para formar biopelículas y durante este proceso, las bacterias se adhieren a las superficies, que en el caso del circuito de diálisis, por lo general son las membranas de ósmosis reversa (OR), las tuberías de distribución o los tubos del monitor de diálisis y filtros. Una vez adheridos, las bacterias se encierran en sí mismas en una matriz hidratada de polisacáridos y proteínas y forman una capa de biopelícula viscosa, que a su vez se desprenden al madurar, pasando a ser planctónicas (McFeters et al., 1993), potencialmente patógenas y pueden ser causa de liberación de endotoxinas, pequeños fragmentos de ADN bacteriano (oligodesoxinucleótidos), que activan los receptores tipo Toll en monocitos e inducen la producción de citoquinas, lo que conduce a una respuesta inflamatoria, esfingolípidos, componentes de la pared celular u oligonucleótidos. Todos estos fragmentos bacterianos generados por tales biopelículas pueden atravesar la membrana de diálisis (Schindler et al., 2004) con consecuencias desfavorables en la salud de los pacientes sometidos a hemodiálisis.
(Hoenich et al., 2003). Una biopelícula establecida causa contaminación recurrente y es muy difícil de erradicar con los procedimientos de desinfección habituales (Capelli et al., 2006).
Estos sistemas necesitan una desinfección regular, incluyendo el sistema de distribución y los tanques de almacenamientos, así como la monitorización microbiana del agua de diálisis y del sistema de distribución, para prevenir la formación de la biopelícula (Penne et al., 2009, Smeets et al., 2003).
I4.2. Derivados bacterianos.
I4.2.1. Lipopolisacáridos y fragmentos de lipopolisacáridos.
Las endotoxinas son lipolisacáridos termoestables y el mayor componente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas. La molécula de lipopolisacárido consiste en una fracción hidrofóbica, un lípido A, y un polisacárido específico O que está unido covalentemente al lípido A por un núcleo o core oligosacárido de una variabilidad estructural limitada (Luderitz et al., 1983). La masa molecular del lipolisacárido varía entre 2000 y 20000 Da, aunque se pueden formar fácilmente agregados más grandes llamados micelas. Además, la gran heterogeneidad estructural del lipolisacárido se refleja en su diferente actividad biológica (Caroff et al., 2002).
Se ha demostrado que los lipolisacáridos contaminan los fluidos de diálisis a niveles de 2 unidades de endotoxinas (UI/ml) (Praditpornsilpa et al., 2011) o aún más altas, hasta 7,68 UI/ml (ver ‘National and international standards for dialysis water and fluid purity’ y la Tabla I5) (Glorieux et al., 2009, 2012). Esto puede causar problemas inflamatorios, ya que el lipolisacárido puede atravesar las membranas con un tamaño de poro grande, por retrofiltración/retrodifusión desde el fluido de diálisis al compartimiento sanguíneo (Vanholder et al., 1992).
Existe poca relación entre la contaminación bacteriana medida en unidades formadoras de colonias por mililitro en los cultivos (ufc/ml), los niveles de endotoxinas detectables por lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (Klein et al., 1990) y la producción de citoquinas. Se ha observado que algunas endotoxinas en concentraciones plasmáticas de sólo 0,05 ng/ml son capaces de inducir la formación de interleuquina 1 (IL-1)(Baurmeister et al., 1989).
La estimulación de citoquinas en la sangre depende tanto de la concentración de endotoxina en el líquido de diálisis como de la permeabilidad de la membrana de diálisis (Bommer y Jaber, 2006). Se ha visto que hay un aumento del riesgo de bacteriemia o endotoxemia cuando el nivel de bacterias y endotoxinas en el liquido de diálisis es alto, a su vez aumenta la probabilidad que éstas atraviesen la membrana de diálisis o estimulen la producción de citoquinas.
Fragmentos de lipopolisacárido por debajo de 8000 Da no son detectados por el LAL test, aunque fragmentos con pesos moleculares inferiores a 3000 Da que corresponden a la forma monomérica de la endotoxina, inducen la IL-1(Caroff et al., 2002). Por lo tanto, la ausencia de reactividad del test LAL no es suficiente evidencia de la ausencia de lipopolisacárido biológicamente activo en líquidos de hemodiálisis.
I4.2.2. Peptidoglucano.
El peptidoglucano, o capa de mureína, es uno de los principales componentes de la pared celular bacteriana. Químicamente los peptidoglucanos son heteropolímeros complejos compuestos de una cadena larga de glucanos que están reticulados por péptidos cortos. La contaminación de líquido de diálisis con peptidoglucanos se describió hace unos pocos años en el contexto de la diálisis peritoneal, cuando se demostró que los peptidoglucanos eran la causa de una epidemia de peritonitis aséptica en pacientes sometidos a este procedimiento (Martis et al., 2005).
Aunque los fluidos cumplían los niveles de pureza establecidos por la farmacopea en relación con el recuento de bacterias y el nivel de endotoxinas, éstos causaron una respuesta inflamatoria, lo cual indicó que los métodos clásicos utilizados para la detección de
contaminación, eran insuficientes para detectar varios tipos de derivados bacterianos (Glorieux et al., 2009).
I4.2.3. Fragmentos cortos de ADN bacteriano.
Los ADN bacterianos contienen más motivos desoxicitosina-desoxiguanosina fosfato no metilados (CpG) que el ADN humano, lo cual activa los mecanismos de defensa del huésped y conducen a la respuesta inmune innata y adquirida. Los ADNs bacterianos se han detectado en agua de ósmosis reversa y en líquido de hemodiálisis en unos valores entre 0.02 ± 0.28 μg/mL, básicamente porque se eliminan parcialmente por ultrafiltración. Pueden difundir a través de la membrana de alto flujo, contribuyendo a la inflamación en pacientes de hemodiálisis (Schindler et al., 2004), estimulando la producción de citoquinas por parte de células mononucleares de los pacientes con enfermedad renal crónica y promoviendo la supervivencia celular de estas células pro-inflamatorias mediante la disminución de la apoptosis (Navarro et al., 2007). Además, estimulan la respuesta inflamatoria de monocitos CD14+ CD16+ los cuales se ven incrementados en pacientes de hemodiálisis, y la liberación de factores inflamatorios causando apoptosis de células endoteliales (Merino et al., 2008). A su vez, niveles circulantes de ADN bacteriano están asociados con niveles altos de proteína C reactiva y de IL-6 en estos pacientes (Bossola et al., 2009).
Tabla I5. Estándares internacionales para la pureza del agua y fluido de diálisis.
Estándares EBPG (ERBP)
(2002)
ANSI/AAMI RD52 (2004)
ANSI/AAMI/ISO 11663:2009 Agua pura (P)
ufc/mL < 100 200 (AL: 50) < 100 (AL: 50)
UI/mL < 0.25 2 (AL: 1) < 0,25 (AL: 0.125)
Liquido diálisis Estándar
ufc/mL < 100 200 (AL: 50) < 100 (AL: 50)
UI/mL < 0,25 2 (AL: 1) < 0,5 (AL: 0.25)
Agua ultrapura (UP)
ufc/mL < 0,1 0,1 < 0,1
UI/mL < 0,03 0,03 < 0,03
Liquido de sustitución Estéril
ufc/mL < 0,1 < 10−6 SAL 10−6
UI/mL < 0,03 < 0,03 < 0,03 (apirógeno)
EBPG, European Best Practice Guidelines; ANSI/AAMI, American National Standards
Institute/Association for Advancement of Medical Instrumentation; ISO, International Organization for Standardization; ufc, unidades formadoras de colonias; UI, unidades de endotoxinas; AL, Alert (AAMI) or
Action (ISO) level; Sterility Assurance Level (SAL) 10-6, menos de una posibilidad entre un millón de que
los microorganismos viable estarán presentes.
I.4.2.4. Respuesta al receptor Toll-like.
Los derivados descritos anteriormente son los llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), los cuales son detectados por moléculas de reconocimiento de patrones (PRMs). Los receptores Toll-like funcionan como PRMs y son transductores de señales en mamíferos, expresándose en monocitos, células dendríticas, células del endotelio vascular, adipocitos y células epiteliales intestinales (Akira et al., 2001). El TLR2 reconoce una variedad de derivados microbianos como lipopolisacáridos y peptidoglucanos, mientras que el TLR4 es esencial para la señalización en respuesta a los lipopolisacáridos de bacterias Gram-negativas, y el TLR9 en la señalización del ADN CpG. Todos estos sistemas de reconocimiento pueden inducir vías de señalización celular como las MAP Kinasas y NF-κB, dando lugar a la producción de citoquinas. Todos estos PAMPs descritos anteriormente, se pueden dar simultáneamente en fluidos de diálisis, ejerciendo efectos sinérgicos, e incrementando la respuesta inflamatoria a niveles mucho más altos que la suma esperada de efectos para la concentración especifica de un solo contaminante (Uehara et al., 2005).
I5. Métodos para la detección de contaminantes microbianos.
La calidad microbiológica del agua se determina de una forma rutinaria por el número de bacterias cultivables (ufc/ml) crecidas en métodos estándar como el agar sangre, agar soja triptona o agar R2A, y por el test LAL para determinar los niveles de endotoxinas, sin tener en cuenta las especies bacterianas presentes en el agua. En el año 2003 el grupo de microbiología de la Universidad de las Islas Baleares en un primer paso hacia la determinación de la diversidad bacteriana dentro de este hábitat, inició un proyecto con el Hospital Son Llàtzer, el cual se continuó en 2010 con el Hospital Universitario Son Espases. En este primer estudio de la calidad microbiología del agua de hemodiálisis se demostró la alta diversidad de bacterias alcanzada en monitores de hemodiálisis mediante la identificación de células bacterianas cultivables en agar R2A. Se realizó la identificación mediante técnicas dependientes de cultivo basado en la identificación a nivel de género o especie mediante el análisis de restricción de ADNr amplificado (ARDRA) y la subsecuente secuenciación parcial del gen 16S rRNA de la microbiota presente en distintos puntos del sistema de distribución de agua del Hospital Son Llàtzer. En este estudio, pionero en este campo, se observó una comunidad muy compleja y robusta donde se identificaron bacterias como Sphingomonas, Pseudomonas aeruginosa y micobacterias ambientales, descritas previamente como productoras de biopelículas en superficies. También se identificaron bacterias fijadoras de nitrógeno como Afipia, Bradyrhizobium, Herbaspirillum, Mesorhizobium, Rhizobium, que junto con otras bacterias quimiolitoautótrofas oxidadoras de hidrógeno (Paracoccus, Variovorax, Pelomonas y Cupriavidus) probablemente actúan como colonizadores secundarios de estas biopelículas, jugando un papel importante en el intercambio de nutrientes dentro de la comunidad. Junto a estas bacterias aparecen también otras especies que podrían actuar como patógenos oportunistas, como son miembros de los géneros Acinetobacter, Afipia, Bacillus, Brevibacterium, Methylobacterium, Mycobacterium y Stenotrophomonas. Los índices de diversidad mostraron que se trataba de una comunidad muy diversa, aunque la diversidad encontrada por métodos dependientes de cultivo fue muy inferior a la real (Gomila et al., 2005).
Pero no todas las bacterias presentes en las muestras de agua pueden ser cultivadas en medios de crecimiento estándar, sobre todo cuando estas muestras provienen de hábitats oligotróficos como las aguas de hemodiálisis. En muestras de aguas ambientales, existen organismos dentro
