6.3.1. Considerações gerais
O modelo animal mais adoptado pelos investigadores no nervo periférico é o nervo isquiático do rato Wistar para o estudo das funções motora e sensitiva e da regeneração nervosa. Também optámos por este modelo animal pelas semelhanças anátomo- fisiopatológicas existentes entre o nervo isquiático do rato Wistar e o nervo mediano humano, particularmente da sua vascularização33, considerando-se que, mesmo em microscopia
99 electrónica de varrimento para moldes vasculares, a morfologia entre os dois nervos é indistinguível. Esta semelhança entre os dois nervos suporta o uso do nervo isquiático do rato Wistar como material de experimentação animal para o nervo mediano humano.33
No estudo actual e no anterior, o animal de experimentação utilizado foi o Rato Wistar, proveniente do Biotério da FCM-UNL com alvará emitido pela DGV, de onde consta a autorização de utilização de animais, pequenos roedores, ao abrigo do disposto na Portaria 1005/92 de 23 de Outubro. Todos os procedimentos praticados nos animais, inclusive a eutanásia, regem-se pelas normas já descritas no Capítulo 2, no que diz respeito às Considerações Éticas e de Bem-estar do Animal.
Todas as intervenções executadas no animal de experimentação foram realizadas exclusivamente pela investigadora principal para que não existissem desvios de ordem individual.
6.3.2. Princípios Básicos Cirúrgicos no Animal de Experimentação
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em ratos adultos da linhagem Wistar, com um peso médio de 200-300 gramas, obtidos no Biotério da FCM-UN. Qualquer procedimento que provocasse dor ou sofrimento ao animal foi realizado sob anestesia geral através de uma injecção intra-peritoneal de quetamina/xilazina nas doses 90 mg/Kg e de 10 mg/Kg, respectivamente ou, na falta da xilazina, recorreu-se ao diasepan nas mesmas proporções.34 Nunca foram usados barbitúricos durante a cirurgia ou no pós-operatório, nem durante a própria cirurgia para colheita das biópsias, pois poderiam levar ao desenvolvimento de vasodilatação afectando os exames histológicos.
A cirurgia realizou-se com o animal posicionado em decúbito ventral com os membros dianteiros e traseiros em abdução. Foram respeitadas todas a normas da assepsia cirúrgica e a anti-sepsia cutânea foi realizada com uma solução de álcool iodado a 20 %.
A exposição do nervo isquiático direito obteve-se através de uma incisão cutânea transversal na parte externa da coxa, seguida da separação das fibras musculares do músculo bicepede femoral, de modo que se pudesse expor o nervo isquiático, permitindo a realização das diversas técnicas cirúrgicas propostas neste estudo e já publicadas por nós 28.
Terminados os estudos funcionais da regeneração nervosa, foram feitas as colheitas dos nervos isquiáticos intervencionados e dos respectivos nervos isquiáticos contra laterais para a biopsia para os estudos estruturais e morfométricos das peças cirúrgicas.
É importante realçar que as colheitas dos nervos isquiáticos são feitas sob anestesia geral, idêntica à usada para as cirurgias, e não com o animal eutanasiado previamente, pois o nervo é muito sensível à isquemia, iniciando-se muito precocemente alterações histológicas do nervo. Após estes procedimentos cirúrgicos foi realizada a eutanásia através de overdose por anestesia geral ou na câmara de CO2 de eutanásia do Biotério da FCM-UN dentro do seu horário de funcionamento.
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6.3.3. Procedimentos Cirúrgicos
Sob condições assépticas, em 45 ratos Wistar do sexo feminino, com um peso entre 200-300 gramas, foi excisado um segmento de 7 mm de nervo isquiático dt., preservando-se o plexo vascular epineural (Figura 6.3) e obtendo-se, assim, após a retracção dos topos do nervo seccionado, uma solução de continuidade do nervo de 10 mm.
Figura 6.3 A - Plexo vascular epineural (setas); B - Excisão de 7 mm de nervo isquiático com preservação do plexo epineural (ampliação 25 x).
Os ratos foram, então, aleatoriamente submetidos à reconstrução do defeito nervoso com um dos seguintes procedimentos: auto-enxerto do segmento excisado (Grupo A, n = 15); enxerto autólogo de veia jugular externa (Grupo B, n = 15); conduto produzido com membrana amniótica humana imunoinerte (Grupo C, n = 15).
No Grupo A (n = 15), o defeito nervoso de 10 mm, criado por uma excisão de 7 mm de nervo e com o plexo vascular epineural do sistema vascular extrínseco preservado, foi reparado com autoenxerto do fragmento de nervo excisado (Figura 6.4), A neurorrafia foi feita com pontos separados de Nylon 10/0, realizando-se uma anastomose epineural28, segundo o esquema que se apresenta na Figura 6.5.
101 Figura 6.4 - Exemplo de auto-enxerto de nervo com plexo epineural preservado; anastomose epineural com pontos separados de Nylon 10/0 (ampliação 25 x).
Figura 6.5 - Representação esquemática de enxerto autólogo de nervo com anastomoses epineurais.
No Grupo B (n = 15), o defeito nervoso foi reparado com uma ponte de enxerto de veia jugular externa autóloga do rato Wistar. Procedeu-se, também, à excisão de 7 mm de nervo com a preservação do plexo epineural, e realizou-se a anastomose epineural com pontos separados de Nylon 10/0, com a introdução prévia de cerca de 2 mm dos topos do nervo dentro da veia, considerando-se, assim, a veia como o conduto orientador da regeneração nervosa (Figura 6.6).
102 Figura 6.6 - Exemplo de enxerto de veia jugular externa autóloga do rato Wistar: A - Excisão de 7 mm de nervo com preservação do plexo epineural (ampliação 16 x); B - Mostra o conduto de veia para realizar o
enxerto (ampliação 16 x); C - Anastomose da veia ao nervo para preenchimento do defeito criado (ampliação 16 x); D - pormenor da anastomose epineural com introdução, cerca de 2 mm, do topo (1) do
nervo dentro da veia (ampliação 25 x).
No Grupo C (n = 15) o defeito nervoso foi reconstruído com um tubo de membrana amniótica humana imunoinerte. Procedeu-se, também, à excisão de 7 mm de nervo com a preservação do plexo epineural, e realizou-se, do mesmo modo, a anastomose epineural com pontos separados de Nylon 10/0 e com a introdução prévia de 2 mm dos topos de secção do nervo dentro do conduto de MAH, tornando este conduto também orientador da regeneração nervosa (Figura 6.7).
B
A
103 Figura 6.7 - Exemplo de reconstrução com conduto de membrana amniótica humana. A - excisão de 7 mm de nervo mantendo o plexo epineural integro (ampliação 25 x); B - conduto de MAH interposto entre
os topos do nervo (ampliação 25 x); C - pormenor que mostra a presença de cerca de 2 mm de nervo (chavetas) dentro do conduto de MAH e anastomose epineural (ampliação 40 x).
Os animais foram todos operados com o uso de um microscópio cirúrgico estériotaxico binocular (Leica M 651) e com material cirúrgico específico para microcirurgia. Os ratos foram inspeccionados diariamente em relação a sinais de infecção, níveis de actividade do animal, limpeza e sinais de auto-mutilação.34 O peso dos ratos foi avaliado semanalmente.