Foram realizadas imunofenotipagens das células mononucleares do sangue periférico (CMSP) dos cães experimentalmente infectados no momento antes da infecção, 45 dias e 90 dias após inoculação, utilizando marcadores de superfície celular para as subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+) em células CMSP submetidas à cultura.
Para a obtenção das CMSP foram colhidos 15mL de sangue estéril, adicionado 10mL de RPMI acrescido de 100µL de heparina sódica, sendo, em seguida adicionado
Ficoll Hipaque (1:1). Após centrifugação a 1800rpm por 40 minutos a 4oC, o anel de
células foi retirado e transferido para tubo falcon contendo 15mL de RPMI heparinizado que foi centrifugado a 1500 rpm por 10minutos a 4oC, sendo as células ressuspendidas em 2ml de meio RPMI e contadas em câmara de Neubauer para ajuste da concentração para 107 células por mL.
Após o ajuste da concentração, foi retirado 400µL da suspensão de células e foi adicionado 400µL de solução de CFSE à 5µM (Vybrant® CFDA SE Cell Tracer Kit), e os tubos foram incubados no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação foi acrescentado RPMI (1:1) suplementado com 10% de soro fetal bovino e foi aguardado 5 minutos para bloqueio da reação, com os tubos mantidos no gelo e protegidos da luz. A suspensão celular foi lavada 3 vezes em meio MEM, usando centrifugação a 1300rpm por 5 minutos a 4oC e a seguir as células foram ressuspendidas com 400µL de RPMI.
A avaliação da capacidade proliferativa (índice de estimulação) foi realizada em micro-placas de 96 poços. Em cada poço foi acrescentado 25µl de células ressuspendidas (250.000 células) em 175µl de meio CTCM acrescido de 20% SFB. As células colhidas de cada animal foram colocadas em oito poços, dois poços com células não marcadas com CFSE, dois com células marcadas e não estimuladas, dois com células marcadas e estimuladas com 25µl Concanavalina-A (80µg/ml) e dois com células marcadas e estimuladas com 25µl de antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml).
A leitura das amostras foi realizada no citômetro de fluxo modelo FACSCallibur
(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.), através do
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para tubo falcon 2054 e os poços da placa foram lavados com 200µL de PBS gelado, para total transferência das células. Posteriormente foi adicionado 100µl de solução de EDTA (20mM), e foi incubado por 10 minutos (temperatura ambiente). A seguir foram adicionados 3 mL de PBS-W, e após homogeneização em vórtex os tubos foram centrifugados a 1600rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi vertido, os tubos foram secos suavemente e o pellet foi dividido em dois tubos para marcação com 5µl dos anticorpos monoclonais Rat Anti Dog CD8:Alexa Fluor® 647 e Rat Anti Dog CD4:Alexa
Fluor® 647 que foram adicionados diretamente ao pellet. Posteriormente os tubos foram
incubados por 30 minutos ao abrigo da luz, adicionado 2 mL de PBS-W e homogeneizado em vórtex, para seguir serem centrifugados a 1600rpm por 10 minutos. Posteriormente o sobrenadante foi descartado, adicionado 150µL de solução de fixação MFF e realizada a leitura de 20000 eventos no citômetro de fluxo.
A avaliação do índice apoptótico das células mononucleares do sangue periférico foi realizada utilizando o Kit ApoTarget™ Annexin-V FITC Apoptosis, da Invitrogen. A anexina V, disponibilizada neste kit, detecta células apoptóticas em decorrência de sua ligação preferencial a fosfolipídeos negativamente carregados, principalmente a fosfatidilserina exposta no início do processo apoptótico. As células foram incubadas em micro-placas de 48 poços. Em cada poço foram acrescentados 50µl de células ressuspendidas (500.000 células) em meio CTCM acrescido de 20% de SFB. As células de cada cão foram colocadas em três poços, um de células puras, um de células estimuladas com antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml), e um poço suplementado com o tóxico Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) na concentração de 25nM, para ser usado como controle positivo de apoptose.
A leitura no citômetro de fluxo foi realizada após 48 horas de cultivo. As células foram colhidas e transferidas para tubo falcon 2054, sendo os poços lavados com 1000µL de PBS pH 7,2 gelado. Posteriormente os tubos foram submetidos a uma centrifugação a 1200rpm por 7 minutos a 18oC, em seguida vertidos e secos suavemente em papel toalha, sendo o pellet dividido em dois tubos para adição de 5µl do anticorpo monoclonal Rat Anti Dog CD8:Alexa Fluor® 647 em um deles e Rat Anti Dog
CD4:Alexa Fluor® 647 no outro. Os tubos ficaram incubados por 30 minutos e em
seguida foi adicionado 2,0 mL de PBS pH 7,2 gelado e os tubos submetidos a nova centrifugação a 1200rpm por 7 minutos. Em seguida o sobrenadante foi vertido e foi
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adicionado 50µL Anexin binding buffer (fornecido no kit), 2µL de anexina e 4µL de iodeto de propídio diretamente ao pellet de cada tubo, que ficou incubado por 15 minutos ao abrigo da luz e em temperatura ambiente. Após este período, foi adicionado 250µL de
Anexin binding buffer e os tubos foram lidos em no máximo 1 hora no citômetro de
fluxo.
A aquisição e a subseqüente análise dos dados foram realizadas utilizando o programa específico FlowJo, A figura 1 ilustra a estratégia empregada para as análises por citometria de fluxo. Primeiramente, gráficos de distribuição pontual foram construídos pela combinação dos parâmetros de tamanho e complexidade celular (FSC x SSC) e a população de interesse, que se constituiu de linfócitos, foi selecionada dentro da região R (figura 1A e 1C).
Em seguida, os eventos selecionados nesta região foram representados em gráficos de distribuição pontual construídos com combinações de diferentes fluorescências (FL), por exemplo, FL1/CFSE versus FL4/Anti-CD4:Alexa Fluor® 647. Esses gráficos foram então, divididos em quatro quadrantes (Q1 a Q4) e as freqüências dos eventos observados em cada quadrante foram determinadas pelo programa FlowJo.
Nas análises dos dados dos experimentos de proliferação celular, a reatividade da população total de CMSP, ou seja, a freqüência das células que incorporaram CFSE, foi calculada pela soma dos quadrantes Q1 e Q3 (figura 1B), já que as células que apresentam menores fluorescências são as células proliferadas, tendo em vista que a cada geração celular metade do CFSE permanece em cada célula-filha. Em seguida, a reatividade foi determinada utilizando a seguinte abordagem: o percentual de linfócitos reativos nas populações específicas das células estimuladas com o antígeno de T.cruzi foi dividido pelo percentual de linfócitos reativos nas populações específicas das células não estimuladas, portanto, dividindo o Q1 do estimulado pelo Q1 do não estimulado.
Para análise da apoptose de linfócitos T CD4+ e T CD8+, foi construído um gráfico FL1:Anexina-V versus FL4:CD4 Alexafluor 647 ou FL1:Anexina-V versus FL4:CD8 Alexafluor 647, onde foi possível identificar em Q5 os linfócitos T CD4+ (ou T CD8+) que não estavam em apoptose e em Q6 os marcados pela anexina-V e portanto apoptóticos. (figura 1D)
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Figura 1 - Passos realizados para a análise dos dados por citometria de fluxo. A) e C)
Distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade celular (SSC) demonstrando a população de linfócitos contida na região R; B) Distribuição pontual de FL1/CFSE versus FL4/Anti-CD4:Alexa Fluor® 647, demonstrando diferentes populações celulares contidas nos quatro quadrantes: Q1: linfócitos T CD4+ proliferado, Q2: linfócito T CD4+ não proliferado, Q3:
outras populações linfocitárias proliferadas e Q4: outras populações linfocitárias não proliferadas e D) Distribuição pontual de FL1:Anexina V versus FL4:Anti-CD4:Alexa Fluor® 647.
A cultura de CMSP para a dosagem de citocinas (IFN-γ, IL-10 e TNF-α,) foi realizada em placas de 48 poços. Para cada cão dois poços foram estimulados com antígeno de T. cruzi (4x107 tripomastigotas/ml) e dois poços permaneceram sem estímulo. Em cada poço foi acrescentado 50µl das células a 107 células/mL (500.000 células) ressuspendidas em meio CTCM suplementado com 20% de SFB. O
A
D
C
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sobrenadante foi coletado após 24 e 72 horas de cultivo e congelado a -80oC até a realização do teste de dosagem de citocinas.