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O modelo seguinte de biocátodos em papel foi desenvolvido baseado nas experiências prévias já realizadas com a imobilização da BOx por adsorção. Como mostrado anteriormente, o procedimento de adicionar um material eletródico hidrofilizado, por imersão, em uma solução contendo as enzimas, e deixado por tempo suficiente para que estas enzimas se adsorvessem de forma favorável sobre a superfície eletródica, se mostrou bastante eficiente para a preparação dos primeiros biocátodos contendo BOx.

De forma a promover a imobilização das enzimas BOx por adsorção, o suporte de papel de carbono Toray foi cortado no tamanho e escala apresentados anteriormente, na Figura 82. 100 mg de XC35 foram adicionados sobre a região da cabeça do suporte e o material foi prensado a 1000 psi, de forma a formar o filme de carbono, onde serão adsorvidas as enzimas., assim como esquematizado na Figura 74. O filme de XC35 formado foi tratado por 100 µL de álcool isopropílico, seguido de secagem ao ambiente sobre um papel de secagem por 1 hora. Depois deste processo de hidrofilização, este material foi adicionado por imersão a uma solução de 3 mL contendo 15 mg de BOx, sendo deixado em contato por 12 horas sobre refrigeração, de forma a permitir que as enzimas se adsorvessem sobre a superfície do material hidrofilizado. O esquema dos biocátodos em papel preparados por adsorção é apresentado na Figura 76.

117 Figura 76: Esquema dos biocátodos em papel XC35.

Os resultados em triplicata das curvas de polarização realizadas para os biocátodos na configuração denominada “XC53” são apresentados na Figura 77.

Figura 77: Curvas de polarização em triplicata para o biocátodo em papel XC35. Experimentos realizados em solução de tampão fosfato de sódio pH 7.0.

Da mesma forma que o biocátodo em papel na configuação XC35/HBL, esta nova configuração apresentou grande reprodutibilidade com os resultados, como pode ser observado pelo tamanho das barras de erro, resultado da triplicata dos experimentos.

0 100 200 300 400 500 600 0 -30 -60 -90 -120 -150 -180 -210 XC35 J / A cm-2 E / m V vs Ag /Ag Cl /Cl - (s a t)

118 Resultados de densidade de corrente na ordem de 201 ± 11 µA cm-2 a 0 mV vs Ag/AgCl/Cl- (sat). A densidade de corrrente foi consideravelmente maior, mesmo quando utilizada a mesma quantidade de enzima. Isso se deve, como discutido anteriormente, ao processo de adsorção enzimática, que permite com que as enzimas BOx se adsorvam de forma ideal sobre a superfície eletródica. Isso não acontece durante a preparação da HBL, situação a qual se tem simplesmente a mistura das enzimas com o carbono Vulcan e a adição ao suporte pela pressão mecânica. A região hidrofílica não fica bem definida para esta configuração, sendo esta a interface de contato entre as enzimas adsorvidas no carbono e o filme de solução fluindo pela bomba estática. A simples mistura das enzimas com o pó de carbono pode estar levando a uma situação onde a camada biocatalítica está encharcada com a solução eletrólito, prejudicando o transporte de massa e a difusividade do oxigênio, tal como no caso dos bioeletrodos na configuração XC35/HBL. Este efeito não se manifesta quando utilizado o método de a simples adsorção das enzimas sobre o suporte eletródico.

Considerando o desenvolvimento destes biocátodos em papel em um estágio consideravelmente bom, foram realizados experimentos de estabilidade temporal em termos de potencial de circuito aberto e de corrente gerada por este biocátodo. Os resultados destes experimentos são apresentados nas Figuras 78 e 79.

Figura 78: Experimento de estabilidade temporal do potencial de circuito aberto para o biocátodo em papel XC35. Experimentos realizados em solução de tampão fosfato de sódio pH 7.0. 0 120 240 360 480 600 300 350 400 450 500 550 O CP / m V vs Ag /Ag Cl /Cl - (s a t) Tempo / min Estabilidade OCP - XC35

119 É possível observar pela Figura 78 que o potencial de circuito aberto obtido para o biocátodo em papel na configuração XC35 leva certo tempo para atingir uma situação de estabilidade no valor de 510 mV vs Ag/AgCl/Cl-(sat), potencial de redução do átomo de cobre T1, presente no sítio ativo da BOx, em comparação com o desenho de biocátodo em solução, onde este valor era atingido instantaneamente. Isso está relacionado as propriedades químicas do eletrólito resultantes do comportamento do fluxo de solução na bomba estática. As moléculas de água presente no eletrólito apresentam menos interação com a composição química da superfície do papel de filtro em comparação com as moléculas do sal de fosfato, que dão as condições de pH necessárias para o funcionamento das enzimas. Este efeito se assemelha ao efeito cromatográfico, onde há uma resistência para a mobilidade destes sais no papel. O filme fino de solução presente na interface biocátodo-bomba estática leva certo tempo para atingir uma situação onde se têm uma concentração de sais suficiente, de tal forma que o ambiente químico necessário para a atividade destas enzimas, em termos de pH e de força ionica, fica bem estabelecido para a atividade biocatalítica. Além disto, é possível observar que, depois de atingida esta condição de equilíbrio, o potencial de circuito aberto se mantém no mesmo valor de potencial de redução do sítio T1, indicando que as enzimas se mantêm adsorvidas sobre o eletrodo, mesmo sobre o stress causado por esta diferença de concentração de sais.

A Figura 79 apresenta os resultados obtidos para a estabilidade do biocátodo em papel na configuração XC35, em termos de geração de corrente.

Figura 79: Experimento de estabilidade temporal de corrente para o biocátodo em papel XC35. Experimentos realizados em solução de tampão fosfato de sódio pH 7.0.

0 120 240 360 480 600 -1000 -800 -600 -400 -200 I /  A Tempo / min Estabilidade na corrente - XC35

120 Da mesma forma que com o experimento de estabilidade frente ao potencial de circuito aberto, o mesmo é observado com relação a capacidade de geração de corrente. O biocátodo leva certo tempo para atingir uma situação de desempenho estacionário, pelo fato de que a condição ideal, em termos de pH e de força iônica para o funcionamento das enzimas é estabelecida depois de certo tempo do experimento.

Depois de atingida a condição de estabilidade, este biocátodo consegue manter este comportamento por pelo menos o tempo de duração do experimento. Isto indica que o sítio T2/T3, responsável pela ligação da molécula de oxigênio e a resultante redução biocatalisada a água, também se mantém em bom funcionamento durante o tempo do experimento. Os elétrons transportados do eletrodo até o sítio T1, em contato direto com o eletrodo, são também transportadas para o aglomerado T2/T3, terminando com a regeneração deste sítio ativo pela redução do oxigênio molecular. Esta é mais uma prova de que a imobilização das enzimas por adsorção é um processo muito pouco agressivo com a estrutura da BOx, tanto na região externa da enzima, onde se localiza o sítio T1, quanto na região interna da enzima, onde se localiza o aglomerado T2/T3.