A tecnologia de microarranjos de DNA é extremamente utilizada para análises de expressão gênica, pois permite avaliar o perfil de expressão de uma grande quantidade de transcritos simultaneamente, sendo, portanto, um instrumento valioso para análise de expressão de variantes de splicing. No entanto, para melhor avaliação do perfil de expressão de variantes de splicing algumas plataformas específicas são mais apropriadas, como plataformas que cobrem grandes regiões genômicas (tiling microarrays) (FAN et al., 2006; HU et al., 2001), plataformas de éxons (GARDINA et al., 2006) ou ainda plataformas que representem não apenas os éxons, mas também as junções éxon-éxon conhecidas (JOHNSON et al., 2003; RELÓGIO et al., 2005). Estas plataformas permitem uma análise detalhada do padrão de expressão dos diferentes éxons de um gene.
Plataformas de grandes regiões genômicas permitem a identificação de novas variantes de splicing, bem como o perfil de expressão dessas. No entanto, são de extrema complexidade em termos de análises bioinformáticas para a definição das porções exônicas e intrônicas, sendo mais sensíveis na detecção de eventos de uso alternativo do éxon ou retenção de íntrons. Essa abordagem busca identificar grupos de sondas localizadas em regiões genômicas próximas que apresentam expressão similar, porém diferente da
média de expressão de todas as sondas correspondentes ao gene (HU et al., 2001).
As plataformas de microarranjos de DNA que contêm sequências exônicas necessitam de um conhecimento prévio sobre os éxons de interesse. Um estudo desenvolvido pelo nosso grupo selecionou sequências candidatas a éxons mais expressos em tecidos tumorais, identificados por análises bioinformáticas (KIRSCHBAUM-SLAGER et al., 2005), e imobilizou- as em uma plataforma de microarranjos de DNA. Com o intuito de obter identificar variantes de splicing mais expressas em tumores de mama, estas variantes foram interrogadas por amostras de tumor e normais de mama. No total, foram confirmados três genes, MK-STYX, BRRN1 e TRIM37, cujas variantes de splicing apresentaram nível de expressão elevado em amostras de tumores em relação a amostras normais. Adicionalmente, a expressão da variante de splicing que contêm o éxon adicional do gene TRIM37 apresentou associação positiva com a presença de expressão dos receptores hormonais de estrógeno e progesterona, bem como com ausência de mutação no gene
p53, avaliado por imunohistoquímica. Estas associações não foram
observadas quando consideramos o nível de expressão das variantes sem esse éxon (RANGEL, 2008), corroborando com a sugestão de modulação específica da expressão individual das variantes de splicing.
As plataformas de éxons e junções éxon-éxon são baseadas em um cuidadoso desenho de sondas especificas que correspondem a regiões exônicas, intrônicas e a junções éxon-éxon, como mostrado na figura 8. Para comparação do padrão de expressão das variantes entre duas amostras, o cDNA oriundo de tecidos diferentes é marcado com moléculas fluorescentes distintas e hibridadas em uma mesma lâmina contendo as sondas correspondentes aos éxons, íntrons e às junções éxon-éxon. No exemplo da figura 8, está esquematizado o desenho de sondas para detecção da expressão de duas variantes de um gene, que diferem no uso alternativo do éxon 2.
Figura 8: Desenho de sondas para análise de splicing por microarranjos de DNA. A
figura mostra um gene hipotético que apresenta duas variantes de splicing com uso alternativo do éxon 2. Foram desenhadas sondas nas junções éxon-éxon entre o éxon 1 e 2 (j1-2), entre os éxons 2 e 3 (j2-3) e também na junção entre os éxons 1 e 3 (j1-3) que são distintas entre as variantes. Foram também utilizadas sondas éxon- específicas desenhadas nos éxons 1, 2 e 3 (e1, e2 e e3, respectivamente). Como controle de contaminação de RNAm não processado foram desenhadas sondas nos íntrons 1 e 2 (i1 e i2). O RNAm dos diferentes tecidos foram marcados com moléculas fluorescentes de comprimento de onda distintos, Cy3 e Cy5, misturados e hibridados na mesma lâmina. À direita da figura, o resultado da co-hibridação mostra um perfil de expressão tecido-específico entre as variantes. Adaptada de Matlin, Clark e Smith (2005).
A cor azul mostra ausência de detecção de sinal nas regiões correspondentes às sondas intrônicas nas duas amostras de cDNA. Os éxons 1 e 3 presentes nas duas variantes apresentaram nível equivalente de expressão dos respectivos cDNAs provenientes dos 2 tecidos, representado pela cor amarela, no resultado da hibridação. No entanto, o éxon 2 e as junções éxon1/éxon2 e éxon2/éxon3 apresentam maior nível de expressão no tecido normal, indicado pela cor verde no resultado da hibridação. Por outro lado, a junção éxon1/éxon3 apresentou maior expressão no tecido tumoral, representado pela cor vermelha no resultado da hibridação.
Usando uma plataforma com sondas desenhadas nas junções éxon- éxon de 10 mil genes humanos o perfil de variantes de splicing foi avaliado em 52 tecidos e linhagens celulares humanas, revelando eventos de splicing tecido-específicos bem como novos eventos (JOHNSON et al., 2003). Pan e colaboradores (2004) utilizaram uma plataforma contendo sondas não
apenas correspondentes às junções éxon-éxon mas também sondas éxon- específicas para avaliar alterações tecido-específicas no transcriptoma de 10 tecidos de camundongo. Esses dados também sugerem uma modulação diferencial do nível de expressão de variantes de splicing específica nos diferentes tecidos.
Apesar de abordagens de microarranjos de DNA para análise de
splicing alternativo ter gerado grande quantidade de dados em relação ao
perfil de expressão tecido-específico, esses experimentos são restritos a genes com estrutura genômica conhecida e bem definida e focados na análise de eventos de uso de éxons alternativos. Os eventos de splicing do tipo retenção de íntrons e uso de sítios de splice alternativo não foram avaliados. No mais, o uso de sondas nas junções éxon-éxon, dificulta o desenho de sondas com propriedades iguais de conteúdo GC e temperatura de anelamento, podendo influenciar na eficiência de hibridação, gerando resultados enviezados (CUPERLOVIC-CULF et al., 2006). Além disso, estas abordagens exigem análises computacionais complexas que permitam distinguir entre as alterações de expressão variante-específicas e as diferenças de expressão do gene como um todo, uma vez que os sinais de expressão resultam da soma das intensidades de hibridação de diversas variantes.