2.2 Den absolutte reklamasjonsfrist
2.2.4 Virkninger av totalharmonisering
Como mencionado no item 4.4, foram realizados estudos in silico utilizando ancoragem molecular e as ferramentas PASSonline e ChemMapper para o direcionamento para testes in vitro dos triterpenos pentacíclicos Fri-01, Fri-02, Fri-03, Fri-06, Fri-08, Fri-11 e Fri-16 a Fri-20, bem como os compostos Epi-01 e Pra-01 (apresentados na Tabela 4.1, páginas 59) e os extratos etanólicos de folhas, galhos e raízes de Maytenus gonoclada.
118 5.4.1 – Resultados de testes in silico utilizando ferramentas web e ancoragem
molecular
Foram avaliados, utilizando a Ferramenta PASSonline, os compostos Fri-16 a Fri- 20, Epi-01 e Pra-01. Foram selecionados e apresentados na Tabela 5.19, os potenciais efeitos biológicos indicados para o maior número dos compostos isolados nos extratos das folhas, galhos e raízes de M. gonoclada. Os efeitos biológicos indicados por PASSonline para os compostos também isolados de M. gonoclada Fri-01, Fri-02, Fri-03 e Lup-01, estão apresentados nas Tabelas 5.4 e 5.5 (páginas 74 e 75).
A análise dos resultados de Pa-Pi>0,5, obtidos pelo PASSonline, indicou para a maioria dos compostos estudados o potencial efeito antineoplásico, agonista de apoptose, hepatoprotetor, anti-inflamatório e antiviral. Estes resultados apresentam alta correlação com os resultados de Pa-Pi obtidos para os TTPCs Fri-01, Fri-02 e Fri-03 que foram apresentados nas Tabelas 5.4 e 5.5 (página 74 e 75).
Tabela 5.19 – Potenciais efeitos biológicos indicados, pelo PASSonline, para os compostos extraídos de M. gonoclada
Atividades Biológicas - PASSonline Fri-16 Fri-17 Fri-18 Fri-19 Fri-20 Epi-01 Pra-01
Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Antineoplásico 0,85 0,86 0,82 0,88 0,78 0,75 0,70 Agonista de apoptose 0,87 0,81 0,82 0,72 0,87 0,72 0,62 Receptor de androgênio (inibidor da expressão) 0,66 0,77 0,66 0,67 0,84 0,64 0,63 Quimiopreventivo 0,66 0,78 0,71 0,79 0,52 0,83 0,93 Hepatoprotetor 0,83 0,84 0,77 0,82 0,53 0,81 0,79 Protetor Muco membranoso 0,71 0,75 0,71 0,53 0,75 0,93 0,82 Anti-inflamatório 0,82 0,76 0,68 0,68 0,79 0,53 a Antiviral (Influenza) 0,58 0,67 0,58 a 0,64 0,65 0,52 Caspase 3 estimulante 0,55 0,82 0,55 0,75 a 0,77 0,56 Citoprotetor 0,66 0,70 0,66 0,67 a 0,66 0,56 Tratamento distúrbios hepáticos 0,81 0,70 0,76 0,67 a 0,62 0,61 Testosterona 17beta-desidrogenase (NADP +)
inibidor 0,82 0,91 0,82 0,88 0,69 0,52 a Antineoplásico (câncer de mama) 0,61 0,67 0,55 0,67 0,57 0,57 a Antinociceptivo 0,76 0,75 0,76 0,75 0,52 a a Dermatológica 0,80 0,74 0,75 0,70 0,62 a a Imunossupressor 0,68 0,66 0,57 0,68 0,67 a a Antagonista do óxido nítrico sintase a 0,73 0,53 0,71 0,50 0,52 a Tratamento Doenças da próstata 0,69 0,62 0,70 0,65 0,51 a a Fator de transcrição NF kappa B estimulante 0,87 0,87 0,87 0,85 0,76 a a Estimulante fator de Transcrição 0,87 0,87 0,87 0,85 0,76 a a Anti-eczemático 0,80 0,81 0,80 0,78 0,57 --- --- Anti-metastático 0,53 0,56 0,53 0,54 a a a Antineoplásico (câncer de pulmão) 0,73 0,70 0,62 0,65 a a a Caspase 8 estimulante 0,61 0,74 0,61 0,70 a a a Tratamento da demência 0,53 0,61 0,53 0,57 a a a Membrana inibidor permeabilidade a 0,67 a 0,66 a 0,80 0,66 Tratamento distúrbios da menopausa 0,52 0,60 0,56 0,63 a a a
119
Atividades Biológicas - PASSonline Fri-16 Fri-17 Fri-18 Fri-19 Fri-20 Epi-01 Pra-01
Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Pa-Pi Vasoprotector a 0,50 0,50 0,50 a 0,53 a anti-psoriático 0,68 0,63 0,60 0,57 a a --- insulino promotor 0,57 0,63 0,57 0,50 --- --- --- Antiulcerativo 0,54 0,51 a a a 0,62 a Antineoplásico (câncer da tireóide) 0,56 a 0,51 a a a a Inibidor da expressão JAK2 a 0,53 a a a 0,77 0,69 Tratamento de doenças proliferativas a 0,51 a 0,54 a 0,71 0,80 Antineoplásico (melanoma) 0,54 a a a 0,54 a --- Regulador do metabolismo lipídico 0,54 a 0,52 a a a --- Antiacne 0,57 0,51 0,56 a a --- --- Antileucêmico 0,55 a a a 0,57 a a Analéptico cardiovascular a a 0,61 0,50 a a --- Prostático (benigno) tratamento da hiperplasia 0,56 a 0,56 a a --- --- Anti-carcinogênico a a a a a 0,81 0,87 Anti-hipercolesterolémico a a a 0,50 a 0,60 a Anti-oxidante a a a a a 0,79 0,80 NOS2 inibidor expressão a a a a a 0,67 0,63 TNF inibidor expressão a 0,56 a a a 0,50 a Anti-hemorrágico --- a --- a a 0,898 0,818 Anti-mutagênico --- --- --- --- --- 0,948 0,884 Cardioprotector --- --- --- --- --- 0,664 0,512 Quimio-protetor --- --- --- --- --- 0,643 0,582 Eliminador de radicais livres --- --- --- --- --- 0,899 0,95
Pa-Pi > 0,5 65 107 67 99 37 103 68
[---] - representa ausência de resultado para a atividade biológica estudada. [ a ] – representa resultados de Pa-Pi < 0,5 (critério de seleção)
[Pa] - probabilidade de ser ativo [calculado por PASSonline (Filimonov, 2008)] [Pi] - probabilidade de ser inativo [calculado por PASSonline (Filimonov, 2008)]
Os resultados obtidos por PASSonline (Tabela 5.19) foram analisados e indicaram potencial efeito antiviral para influenza para os compostos Fri-16, Fri-17, Fri-18, Fri-20, Epi-01 e Pra-01. O mesmo efeito antiviral foi indicado para os compostos Fri-01, Fri-02 e Fri-03 (Tabela 5.4, página 74). Não houve indicação da potencial atividade antiviral frente à poliovírus pela ferramenta PASSonline. Os potenciais efeitos anti-inflamatório e agonista de apoptose, indicados pelo PASSonline, podem estar relacionados ao estímulo do fator transcripcional NF- Kappa B.
Foi utilizada a ferramenta ChemMapper para identificar potenciais alvos biológicos dos compostos isolados de M. gonoclada (Tabela 5.20, pág. 120). A análise dos dados obtidos pelo ChemMapper indicou potenciais alvos relacionados à indução de apoptose como Proto- oncogênese serina/treonina-proteíno quinase (Bachmann, 2005), Glutationa S-transferase (Yabuno, 1998), receptor de androgênio (Li, 2008), fosfolipase A2 citoplasmatica (Adam- Klages, 1998), receptor de ácido retinóico RXR-alfa (Liu, 1998) e receptor de estrogênio (Lewis-Wambi, 2009), para alguns dos compostos Fri-16 a Fri-20, Epi-01 e Pra-01 (Tabela 5.20) e para Fri-01 a Fri-03 (Tabelas
5.7 e 5.8, página 78 a 84)
. Também foram observadas120 nas análises as indicações de potencial atividade inibitória frente a DNA topoisomerase II, Transcription factor NF kappa B inhibitor e DNA polymerase I, DNA polimerase, HIV-1 integrase, HIV-protease e HIV-1 transcriptase reversa, Adenosina Desaminase, Glutationa S- transferase que são alvos validados para a pesquisa de novas substâncias com atividade antiviral (Tabelas 5.19 e 5.20).
Tabela 5.20 – Potenciais alvos biológicos indicados, pelo ChemMapper, para os compostos extraídos de M. gonoclada
Alvo biológico - ChemMapper Efeito relacionado Fri-16 Fri-17 Fri-18 Fri-19 Fri-20 Epi-01 Pra-01 I.S. I.S. I.S. I.S. I.S. I.S. I.S.
HIV-1 Integrase Antiviral 0,61 0,66 0,63 0,67 0,69 0,81 0,64 Receptor de androgênio Antitumoral 0,65 0,62 0,65 0,65 0,67 0,65 --- Citocromo P450 3A4 antifúngico 0,69 0,65 0,67 0,66 0,64 0,75 --- Estradiol 17-beta-1-desidrogenase Antitumoral 0,63 0,61 0,61 0,61 0,64 0,76 --- 3-oxo-5-beta-4-esteróide
desidrogenase Antitumoral 0,69 0,65 0,67 0,66 0,62 --- --- Estradiol 17-beta-1-desidrogenase Antitumoral 0,63 0,63 0,64 0,63 0,65 --- --- Receptor de estrogênio Antitumoral 0,66 0,63 --- 0,64 0,71 0,66 --- Receptor de progesterona Antitumoral 0,69 0,65 0,67 0,66 0,61 --- --- Receptor do ácido retinóico, RXR-
alfa Antitumoral 0,63 0,61 0,62 0,61 0,62 --- --- 3-alfa-Hidroesteróide
desidrogenase Anti-inflamatório 0,64 --- --- 0,63 0,65 --- --- Ciclo-oxigenase-1 Antitumoral --- --- --- --- 0,61 0,69 0,66 DNA-polimerase beta Antiviral --- --- --- --- 0,67 0,74 0,64 Fosfolipase A2 (grupo II) Anti-inflamatório 0,61 0,62 --- --- --- 0,68 --- Fosfolipase A2 (VRV-PL-VIII-a) Anti-inflamatório 0,61 0,62 --- --- --- 0,68 --- Receptor de androgênio (AR) Antitumoral --- --- --- --- 0,62 0,69 --- Araquidonato 5-lipoxigenase Antitumoral --- --- --- --- 0,64 0,78 --- Citocromo P450 19A1 Antitumoral --- --- --- --- 0,67 0,81 --- Anidrase carbônica 2 Antitumoral --- --- --- --- 0,65 0,78 --- A ciclo-oxigenase-1 / ciclo-
oxigenase-2 Antitumoral --- --- --- --- 0,65 0,67 --- Ciclo-oxigenase-2 Antitumoral --- --- --- --- 0,62 0,83 --- Receptor de Estrogênio (ER-alfa) /
(ER-beta) Antitumoral --- --- --- --- 0,64 0,70 --- Óxido Nítrico Sintase, induzida Antitumoral --- --- --- --- 0,63 0,74 --- Fosfolipase A2, principal
isoenzima Anti-inflamatório --- --- --- --- 0,61 0,61 --- 3-oxo-5-alfa-4-esteróide
desidrogenase Antitumoral --- --- --- --- 0,62 --- --- Adenosina Desaminase Antiviral --- --- --- --- --- 0,66 --- Adenosina A2A Anti-inflamatório --- --- --- --- --- 0,72 --- Aldo-ceto redutase de um membro
da família C3 Antitumoral --- --- --- --- 0,67 --- --- Regulador apoptose Bcl-xL Indução de
apoptose --- --- --- --- 0,65 --- --- Factor de crescimento de
fibroblastico receptor 1 (FGFR1) Antitumoral --- --- --- --- --- 0,62 --- Receptor beta-2 adrenérgico Antitumoral --- --- --- --- 0,65 0,71 --- Caspase-3 Indução de
apoptose --- --- --- --- --- 0,69 --- Proteína quinase 2 (divisão celular) Antifúngico e
Antitumoral --- --- --- --- --- 0,65 --- Proteíno quinase 6 (divisão
121
Alvo biológico - ChemMapper Efeito relacionado Fri-16 Fri-17 Fri-18 Fri-19 Fri-20 Epi-01 Pra-01 I.S. I.S. I.S. I.S. I.S. I.S. I.S.
Citocromo P450ERYF Antifúngico --- --- --- --- 0,71 --- --- Dengue tipo 2 do vírus da proteína
NS3 Antiviral --- --- --- --- --- 0,74 --- Dihidrofolato redutase Antitumoral e
Antiprotozoário --- --- --- --- --- 0,68 --- Dihidropteroato sintase Antiprotozoário --- --- --- --- --- 0,61 --- DNA-polimerase subunidade alfa Antiviral --- --- --- --- 0,72 --- --- DNA topoisomerase 1 Antitumoral --- --- --- --- --- 0,80 --- DNA Topoisomerase II Antitumoral --- --- --- --- 0,69 --- --- Glutationa S-transferase Antiviral --- --- --- --- --- 0,77 --- Glutationa S-transferase A2 Antiviral --- --- --- --- 0,66 --- --- Glutationa S-transferase A3 Antiviral --- --- --- --- 0,67 --- --- HIV-1 Protease Antiviral --- --- --- --- --- 0,68 --- HIV-1 transcriptase reversa Antiviral --- --- --- --- --- 0,71 --- Proto-oncogene serina / treonina-
proteína quinase Pim-1 Antitumoral --- --- --- --- --- 0,74 --- Proto-oncogene tirosina cinase de
proteína receptora Ret Antitumoral --- --- --- --- --- 0,64 --- Timidilato sintase Antitumoral e
Antiprotozoário --- --- --- --- --- 0,62 --- Factor Nuclear NF-kappa-B Indução de
apoptose --- --- --- 0,61 0,74 --- --- Tirosino-proteíno-quinase JAK2 Antitumoral --- --- --- --- --- 0,61 --- Estradiol 17-beta-desidrogenase Antitumoral --- --- --- --- --- --- ---
Nº de alvos indicados / composto avaliado 95 66 77 75 239 720 17
[---] - representa a ausência de resultados para a atividade biológica listada.
[I.S.] - índice de similaridade (escala de 0 a 1, onde 1 equivale a 100% similaridade com ligante ativos das bases de dados estudadas)
Obs.: Foram apresentados resultados de índice de similaridade [onde: 1,2 Similarity score (ChemMapper) = 0,6 índice de similaridade].
Os resultados mais promissores obtidos na ancoragem molecular dos 28 TTPCs estudados (14 friedelanos e 14 lupanos) estão apresentados na Tabela 5.21. Os alvos mais promissores, frente a estes triterpenos pentacíclicos estudados, foram adenosina desaminase (ADDEA), citocromo P450 19A1 (CP450), DNA topoisomerase II (DNATOPO2), glutamato desidrogenase (GD), glutationa S-transferase (GST), HIV-1 integrase e HIV-1 protease.
Tabela 5.21 – Triterpenos identificados como promissores na ancoragem molecular dos 29 alvos estudados
Alvo biológico Friedelanos Lupanos
ADDEA Fri-06 Lup-07
CP450 Fri-06 Lup-05 e 09
DNATOPO2 Fri-01, 04, 05 e 11, 12 e 13 Lup-04, 05, 06, 07, 08, 11, 12, 13 e 14
GD Fri-01, 05, 06, 07, 08, 09, 11, 12 e 14 Lup-01, 02, 03, 04, 06, 07, 08, 10, 11, 13 e 14
GST Fri-09, 12 e 13 Lup-11
HIVINTEG Fri-02 e 03 ---
122 Foi realizada também a ancoragem molecular dos compostos Fri-15 a Fri-20, Epi-01 e Pra-01, frente aos alvos 1DX5PR, ADA2R, ADDEA, APN, AR5LP, ARBCL2, ARBCL-XL, B2AR, BRAFOSTIK, CP450, DAAD, DHPS, DHRED, DNAC5M, DNATOPO2, DOM, GD, GST, HIVINTEG, HIVPROTE, HIVRTRANS, PGHS1, PGHS2, RNDR, RPTKERB2, TNF-α e VEGF [Tabela 3.1 (Item 3.2)]. Não foram obtidos resultados de Pa-Pi>0 frente aos alvos ADA2AR, APN, ARBCL2, B2AR, BRAFOSTK, DAAD, DNAC5M, DOM, DHPS, DHRED, GST, HIVPROTE, HIVRTRANS, PGHS1, PGHS2, RNDR e VEGF, para os compostos Fri-15 a Fri-20, Epi-01 e Pra-01. Os resultados de Pa-Pi obtidos para os compostos Fri-15 a Fri-20, Epi-01 e Pra-01 estão apresentados na Figura 5.13.
O composto Fri-15 foi considerado promissor frente aos alvos CP450 e GD. Os compostos Fri-16 e Fri-19 foram considerados promissores frente aos alvos DNATOPO2 e GD. O composto Fri-17 foi considerado promissor frente ao alvo DNATOPO2. O composto Fri-18 foi considerado promissor frente aos alvos GD e HIVINTEG. O composto Fri-20 foi considerado promissor frente aos alvos ARBCL-XL, AR5LP, DNATOPO2 e GD. O composto Epi-01 foi considerado promissor frente aos alvos 1DX5PR, ADDEA, APM2, ARBCL-XL, DNAPOLY, GD, RPTKERB2 e TNF-alfa. O composto Pra-01 não apresentou resultados de Pa- Pi≥0, frente aos alvos estudados. As Tabelas contendo os resultados, os mapas de contato e os diagramas de dispersão dos resultados dos ligantes ativos e inativos estudados estão apresentados no material adicional.
Na Tabela 5.22 (página 123) estão apresentados os resultados mais promissores na ancoragem molecular dos compostos Fri-15 a 20 e Epi-01.
123 Tabela 5.22 – Resultados promissores identificados na ancoragem molecular dos compostos
Fri-15 a Fri-20 e Epi-01
Alvo biológico Resultados de Pa-Pi>0 1DX5PR Epi-01
ADDEA Epi-01
APM2 Epi-01
ARBCL-XL Fri-20 e Epi-01
AR5LP Fri-20 CP450 Fri-15 DNAPOLY Epi-01 DNATOPO2 Fri-16, 17, 19 e 20 GD Fri-15, 16, 18, 19 e 20, Epi-01 HIVINTEG Fri-18 RPTKERB2 Epi-01 TNF-alfa Epi-01
Os alvos Adenosina desaminase (ADDEA), Metionina aminopeptidase 2 (APM2), DNA polimerase (DNAPOLY), DNA topoisomerase II (DNATOPO2) e HIV-1 integrase (HIVINTEG) estão relacionados, na literatura, ao efeito antiviral. A enzima DNA polimerase é considerada um alvo relacionado ao efeito antiviral associado a compostos com propriedades anti-poliovírus (Berdis, 2008). As enzimas DNA topoisomerase II (DNATOPO2), metionina aminopeptidase 2 (APM2), citocromo P450 19A1 (CP450), Araquidonato 5-lipoxigenase (AR5LP), Receptor proteíno tirosino quinase erbB-2 (RPTKERB2) e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-alfa) estão relacionadas às atividades anti-inflamatória e antitumoral (antineoplásica). A inibição do regulador de apoptose BCL-XL é uma importante alternativa para a indução de apoptose celular, pois está relacionada diretamente a permeabilidade na membrana mitocondrial a fatores pró-apoptóticos. Os alvos glutamato desidrogenase e 1-desoxi-D-xilulose-5-fofato reductoisomerase estão relacionados ao efeito antiprotozoário.
Foi observada alta correlação entre os resultados obtidos na ancoragem molecular, com os alvos indicados pela ferramenta ChemMapper.
A alta probabilidade de serem ativos (Pa) observada para grande parte dos compostos isolados de M. gonoclada foi investigada através dos ensaios in vitro do efeito antiviral (poliovírus), citotóxico e indutor de apoptose.
O composto Fri-15 apresentou promissor efeito inibidor de glutamato desidrogenase que está diretamente associada à atividade antiprotozoário. Também foram obtidas indicações de potencial efeito inibidor desta enzima para os compostos Fri-06, Fri-08 e Fri-1, preparados no laboratório (Neplam) por Oliveira em 2007. As indicações de potencial efeito antiprotozoário
124 também foi observada nos resultados obtidos pela ferramenta PASSonline (Tabela 5.6, página 76). Foram avaliados a concentração inibitória in vitro de formas extracelulares de Leishmania amazonensis para avaliar o potencial efeito antiprotozoário dos derivados friedelanos e a acertividade das ferramentas utilizadas no direcionamento para testes frente ao parasita.