O método desenvolvido mostrou-se eficiente para a análise quantitativa de três compostos bioativos produzidos por A. niger (BRF074) em três meios de cultivo: malte peptona dextrose (MPD), batata dextrose levedura (BDL) e manitol peptona levedura (MntPL).
Estas análises foram realizadas após a inoculação de A. niger nos meios de cultivo MPD, BDL e MntPL. Para avaliar a produção cinética dos compostos, foram analisados diferentes períodos de incubação (7, 14, 21 e 28 dias). Os teores dos três compostos citotóxicos encontrados nos extratos brutos, MPD, BDL e MntPL, estão apresentados nas Tabelas 26, 27 e 28 (p. 156 e 157).
Tabela 26 - Teores (µg.mL-1) dos compostos bioativos BRF074 (9), (10) e (11) encontrados nos extratos MPD,
BDL e MntPL produzidos por A. niger (BRF074). Concentração dos extratos = 2000 µg.mL-1
Extratos MPD Tempo de crescimento
(dias)
Derivado éster furânico BRF074 (11) (Rt = 13,7 min) Malformina A BRF074 (9) (Rt = 21,4 min) Malformina C BRF074 (10) (Rt = 22,1 min) 07 14,7 37,5 60,1 14 17,0 26,5 34,9 21 92,3 46,2 67,5 28 274,0 86,3 125,9
Tabela 27 - Teores (µg.mL-1) dos compostos bioativos BRF074 (9), (10) e (11) encontrados nos extratos BDL
produzidos por A. niger (BRF074). Concentração dos extratos = 2000 µg.mL-1 .
Extratos BDL Tempo de crescimento
(dias)
Derivado éster furânico BRF074 (11) (Rt = 13,7 min) Malformina A BRF074 (9) (Rt = 21,4 min) Malformina C BRF074 (10) (Rt = 22,1 min) 07 13,8 37,4 50,1 14 24,8 112,7 166,7 21 44,4 179,0 233,8 28 74,3 163,1 235,4
Fonte: Elaborada pelo autor
Tabela 28 - Teores (µg.mL-1) dos compostos bioativos BRF074 (9), (10) e (11) encontrados nos extratos MntPL
produzidos por A. niger (BRF074). Concentração dos extratos = 2000 µg.mL-1
Extratos MntPL Tempo de crescimento
(dias)
Derivado éster furânico BRF074 (11) (Rt = 13,7 min) Malformina A BRF074 (9) (Rt = 21,4 min) Malformina C BRF074 (10) (Rt = 22,1 min) 07 - - - 14 - - - 21 - - - 28 - - -
Fonte: Elaborada pelo autor
O método de validação foi desenvolvido visando a análise simultânea dos três compostos bioativos. O tempo de retenção foi de 13,7 min para o BRF074 (11) e 21,4 min e 22,1 min para BRF074 (9) e BRF074 (10), respectivamente. Embora a análise tenha mostrado um tempo relativamente longo (30 min), os metabólitos secundários puderam ser analisados com boa separação e resolução de linha de base entre todos os picos (FIGURA 95, p. 158).
Figura 95 - Cromatogramas HPLC dos compostos puros BRF074 (9), (10) e (11) (Figura 95A) e extratos obtidos a partir do cultivo durante 28 dias de A. niger (BRF074) em meio MPD (Figura 95B), meio BDL (Figura 95C) e meio MntPL (Figura 95D)
A análise cromatográfica dos extratos orgânicos (MPD, BDL e MntPL) revelou um perfil cromatográfico semelhante em CLAE para os extratos MPD e BDL, e indicou que os compostos bioativos analisados foram produzidos por A. niger em ambos os meios de cultura. Não foram encontradas quantidades significativas desses compostos no extrato proveniente do cultivo em MntPL.
O maior teor (β74,0 g.mL-1) de BRF074 (11) foi encontrado quando se utilizou
MPD como meio de cultura, durante um período de crescimento de 28 dias. Nesta mesma condição, o teor de BRF074 (λ) e BRF074 (10) foi de 86,γ g.mL-1 e 1β5,λ g.mL-1,
respectivamente. Por outro lado, a melhor condição para a produção de BRF074 (9) e BRF074 (10) foi alcançada quando se utilizou BDL como meio de cultura, com 21 e 28 dias de crescimento. Em 21 dias de crescimento, as concentrações de BRF074 (9) e BRF074 (10) foram 17λ,0 e βγγ,8 g.mL-1, respectivamente, enquanto a concentração de BRF074 (11) foi
de 44,4 g.mL-1. Com 28 dias de fermentação, também no meio BDL, a concentração de
BRF074 (9) e BRF074 (10) não foi alterada consideravelmente quando comparado com 21 dias de crescimento, e seus respectivos teores foram 16γ,1 e βγ5,4 g.mL-1. No entanto, a
concentração de BRF074 (11) aumentou quase duas vezes (74,γ g.mL-1) quando comparados
os períodos de 28 e 21 dias de fermentação.
O método cromatográfico desenvolvido provou ser eficiente nas análises quantitativas dos compostos citotóxicos BRF074 (9), BRF074 (10) e BRF074 (11) nos extratos de A. niger cultivados sob diferentes condições, como confirmado pelos seus parâmetros analíticos validados no sistema CLAE-DAD. Considerando estes aspectos, o método analítico de quantificação revelou-se uma ferramenta útil e importante para monitorar a produção dos compostos citotóxicos analisados por A. niger.
6 EPIGENÉTICA
Os estudos epigenéticos foram realizados no Natural Products Center (NPC) da Universidade do Arizona, sob orientação do professor Leslie Gunatilaka durante o período de setembro de 2013 a agosto de 2014 através do programa de doutorado sanduíche no exterior PDSE/ CAPES.
Na fase inicial do trabalho um screening utilizando 30 cepas de fungos foi realizado em pequena escala, através do cultivo em dois meios de cultura: BD (batata e dextrose) e YM (levedura e malte - yeast malt) com e sem adição de SAHA (ácido hidroxâmico suberoilanilida) na concentração de 500 µM, a fim de verificar quais cepas apresentaram modificações em seu perfil metabólico através da adição do modificador epigenético.
Após 14 dias de crescimento, os extratos obtidos foram submetidos a análise em CLAE em modo analítico. Nessa análise as amostras foram injetadas na concentração de 4 mg/mL em fluxo de 0,8 mL/min usando H2O/CH3CN em gradiente começando com 15 %
de CH3CN e indo a 100% de CH3CN em 35 minutos.
Dentre os fungos avaliados apenas, a cepa LG0949 quando cultivada em BD mostrou diferenças em seu perfil após a análise em CLAE (FIGURAS 96 e 97, p. 160). Figura 96 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD sem adição de SAHA.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 97 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 500 µM.
Após a triagem inicial de seleção do fungo e meio de cultivo a ser trabalhado, um novo cultivo em pequena escala foi feito utilizando-se SAHA em diferentes concentrações, visando saber qual a menor concentração do reagente SAHA que poderia levar a resultados satisfatórios. Para isso o fungo foi cultivado em meio de cultura BD utilizando SAHA nas concentrações de 100, 200, 300, 400 e 500 µM. De maneira análoga a triagem inicial, após 14 dias, o crescimento foi interrompido e os extratos obtidos submetidos analise por CLAE utilizando as mesmas condições das análises anteriores (FIGURAS 98 a 102, p. 161 e 162). Figura 98 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 100 µM
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 99 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 200 µM.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 100 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 300 µM.
Figura 101 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 400 µM.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 102 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 500 µM.
Fonte: Elaborada pelo autor
Após a análise dos cromatogramas obtidos, observou-se que a concentração de 200 µM do reagente SAHA mostrou resultados idênticos aos experimentos obtidos em concentrações mais elevadas. Desta forma, deu-se continuidade ao estudo do fungo realizando um cultivo em grande escala, utilizando 5L de meio BD e SAHA nesta concentração. Um experimento controle, onde o fungo foi cultivado somente em 1L de meio BD sem adição de SAHA também foi realizado de forma paralela.
Após 14 dias de crescimento, obteve-se 735 mg de extrato do cultivo em SAHA, denominado LG0949-SAHA; e 32,0 mg do extrato proveniente do experimento controle, LG0949-controle.
Ambos os extratos foram analisados por CLAE utilizando o método H2O:MeOH
em gradiente começando de 20% de MeOH e indo a 100% de MeOH em 40 minutos (FIGURAS 103 e 104, p. 163).
Figura 103 - Cromatograma do cultivo de LG0949 em meio de cultura BD sem adição de SAHA - controle grande escala.
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 104 - Cromatograma do cultivo em grande escala de LG0949 em meio de cultura BD com adição de SAHA na concentração de 200 µM.
Fonte: Elaborada pelo autor
O extrato LG0949-SAHA foi submetido a tratamento cromatográfico utilizado cromatografia em coluna aberta com gel de sephadex LH-20 e sílica de fase reversa (ITEM 7.10.6, p. 188).
Cinco das frações obtidas, LG0949-SAHA-A2 a A5, mostraram substâncias presentes apenas no cultivo com SAHA e foram selecionadas para isolamento de seus constituintes químicos.
Após cromatografia em gel de sílica e purificação em CLAE, a partir das frações LG0949-SAHA-Aβ e A4, foi possível isolar as lactonas α, -insaturadas: phomalactona (LG0949-1) (WU et al., 2012), dihidrophomalactona (LG0949-2) e acetophomalactona (LG0949-3) (KOMAI et al., 2003). Os espectros de RMN 1H desses compostos são mostrados
Figura 105 - Espectros de RMN 1H de LG0949 (1) e LG0949 (2) (400 MHz, CDCl 3)
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 106 - Espectros de RMN 1H de LG0949 (1) e LG0949 (3) (400 MHz, CDCl 3)
Fonte: Elaborada pelo autor
As frações LG0949-SAHA-A3 e A5 após purificação em CLAE possibilitaram o isolamento de dois derivados do SAHA, oriundos possivelmente da biotransformação enzimática do modificador epigenético causada pelo próprio fungo LG0949. Esses compostos foram denominados LG0949 (4) e LG0949 (5) e seus espectros de RMN 1H encontram nas
figuras 107 e 108 (p. 165).
LG0949 (2)
LG0949 (1)
LG0949 (3)
Figura 107 - Espectros de RMN 1H de LG0949 (4) (400 MHz, DMSO-d 6)
Fonte: Elaborada pelo autor
Figura 108 - Espectros de RMN 1H de LG0949 (5) e SAHA em (400 MHz, CD3OD)
Fonte: Elaborada pelo autor
Ainda na fração LG0949-SAHA-A3, foi detectada a presença de uma outra lactona α, -insaturada através da análise do espectro de RMN 1H (FIGURA 109, p. 166). No
entanto, devido à instabilidade do composto, em todas as tentativas de isolamento não foi possível se obter o composto puro e posterior caracterização química do mesmo.
LG0949 (4)
Figura 109 - Espectro de RMN 1H da fração LG0949-SAHA-A3 (400 MHz, CDCl 3)
Fonte: Elaborada pelo autor
A fim de identificar cada um dos compostos isolados no cromatograma referente ao extrato bruto LG0949-SAHA, todos os compostos isolados foram analisados em CLAE nas mesmas condições de análise dos extratos brutos: H2O:MeOH em gradiente começando
de 20% de MeOH e indo a 100% de MeOH em 40 minutos.
A comparação entre os cromatogramas obtidos para os experimentos LG0949-controle e LG0949-SAHA possibilitou verificar que os compostos isolados se encontram presentes apenas no extrato em que ocorreu a adição do modificador epigenético na fermentação (FIGURA 110, p. 167).
O O
Figura 110 - Cromatograma dos extratos LG0949-SAHA e LG0949-controle
Fonte: Elaborada pelo autor
A adição de SAHA ao meio de cultivo aumentou significativamente a produção de metabólitos secundários da cepa LG0949, induzindo a produção de lactonas α, - insaturadas, bem como a obtenção de derivados oriundos de biotransformações enzimáticas do SAHA.
Essa estratégia se revelou efetiva para diversificar os metabólitos secundários produzidos por fungos, mostrando a importância do uso de modificadores epigenéticos na ativação de rotas biossintéticas, que permaneceriam silenciadas sob condições normais de cultivo. LG0949 (2) LG0949 (1) LG0949 (4) LG0949 (3) LG0949 (5) LG0949-controle LG0949-SAHA